IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的原理

1、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的原理IPTG誘導(dǎo)的產(chǎn)物是重組后表達(dá)載體中的插入序列所能夠翻譯的蛋白，并可視載體構(gòu)建情況翻譯后續(xù)的標(biāo)簽序列。用乳糖操縱子作為啟動(dòng)子進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)候 ,需要誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)(相當(dāng)于點(diǎn)火 ),但乳糖可以被細(xì)胞利用掉 ,所以利用 IPTG(異丙基 -D-硫代半乳糖苷 )在結(jié)構(gòu)上與乳糖的相似性也可以將 基因表達(dá) 啟動(dòng) ,但它不能被細(xì)胞利用掉 ,從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)的表達(dá) .IPTG 是一種誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑，它不僅僅如我們學(xué)過(guò)的作為乳糖的類似物誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)半乳糖苷酶， 它是一種普遍應(yīng)用的誘導(dǎo)劑，能誘導(dǎo)菌種表達(dá)多種外源基因。但是它能誘導(dǎo)基因表達(dá)的具體原理我卻了解的不是很多，我在網(wǎng)

2、上查到以下一些內(nèi)容，供查閱者借鑒。最早應(yīng)用于的表達(dá)系統(tǒng)是 Lac 乳糖操縱 子，乳糖的類似物 IPTG 可以和 lacI 產(chǎn)物結(jié)合，使其構(gòu)象改變離開 lacO，從而激活轉(zhuǎn)錄 .這種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控成為了大腸桿菌表 達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建的常用元件。 tac 啟動(dòng)子是 trp 啟動(dòng)子和 lacUV5 的拼接雜合啟動(dòng)子，且轉(zhuǎn)錄水平更高，比 lacUV5 更優(yōu)越。 trc 啟動(dòng) 子是 trp 啟動(dòng)子和 lac 啟動(dòng)子的拼合啟動(dòng)子， 同樣具有比 trp 更高的轉(zhuǎn)錄效率和受 lacI 阻遏蛋白調(diào)控的強(qiáng)啟動(dòng)子特性。在常規(guī)的大腸桿菌中， lacI 阻遏蛋白表達(dá)量不高，僅能滿足細(xì)胞自身的lac 操縱子，無(wú)法應(yīng)付多拷貝

3、的質(zhì)粒的需求，導(dǎo)致非誘導(dǎo)條件下較高的本底表達(dá)，為了讓表達(dá)系統(tǒng)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控產(chǎn)物表達(dá)，能過(guò)量表達(dá)lacI 阻遏蛋白的lacIq 突變菌株常被選為L(zhǎng)ac/Tac/trc 表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)菌株?，F(xiàn)在的 Lac/Tac/trc 載體 上通常還帶有 lacIq 基因，以表達(dá)更多 lacI 阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼T導(dǎo)調(diào)控。 IPTG 廣泛用于誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)， 但是 IPTG 有一定 毒性，有人認(rèn)為在制備醫(yī)療目的的重組蛋白并不合適， 因而也有用乳糖代替 IPTG 作 為誘導(dǎo)物的研究。另外一種研究方向是用lacI 的溫度敏感突變體， 30度下抑制轉(zhuǎn)錄， 42 度開發(fā)。熱誘導(dǎo)不用添加外來(lái)的誘導(dǎo)物，成本低，但是由于發(fā)酵過(guò)程中加

4、熱升溫比較慢而影響誘導(dǎo)效果，而且熱誘導(dǎo)本身會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的熱休克蛋白激活，一些蛋白酶會(huì)影響產(chǎn)物穩(wěn)定.T7 啟動(dòng)子是當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個(gè)功能強(qiáng)大兼專一性高的啟動(dòng)子經(jīng)過(guò)巧妙的設(shè)計(jì)而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen 公司的 pET 系統(tǒng)為杰出代表。強(qiáng)大的 T7 啟動(dòng)子完全專一受控于 T7 RNA 聚合酶，而高活性的 T7 RNA 聚合酶合成 mRNA 的速度比大腸桿菌 RNA 聚合酶快 5 倍 當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)， 宿主本身基因的轉(zhuǎn) 錄競(jìng)爭(zhēng)不過(guò) T7 表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅 幾個(gè)小時(shí)目的蛋白通?？梢哉嫉郊?xì)胞總蛋 白的 50%以上。由于大腸桿菌本

5、身不含 T7 RNA 聚合酶，需要將外源的 T7 RNA 聚合酶 引入宿主菌，因而 T7 RNA 聚合酶的調(diào)控模式就決定了 T7 系統(tǒng)的調(diào)控模式 非誘導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀 態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而避免目的基因毒性對(duì)宿 主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過(guò)控制 誘導(dǎo)條件控制 T7 RNA 聚合酶的量，就可以 控制產(chǎn)物表達(dá)量，某些情況下可以提高產(chǎn) 物的可溶性部分。有幾種方案可用于調(diào)控T7 RNA 聚合酶的合成，從而調(diào)控T7 表達(dá)系統(tǒng).1.噬菌體 DE3 是 lambda 噬菌體的衍生株，含有 lacI 抑制基因和位于 lacUV5 啟動(dòng)子下的 T7 RNA 聚合酶基因。 DE3 溶源化的菌株

6、如 BL21(DE3) 就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好 的表達(dá)載體可以直接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac 一樣都是 IPTG 誘導(dǎo) .2.另一種策略是用不含T7 RNA 聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可完全避免因目的蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒不穩(wěn)定。然后用 CE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞 CE6 是 lambda 噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和 pL/pR 啟動(dòng)子控制 T7 RNA 聚合 酶的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7 RNA 聚合酶的合成 .此了噬菌體之外，還可以通過(guò)共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供 T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動(dòng)子調(diào)控T7 RNA 聚合酶合成，

7、據(jù)說(shuō)這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制.由于 T7 RNA 聚合酶的調(diào)控方式仍有可能有痕量的本底表達(dá)，控制基礎(chǔ)表達(dá)的手 段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達(dá)水平。2.是采用帶有 T7lac 啟動(dòng) 子的載體 在緊鄰 T7 啟動(dòng)子的下游有一 段 lacI 操縱子序列編碼表達(dá) lac 阻遏蛋白 (lacI) ，lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染 色體上 T7 RNA 聚合酶前的 lacUV5 啟動(dòng)子并抑制其表達(dá)，也作用于載體 T7 lac 啟動(dòng) 子，以阻斷任何 T7 RNA 聚合酶導(dǎo)致的目的 基因轉(zhuǎn)錄。 pLacI 工轉(zhuǎn)化也是同樣的原理 .如果這還不夠，更為嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段還有 在宿主菌中表達(dá)另一個(gè)可以結(jié)合并 抑制 T7 RNA 聚合酶的基因 T7 融菌酶，降低本底。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有 pLysS 和 pLysE，相容的 ori 都不會(huì)影響后繼的表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，前者表達(dá)的溶菌酶的水平要比后者低得多，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響小，而 pLysE 會(huì)明顯降低宿主菌的生長(zhǎng)水平，容易出現(xiàn) 過(guò)度調(diào)節(jié)，增加蛋白表達(dá)的滯后時(shí)間，從而降低表達(dá)水平 .通過(guò)幾種不同方法來(lái)巧妙調(diào)控 T7 聚合