腸道微生物DNA提取

1、土壤微生物中提取總dna實(shí)驗(yàn)概要從土壤微生物中提取總dna并純化，高質(zhì)址的dna可用于后續(xù)文庫(kù)構(gòu)建。主要試劑tenp 緩沖液(50 mmol/ltris, 20 mmol/l edta, 100 mmol/l naci, 1% pvp, ph 10.0)pbs 緩沖液(137 mmol/l naclz 2.7 mmol/l kci, 10 mmol/l na2hpo4/ 2 mmol/l kh2po4/ ph 7.4)dna 提取緩w1 液(100 mmol/l tris, 100 mmol/l edta, 100 mmol/l na3po4/ 1.5 m naci, 1%ctab, ph 8

2、.0) 蛋白酚 k(25 mg/ml) 溶菌酶(50 mg/ml, ph 8. 0)20% sds氯仿異戊醇異丙醇70%乙醇rnase 20 mg/mlqiaxii大片段凝膠回收試劑盒(qiagen)主要設(shè)備50ml、1.5 ml 離心管搖床高速離心機(jī)水浴鍋電泳槽電泳儀渦旋儀實(shí)驗(yàn)材料土壤樣品實(shí)驗(yàn)步驟1. 總dna提?。?1) 収2g 土樣，置于50ml滅菌的離心管中；(2) 加入 10 ml tenp 緩沖液(50 mmol/l tris, 20 mmol/l edta, 100 mmol/l naci, 1% pvp, ph 10.0)懸浮 土樣，200轉(zhuǎn)搖床振蕩lornin充分混勻；(3)

3、 10 000 r/min離心5 min,棄上淸，重復(fù)洗滌多次至上淸基木為無(wú)色；(4) 用 5 ml pbs 緩沖液(137 mmol/l naci, 2.7 mmol/l kci, 10 mmol/l na2hpo4/ 2 mmol/l kh2po4/ ph7.4)漂洗一次；(5) 沉淀加入 13.5 ml dna 提取緩沖液(100 mmol/l tris, 100 mmol/l edta, 100 mmol/l na3po4/1.5 m naq 1%ctab, ph 8.0),混勻后加入 100 pl 蛋白酶 k(25 mg/ml)和 200 yl溶菌酶(50 mg/ml, ph 8.

4、0),37°c 水浴30 min,每隔10 min顛倒混勻;(6) 加入2 ml20%sds, 65°c水浴2h,每隔20 min顛倒混勻;(7) 8 000 r/min室溫離心15 min,取上清，用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次;(8) 水相屮加入0.6倍體積的異內(nèi)醇，4°c沉淀過(guò)夜；(9) 11 000 r/min 4°c離心 20 min 收集 dna 沉淀；(10) 70%乙醇漂洗兩次,干燥后用100 |1l ddh2o(含rnase 20 mg/ml)溶解,轉(zhuǎn)入1.5 ml離心管。2. 總dna純化：(1) 配制0.8%瓊脂糖凝膠；(

5、2) 每個(gè)上樣孔加入50 |1l粗dna,進(jìn)行低電壓長(zhǎng)時(shí)間電泳(4°c, 25 v, 8 h)；(3) 電泳結(jié)束后，切下主帶所在的凝膠(膠的體積盡對(duì)能小)；qiaxii大片段凝膠回收試劑盒(qiagen)回收:加入3倍體積的buffer qx i及適量的qi ax ii (glassmilk),55°ciu浴10 min,每隔2 min輕輕用手指彈起沉淀(回收人片段時(shí)不要渦旋)，待凝膠完全溶解，12 000 g離心1 min,棄上清;再加入500 |1l buffer qx i洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠:再用500 pl buffer pe 洗滌沉淀2次，將沉淀晾干，加入適

6、當(dāng)體積的ddh2o,離心后收集上淸，瓊脂糖凝膠電泳確定冋收效 率。腸道微生物dna的提取實(shí)驗(yàn)概要腸道微生物dna是進(jìn)行微生物分子生態(tài)學(xué)研究的前提。能否獲得高的dna提取率和高質(zhì)量 的dna,從而真實(shí)地反映微生物群落的實(shí)際情況，是保障研究結(jié)果是否可靠的關(guān)鍵。如何 獲取高質(zhì)量、較完整的腸道菌群基因組dna是腸道微工物研究中的關(guān)鍵。木研究采用物理 方法，化學(xué)方法，酶解法等進(jìn)行dna提取，并對(duì)其進(jìn)行比較，經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到最佳的提取方 法，使其符合以后pcr擴(kuò)增要求以及其它后續(xù)研究工作。試驗(yàn)結(jié)果表明用液氮研像加ctab 提収液的方法提収的腸道微牛物總dna的效果高于其它方法。并口通過(guò)電泳以及pcr檢測(cè), 所

