構(gòu)巢曲霉在應(yīng)答與金合歡醇誘導(dǎo)壓力下蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1、構(gòu)巢曲霉在應(yīng)答與金合歡醇誘導(dǎo)壓力下蛋白質(zhì)組學(xué)分析-推測擔(dān)任疏水蛋白角色摘要：類異戊二烯金和歡醇在治病酵母中作為細(xì)菌密度感知系統(tǒng)分子，也在一些絲狀真菌中表現(xiàn)為生長抑制。為了更深的了解金合歡醇的抗真菌機(jī)制，就做了構(gòu)巢曲霉在金合歡醇誘導(dǎo)下的的雙向電泳分析。我們發(fā)現(xiàn)抗氧化酶和參與蛋白質(zhì)折疊和降解的蛋白質(zhì)的增多。一個顯著的發(fā)現(xiàn)一個貌似疏水蛋白的蛋白DlpA在很大程度上上調(diào)。表達(dá)分析表明DlpA參與氧化，滲透性，和冷壓力的應(yīng)答。我們也發(fā)現(xiàn)dlpA的表達(dá)受MAP蛋白激酶Sak/HogA調(diào)控。構(gòu)巢曲霉野生型和dlpA敲除菌株測試發(fā)現(xiàn)DlpA對于休眠分生孢子的抗熱和抗氧化有作用。此外，此生代謝產(chǎn)物雜色曲霉素在兩

2、株菌中都缺少。我們的研究證明了構(gòu)巢曲霉在金合歡醇的調(diào)節(jié)下的復(fù)雜應(yīng)答和金合歡醇可誘導(dǎo)休眠分生孢子產(chǎn)生疏水蛋白相似物以抵抗外界的氧化和高溫。引言：金合歡醇是非循環(huán)倍半萜烯醇，是真核生物中第一個被認(rèn)識的感應(yīng)分子。它是由人類致病菌白色念珠菌產(chǎn)生，抑制酵母菌絲的生長和生物膜的形成。此外，金合歡醇在許多種微生物、哺乳動物和植物細(xì)胞中變現(xiàn)出作用，它能夠抑制細(xì)菌和真菌使他成為應(yīng)用于保健有趣的混合物。他可以促進(jìn)細(xì)胞的凋亡和抑制各種的細(xì)胞株的癌化。同樣的影響在酵母和真菌中發(fā)現(xiàn)，說明具有保守的分子機(jī)制和靶標(biāo)。在構(gòu)巢曲霉中外部加上金合歡醇和與白色念珠菌一起培養(yǎng)的效果一樣，表面都出現(xiàn)凋亡的特征。此外，同一個作者還給出的

3、金合歡醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過G蛋白異原三聚體的調(diào)節(jié)而起作用的。G蛋白負(fù)調(diào)控因子FlbA的敲除造成G蛋白a亞基的超活化和增加對金合歡醇的抗性敏感。改變了cAMP的水平表明在構(gòu)巢曲霉和黑曲霉中的金合歡醇參與G蛋白依賴性的途徑。最近的研究發(fā)現(xiàn)對金合歡醇敏感的更深層次的分子目標(biāo)和信號途徑。發(fā)現(xiàn)了一些線粒體相關(guān)蛋白，可以使金合歡醇誘導(dǎo)降低從而抑制細(xì)胞的凋亡。人類病原菌煙曲霉表明金合歡醇抑制CWI信號途徑的活性。金合歡醇在構(gòu)巢曲霉和煙曲霉中作用的途徑顯然不同。煙曲霉MAP激酶MapA的敲除突變表現(xiàn)出對金合歡醇的敏感增加，然而構(gòu)巢曲霉的mpkA的突變則表現(xiàn)出對金合歡醇更大的抗性。此外，在煙曲霉中，金合歡醇對菌

4、絲的頂端形態(tài)也有影響。金合歡醇在轉(zhuǎn)錄水平的影響已經(jīng)很清楚了，但是在蛋白質(zhì)組水平的影響還不是很清楚。所以為了研究模式生物構(gòu)巢曲霉在蛋白質(zhì)水平對金合歡醇的應(yīng)答作用，就做了一個雙向電泳。結(jié)果：1、構(gòu)巢曲霉應(yīng)答與金合歡醇的蛋白組分析比較 我們的目的是研究絲狀真菌構(gòu)巢曲霉在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上對金合歡醇的的應(yīng)答。經(jīng)試驗，金合歡醇在50微摩爾每升的濃度是最適合實驗的濃度。高濃度抑制生長，低濃度對甚至沒有什么影響。盡管50微摩爾的濃度輕微的影響孢子的萌發(fā)的和孢子形成，菌絲生長減少。經(jīng)過一系列時間的的實驗，發(fā)現(xiàn)在三小時的時候構(gòu)巢曲霉菌絲的蛋白組成展現(xiàn)出了最大的差異。野生型菌株R21在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)長成球形后，用

