豬輪狀病毒感染研究進(jìn)展

1、豬輪狀病毒感染研究進(jìn)展丁玉春1 魏文棟2 鄭纓2 (1、重慶市種豬場,重慶 榮昌 402460 2、重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 榮昌 402460 )豬輪狀病毒感染是由豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus，PRV)引起的一種傳染病，也稱胃腸炎。此病多發(fā)于仔豬。主要表現(xiàn)為厭食、嘔吐、腹瀉、脫水等癥狀。育成豬和成年豬通常為隱性感染12。Woode和Bridge1975年首次從豬中分離出輪狀病毒，目前本病已廣泛分布于五大洲,并引起嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失3。以英國為例，14周齡仔豬群發(fā)病率超過80%，死亡率7%20%4。我國獸醫(yī)工作者也從仔豬的腹瀉糞便中檢出RV。1 病原學(xué)豬輪狀病毒（RV）屬于呼腸弧病毒

2、科輪狀病毒屬的A、B、C、E 群4。成熟完整的病毒粒子略呈圓形，沒有囊膜，具有雙層表殼，直徑為6575nm的二十面體對稱。電鏡觀察，病毒的中央為一個電子致密的六角形棱心，直徑3740nm，即芯髓；周圍有一電子透明層，殼粒由此向外呈輻射狀排列，構(gòu)成中間層衣殼；外周為一層光滑薄膜構(gòu)成的外層衣殼，厚約20nm，形成一個輪狀結(jié)構(gòu)，RV由此而得名5。在感染的糞樣和細(xì)胞培養(yǎng)物中均存在兩種形式的病毒粒子：具有雙層表殼的光滑型（S型）雙層顆粒，有感染性，直徑為75nm；沒有外表殼的粗糙型（R型）單殼顆粒，無感染性，直徑為65nm。有關(guān)RV的超微結(jié)構(gòu)，學(xué)者們的意見尚不一致，Martin等（1975年）認(rèn)為RV與

3、環(huán)狀病毒一樣，也有32個大的環(huán)形殼粒，且其180個三聯(lián)亞單位按T=9的、方式組成20個三角面體。每個三聯(lián)亞單位包含3個結(jié)構(gòu)單位，所以一共有540個結(jié)構(gòu)單位。但據(jù)Esparza（1978年）報道，RV表面有162個孔，由320個三聯(lián)亞單位按T=9方式組成20個三角面體。因每個三聯(lián)亞單位包含三個結(jié)構(gòu)單位，所以一共有960個結(jié)構(gòu)單位。出現(xiàn)上述不同的觀察結(jié)果，也許是標(biāo)本制作方法不同的緣故。Stannard氏等（1977年）對乳鼠流行性腹瀉輪狀病毒和猴RVSA11株進(jìn)行了細(xì)致的電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)衣殼有180個形態(tài)亞單位，排列成晶格狀。12個頂各為一個空隙，由5個殼粒圍繞，另外80個空隙各由6個殼粒

4、圍繞。外衣殼由蜂窩樣的晶格組成，且與內(nèi)衣殼的晶格排列相符4。1.1 分子生物學(xué)特性通過X-射線晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，完整的病毒粒子具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。最外層核衣殼由結(jié)構(gòu)蛋白VP7和VP4組成，中間層衣殼由VP6組成，最內(nèi)層衣殼由VP2和少量的VP1、VP3組成。VP7是構(gòu)成外衣殼最豐富的外殼蛋白，是分子量為37KD的糖蛋白。VP4是88KD的紅血球凝集素纖突蛋白，沿VP7形成的光滑表面向外突出。不完整的病毒粒子是完整的病毒粒子在進(jìn)入被感染細(xì)胞過程當(dāng)中外衣殼蛋白VP4和VP7被溶解掉而形成的兩層核衣殼結(jié)構(gòu)（DLP）。除了VP4、VP7、VP6、VP2、VP1和VP3這6種結(jié)構(gòu)蛋白以外，還有5種非結(jié)構(gòu)蛋白

5、，分別是NSPl、NSP2、NSP3、NSP4和NSP56。病毒的基因組由11個獨立片段的雙股正鏈RNA組成。除了片段11具有兩個開放閱讀框（0RD）外，其他的片段只有1個ORF。在各個ORF的5端和3端都有非編碼區(qū)（UTRs )，不同毒株的UTRs高度保守，而ORF的差異比較大。輪狀病毒的mRNA分子具有5端m7GpppGn帽子結(jié)構(gòu)，而3沒有Poly（A）尾。ORF的基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，兩端的UTRs可能與調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合以及核酸的復(fù)制、表達(dá)有關(guān)6。早期的研究結(jié)果認(rèn)為VP7與病毒的附著有關(guān)，但現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明VP7具有穩(wěn)定VP4結(jié)構(gòu)的作用。在病毒侵入細(xì)胞的過程當(dāng)中VP4起到關(guān)鍵