7、提取的dna的質(zhì)量適于進(jìn)一步的分了生物學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)材料健康成年對(duì)蝦購(gòu)于市場(chǎng)，挑取生氏較好、大小均一的，于超凈臺(tái)下取腸道，無(wú)菌操作。實(shí)驗(yàn)步驟1. dna提取方法方法a：1) 取0.02g蝦腸加入總filmlpbs勻漿,液氮研磨2) 加入 250ul0.5%tween-80,吹打洗脫 3min3) 300g離心5min,取上清4) 10000g離心lomin,棄上清5) 加入250uldna裂解液，渦旋混和器上混合30s6) 65°c水浴20min,期間每5min混合一次7) 12000g離心15min,取上清8) 加等體積酚/氯仿,14000g離心15min,取上清9）加入2.5倍體積

8、異丙醇,-20°c靜置l-2h10）4°c 14000g 離心 15min,棄上清11）加入300ul70%預(yù)冷乙醇,14000g離心lomin,棄上清12）超凈臺(tái)下干燥，力口 50ulte重懸，凍于80c方法b：1）取0.02g蝦腸，加130ulctab提取液，冰浴超聲100w, 5min2）放入液氮中冰凍20min,迅速放入65°c水浴中5min,重復(fù)3次3）放入37°c搖床，加10ul溶菌酶,振蕩30min4）力ii 15ul20%（w/c）sds65°c溫育 2h5）4°c 3200g 離心 lomin,取上清6）加 1 oo

9、ulctab 液和 25ul20%sds,渦旋，65°c溫育 lomin7）3200g離心,取上清8）加等體積酚/氯仿,14000g離心15min,取上清9）加0.7倍體積異丙醇，20°c靜置l2h10）4°c 14000g 離心 15min,棄上清11）加入300ul70%預(yù)冷乙醇,14000g離心lomin,棄上清12）超凈臺(tái)下干燥,加50ulte重懸,凍于-80°c方法g1）取0.02g蝦腸,液氮研磨,加入總量imlpbs和20ul20%pvpp勻漿2）200g離心6min,取上清,沉淀中加iml pbs離心取上清,合并上清;300g離心6min,

10、 取上清3）1200g離心6min,收集菌體,并用pbs洗滌4）得到的菌體中加入300ul裂解液i, 10%溶菌酶looul, 1% rnase 20ul,混勻后37°c保 溫 30min5）加入 300ul 裂解液 ii, 50ul20%sds, 50ul20% pvpp,混勻冰浴 5min6）加等體積酚/氯仿,13000g離心8min,取上清,重復(fù)1次刀加入2倍體積異丙醇和1/10倍體積3m醋酸鈉，20°c沉淀2h8）4°c 14000g 離心 15min,棄上清9）加入600ul70%預(yù)冷乙醇，14000g離心lomin,棄上清10）超凈臺(tái)卜干燥，加50ul

11、te重懸，凍于-80°c優(yōu)化ctab法：1）無(wú)菌條件f剖取對(duì)蝦腸道，放入無(wú)水乙醇中，凍于80°c2）取蝦腸（0.02g左右）,液氮研磨,加入總量imlpbs和20ul 20% pvpp, 0.5% tween-80, 吹打洗脫3min3）200g離心6min,取上清,沉淀中加imlpbs離心取上清,合并上清;取上清4）1200g離心6min,收集菌體,并用pbs洗滌5）得到的菌體中加130ulctab提取液和10ul溶菌陋，放入37°c搖床，6) 加 15ul20%(w/c) sds 和：loul 蛋白酶 k, 65°c水浴 2h7) 4°c

12、3200g離心lomin,取上清勻漿;加入250ul300g離心6min,振蕩30min8) 力0 looulctab 液和 25ul20%sds,渦旋，65°c水浴 lomin9) 3200g離心,取上清10) 加等體積酚/氯仿,14000g離心15min,取上清11) 加0.7倍體積異丙醇，20°c靜置lh12) 4°c 14000g 離心 15min,棄上清13) 加入600ul70%預(yù)冷乙醇,14000g離心lomin,棄上清14) 超凈臺(tái)下t燥，加50ulte重懸，凍于-80°c備用2. dna濃度測(cè)定和電泳檢測(cè)所捉dna用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用紫外分光光度計(jì)于260nm, 280nm波長(zhǎng)下測(cè)定粗提 dna的吸光值及濃度，計(jì)算ill a260/a280值。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3. 腸道微生物dna的pcr檢測(cè)pcr引物為接近全長(zhǎng)的細(xì)菌通用引物:27f(5,-agagtttgatcmtggctc-3,； m=a或c)； 13878 (5'-gggcggwgtgtacaaggc-3'； w=a 或 t)。將捉収到的基因組dna稀釋20倍后分別収1, 2, 4, 8ul和原樣lul, 2ul作為模板。pcr 反應(yīng)體系是：無(wú)菌雙蒸水 34.5ul, 10xpcr 緩沖液 5ul, 2.5 mmol/ldn