5、50毫摩爾金合歡醇處理3個小時，以乙醇作為對照。提蛋白雙向電泳。通過蛋白指紋圖譜找出43種蛋白質(zhì)發(fā)生改變，如表一。為了研究推測的應(yīng)答與金合歡醇的分子靶標(biāo)和中和金合歡醇毒素的機(jī)制，做了更詳細(xì)的關(guān)于DlpA的功能測試2、dlpA基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基于植物疏水蛋白的特征，對適應(yīng)于滲透壓力和冷壓力條件下的氨基酸組分進(jìn)行分析顯示，具有高水平的甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸殘基，但是很少有半胱氨酸和色氨酸殘基，這就賦予了蛋白質(zhì)很高的疏水性。此外在真菌疏水蛋白中發(fā)現(xiàn)重復(fù)的氨基酸序列Asp-Pro-Arg (DPR)。煙曲霉中，這三個疏水蛋白類似蛋白最近被發(fā)現(xiàn)為壓力保護(hù)元件。構(gòu)巢曲霉蛋白DlpA在我們的蛋白組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)

6、包括真菌疏水蛋白的模式特征。雙向電泳顯示，DlpA呈現(xiàn)出過早應(yīng)答，直到大量增加出現(xiàn)穩(wěn)定加上金合歡醇。3小時后達(dá)到最大。然后逐漸減少。如圖2A。金合歡醇的一些立體異構(gòu)體可以影響dlpA的表達(dá)，這表明這些物質(zhì)對構(gòu)巢曲霉的作用機(jī)制是相似的。由于DlpA序列和植物和真菌的疏水蛋白相似，是否DplA具有疏水蛋白的功能。通過RNA印記分析，我們發(fā)現(xiàn)用1摩爾的山梨醇或者1摩爾的氯化鈉滲透和低溫誘導(dǎo)mRNA增加至一個穩(wěn)定的水平。然而，除了細(xì)胞壁壓力沒有其他壓力誘導(dǎo)則不顯示很大的影響。此外，dlpA的mRNA在新形成的休眠分生孢子中保持一個較高的水平，但是在萌發(fā)時或是菌絲生長時會降低。3、在構(gòu)巢曲霉中dlpA反

7、義RNA的表達(dá) 為了分析DlpA對于構(gòu)巢曲霉抵抗金合歡醇的作用，于是進(jìn)行了基因敲除。敲除菌株的特征呈現(xiàn)出令人費解的特征，我們的理解是基因敲除誘導(dǎo)假定的補(bǔ)償機(jī)制。值得一提的是敲除菌株表現(xiàn)出菌落直徑變小和野生型菌株相比。這個表型能夠在滲透壓或三十度下培養(yǎng)的情況下得到部分改善。在低于20攝氏度的情況下變現(xiàn)出比野生型生長更好的態(tài)勢，在42攝氏度的情況下沒有明顯的生長不足出現(xiàn)。敲除菌株沒有表現(xiàn)出對金合歡醇的敏感性，可能的機(jī)制抑制DlpA的功能，也就是掩蓋金合歡醇毒性的機(jī)制。將dlpA的反義RNA轉(zhuǎn)化到野生型R21中，用DNA雜交檢測到反義RNA的存在。在野生型菌株中dlpA基因有微弱的表達(dá)在加入鹽酸強(qiáng)力

8、毒素后的三十分鐘，但是在之后的時間里就沒有表達(dá)了。但是，用濃縮的鹽酸強(qiáng)力毒素對野生型R21的生長沒有什么明顯的生長，然而與沒有毒素的情況下相比孢子形成作用減少了百分之六十。金合歡醇的存在導(dǎo)致有反義RNA菌株完全失去孢子形成作用，但是不影響菌落直徑生長，和dlpA敲除菌株一樣。但是，有反義RNA誘導(dǎo)的菌株在抗真菌毒素的情況下?lián)p害更大。4、在休眠分生孢子中DlpA的功能和調(diào)控 在休眠分生孢子中高水平DlpA基因的敲除顯示在這個階段起一個非常重要的通訊蛋白的作用。由于在有滲透壓的情況下dlpA基因高表達(dá)，所以我們分析它的調(diào)控也在滲透壓控制MAP激酶途徑。為了這個目的，突變株缺乏HogA MAP激酶和

9、敲除突變菌株在正常壓力下的應(yīng)答調(diào)控因子AtfA，是Hog途徑的一個下游組分，在100微摩爾金合歡醇的條件下30分鐘發(fā)生改變。RNA印記分析顯示缺乏金合歡醇誘導(dǎo)可以使dlpA基因表達(dá)在atfA和hogA刪除的菌株中。這個結(jié)果表明，HogA MAP激酶途徑參與dlpA基因的表達(dá)調(diào)控。5、DlpA是雜色曲霉素生物合成所必須的 在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天，上層漂浮物和dlpA突變菌株的菌絲著色與野生型相比較淺。為了驗證是否dlpA基因的敲除減少了色素的產(chǎn)生或者其他的次生代謝產(chǎn)物，我們做了HPLC分析，結(jié)果令人吃驚的是基因的敲除不能產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物雜色曲霉素在實驗條件下，然而，另外一種次生代謝產(chǎn)物terre