6、作用。VP4能被胰蛋白酶(Trypsin) 分解為VP5(60KD) 和VP8(26KD) 兩個結(jié)構(gòu)部分，與病毒附著、聚集有重要關(guān)系， 可以數(shù)倍提高輪狀病毒的感染性7。VP5含有一個與有膜病毒如流感病毒類似的區(qū)域，它能增加細(xì)胞膜的滲透性，加強(qiáng)病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力。VP8含有唾液酸附著（Sialic acid binding）的區(qū)域，這一區(qū)域?qū)τ谛枰杷徇M(jìn)行感染的輪狀病毒亞單位來說至關(guān)重要。VP6與內(nèi)衣殼蛋白VP1和VP3的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)8。VP4和VP7被溶解掉之后，VP1和VP3的轉(zhuǎn)錄酶活性被激活，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被合成和排出。最內(nèi)層的病毒粒子衣殼由包裹基因組的VP2、VP1、VP3組成，基因組核酸通過

7、VP1、VP3與VP2緊密相連。VP1和VP3具有RNA轉(zhuǎn)錄酶和修飾酶的潛在活性。非結(jié)構(gòu)蛋白NSP1、NSP2、NSP3、NSP5都是RNA結(jié)合蛋白，與病毒的復(fù)制，合成和表達(dá)有關(guān)。NSP5可與VP2作用，進(jìn)而影響VP1/2/3的核心結(jié)構(gòu)，同時也能影響VP6的穩(wěn)定性。而NSP4是一種糖蛋白，與病毒粒子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出芽有關(guān)，在病毒的復(fù)制以及致病機(jī)理方面具有重要作用。NSP4的突變可以影響病毒的毒力9。1.2 病毒分型輪狀病毒具有不同的群型和血清型。將輪狀病毒的核酸進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以將病毒的11個雙鏈RNA片段分離，形成特定的電泳帶模型。這11條帶可以分為4個區(qū)段，常見的人和動物的電泳帶的排列

8、位置為4：2：3：2，統(tǒng)稱為A群，又叫典型RV。根據(jù)第1O和11節(jié)段之間的距離，又分為長型和短型。其他的輪狀病毒的電泳型與A群不同，分別為B、C、D、E、F和G群，統(tǒng)稱為非典型RV。在發(fā)生腹瀉的動物中最常見的是A群，感染豬的輪狀病毒有A群、B群、C群和E群。 病毒粒子表面共有三種抗原，分別為群抗原，中和抗原和血凝素抗原。群抗原是VP6，中和抗原是VP7，而血凝素抗原是VP4。根據(jù)群抗原VP6可以分為不同的亞群。大多數(shù)動物的A群輪狀病毒為I亞群，而人類大多數(shù)A群輪狀病毒為亞群。VP4和VP7在病原的檢測和產(chǎn)生中和抗體以及免疫性保護(hù)過程中具有重要意義，可以根據(jù)VP4和VP7分為不同的血清型系統(tǒng)。根

9、據(jù)VP4形成的血清型叫P（protease sensitive）型，根據(jù)VP7形成的血清型叫G（glycoprotein）型。輪狀病毒不同血清型之間的交叉反應(yīng)性較差，免疫反應(yīng)主要是針對特異血清型的，但現(xiàn)在也有報道利用交叉免疫保護(hù)的。目前已經(jīng)知道至少有14個G型和18個P型。通過輪狀病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在世界廣泛流行的A組RV主要有4種G、P血清型組合， 分別是G1P8、G2P4、G3P8和G4P8。從各大洲分離的仔豬的基因型主要有以下兩種：類OSU型和類Gotfield型6。1.3 理化特性RV對理化因素的作用有較強(qiáng)的抵抗力，所以清洗和消毒豬舍時必須注意此特點。它耐乙醚、氧仿、去氧膽酸

10、鈉、次氯酸鹽；反復(fù)凍融，聲波處理。以及37下1h仍不失活；pH3.510.0范圍內(nèi)病毒保持感染力，對胰蛋白酶穩(wěn)定，1moL/LMgCL2不能增高其對5630min的穩(wěn)定性；糞便中的RV在1820室溫中經(jīng)7個月仍有感染性；能耐10mL/L甲醛1h以上；氯、臭氧、碘、酚等可滅活病毒；100g/L聚維酮碘、950mL/L乙醇和670g/L氯胺T是有效的消毒劑45。1.5 抗原性 RV與呼腸孤病毒和環(huán)狀病毒無抗原關(guān)系，但用補(bǔ)反結(jié)合試驗、免疫熒光試驗和免疫擴(kuò)散試驗和免疫電鏡技術(shù)檢測各種動物的RV，發(fā)現(xiàn)具有共同抗原-出現(xiàn)交叉反應(yīng)。這種共同抗原與內(nèi)衣殼有關(guān),也就是說,內(nèi)衣殼具有各種RV共有的屬抗原。外衣殼內(nèi)