10、quinone A卻可以檢測到。盡管存在反義RNA的菌株在著色方面沒有什么異常，但是在doxycycline的處理下也很難檢測到雜色曲霉素。為了確定在轉(zhuǎn)錄水平兩個菌株的雜色曲霉素產(chǎn)生的鈍化作用，我們提取了雜色曲霉素合成途徑基因族中的三個基因(stcU, stcE and aflR)的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示和構(gòu)巢曲霉的野生型和沒有用doxycycline處理的存在反義RNA的菌株這三個基因的表達(dá)量很大程度的下降。與之相似的，dlpA敲除菌株這一個基因群沒有基因表達(dá)。討論：通過雙向電泳可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過金合歡醇處理過的構(gòu)巢曲霉有43中蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了變化，這些蛋白涉及糖酵解，蛋白質(zhì)的折疊，以及氨基

11、酸代謝等功能。有報道稱在白色念珠菌中金合歡醇處理24小時涉及線粒體呼吸的下游基因和蛋白質(zhì)折疊的上游基因能夠抵御氧化作用的壓力。在我們研究金合歡醇的的作用中，線粒體中心蛋白細(xì)胞色素c還原酶復(fù)合體的減少伴隨著谷胱甘肽氧化酶的增加。假說得到驗證，金合歡醇的靶標(biāo)線粒體，細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽耗盡，結(jié)果造成氧化壓力。此外，在構(gòu)巢曲霉中誘導(dǎo)未折疊蛋白的應(yīng)答。這條途徑可以激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白的積累。我們發(fā)現(xiàn)一些泛素激活酶和一些細(xì)胞質(zhì)的熱激蛋白表現(xiàn)出上調(diào)。此外，可以檢測到Cdc48和Nap1兩種蛋白的表達(dá)量上調(diào)，可能有其他的特別是DNA損傷方便的功能。而且，Cdc48在釀酒酵母中參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。在構(gòu)巢曲霉中的

12、上調(diào)表達(dá)，表明對金合歡醇的UPR調(diào)節(jié)壓力應(yīng)答。一個令人吃驚的結(jié)果是疏水蛋白類似蛋白大量的增加，沒有變現(xiàn)出任何的功能。表現(xiàn)出在金合歡醇的誘導(dǎo)下在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平兩方便都有增加。此外。我們在低溫下和滲透壓下dlpA的表達(dá)量與在UPR壓力下相同。盡管他們的特殊功能不是完全清楚，表明他們幫助細(xì)胞膜蛋白質(zhì)抵抗低溫造成的損害。這表明金合歡醇膜上的靶目標(biāo)誘導(dǎo)疏水蛋白DlpA的生物合成。然而直到現(xiàn)在這個蛋白的家族在真菌中也不是很清楚，最近的研究表明，煙曲霉中這三個疏水蛋白可以幫助抵抗高ph,低溫，滲透壓等惡劣條件。Blast分析顯示煙曲霉中dlpA和構(gòu)巢曲霉中dlpA同源。盡管在構(gòu)巢曲霉中的疏水蛋白基因的

13、敲除是不致死的，我們發(fā)現(xiàn)DlpA在抵抗外界壓力方便起著非常重要的作用。值得注意的是，兩個菌株雜色曲霉素的產(chǎn)生都不足。這表明改變的PkaA活力水平在存在反義RNA的菌株中下游的激活因子，直到雜色曲霉素生物合成受到抑制在實驗條件下。然而，在自然產(chǎn)生的正負(fù)調(diào)節(jié)因子生物合成之間的相互作用不是完全的清楚?？赡艿脑谡婢?xì)胞中，疏水蛋白DlpA擁有更多普遍的功能?；贒lpA對于卡泊芬凈的敏感性增加了，DlpA 可能對細(xì)胞壁的穩(wěn)定性起作用。相比較，DlpA敲除菌和存在反義RNA的菌株都沒有表現(xiàn)對其他細(xì)胞壁干擾素有很高的敏感性。所以，更可能的是DlpA和壓力影響的蛋白相互作用包括膜相關(guān)的信號組分等。值得注意的是他與煙曲霉中具有相似功能的疏水蛋白之間的關(guān)系。研究表明在煙曲霉中Rho1和Rho3兩個家族的GTP酶受金合歡醇的影響。直到Rho GTP酶發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞骨架動力蛋白的調(diào)節(jié)子，表明它們在細(xì)胞壁開始壓力下錯位，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的改變和最后菌絲頂端的膨大。這就引起推測疏水蛋白參與這個機(jī)制，直到Rho1表現(xiàn)出和-1,3葡聚糖合成酶復(fù)合體相互作用。DlpA復(fù)合體對金合歡醇反應(yīng)還需更深層次的研究，由于敲除菌株缺乏對金合歡醇的敏感度而導(dǎo)致綜合的反應(yīng)。總結(jié)：蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報道，