11、糖蛋白抗原有種特異性，交叉保護(hù)試驗或中和試驗可區(qū)別各種動物RV，但Thouless氏等（1977年）對人、牛、豬、小白鼠、狗、羊、馬和兔的RV作交叉中和試驗，發(fā)現(xiàn)高濃度的抗血清可能引起一定程度的種間交叉現(xiàn)象，但同源血清的中和效價通常都比異源血清高810倍以上。1976年Woode氏等應(yīng)用免疫電鏡技術(shù)測人、牛、豬、小白鼠、馬等RV抗原性關(guān)系，發(fā)現(xiàn)抗人RV免疫血清以外，其余四種血清能對四種動物RV呈現(xiàn)交叉凝集現(xiàn)象，人的R型也可以被四中抗血清凝集，但S型只能被人抗RV血清凝集。證明動物感染RV后產(chǎn)生兩中抗體：抗內(nèi)衣殼的群特異性抗體，產(chǎn)生種間交叉反應(yīng)。抗外衣殼的種特異性抗體，中和抗體或保護(hù)性抗體作用4

12、。1.4 培養(yǎng)特性1980年美國的Waytt將人的Wa株首次利用非洲綠猴腎原代細(xì)胞培養(yǎng)成功。輪狀病毒在體外不易培養(yǎng)。輪狀病毒在培養(yǎng)的過程中需要用胰酶處理，病毒接種前用終濃度為10ug/ml的胰酶處理。病毒接種24h后就可出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞腫大變圓、邊緣模糊、細(xì)胞聚集、萎縮，有的細(xì)胞間有胞漿相連，最后細(xì)胞死亡脫落。隨著傳代次數(shù)的增加，病變程度加深，出現(xiàn)病變的時間也越來越快。病毒接種后一般用不含血清的維持液培養(yǎng)。但是黃旭雯等人在研究雞血清對輪狀病毒增殖的影響中發(fā)現(xiàn)，雞血清（CS）能增加單層細(xì)胞的活力，延遲細(xì)胞衰老23d，但細(xì)胞對病毒的易感性降低。同時添加4的CS和10mg/L的胰蛋白酶效果最

13、好，細(xì)胞病變明顯，細(xì)胞單層能維持到被病毒破壞為止，有利于RV的復(fù)制11。輪狀病毒感染細(xì)胞具有特定的趨向性。在體內(nèi)只感染腸絨毛的上皮細(xì)胞，在體外盡管可以吸附許多細(xì)胞，但是只感染腎或腸道上皮細(xì)胞來源的細(xì)胞。輪狀病毒可以在MA-104、CV-1、MARC-145等細(xì)胞系培養(yǎng)，但最適合用MA-104培養(yǎng)。Carlos AGuerrero等人通過不同的方法處理MA-104細(xì)胞，然后用RRV，SA11，SA感染來檢驗細(xì)胞上的受體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)N-多聚糖（N-glycans）、神經(jīng)節(jié)苷脂（gangliosides）、膽固醇類（cholestero1）及其相關(guān)的蛋白質(zhì)是不同基因型的輪狀病毒侵入細(xì)胞的不同受體6。2

14、 流行病學(xué)2.1 傳染源病豬、隱性感染及帶病毒者是本病的傳染源，由于后兩者不易被發(fā)現(xiàn)，因而起著重要的傳染源作用。2.2 傳播途徑RV通過密切接觸尤其是糞-口途徑引起傳播或流行；呼吸道傳播和垂直傳播也已被證實。2.3 易感動物自然情況下，多發(fā)于256日齡仔豬，成年豬感染不會發(fā)生嚴(yán)重的臨床癥狀。KaminjoIo JS等的實驗表明RV檢出率最高的仔豬周齡為28周齡（91.1%），檢出率峰值為8周齡仔豬11。Gelerg等發(fā)現(xiàn)仔豬體內(nèi)排出RV的峰值周齡是34周齡。Morilla認(rèn)為非典型RV感染仔豬的日齡要小于A型，因母豬不能通過被動免疫保護(hù)其仔豬口12。RV感染具有明顯的季節(jié)性，高峰在晚秋及冬季，

15、步數(shù)地區(qū)季節(jié)性不明顯而呈終年流行。散發(fā)，偶見爆發(fā)。一旦發(fā)生本病，隨后將每年連續(xù)發(fā)生，因為RV在體外有較強(qiáng)的抵抗力，且隱性感染的成年動物不斷向外排毒。3 臨床癥狀病初，病豬精神不振，食欲不良，不愿活動。隨后出現(xiàn)嘔吐和腹瀉。腹瀉是本病的主要癥狀，糞便呈黃色、灰色或黑色，水樣或糊樣，嚴(yán)重者帶有黏液和血液。腹瀉34d后，部分病例出現(xiàn)嚴(yán)重脫水。此病多在23d內(nèi)恢復(fù)，死亡率一般為10%。如繼發(fā)其他疾病，使病情惡化，死亡率可達(dá)10%20%9。4 病理變化病豬嚴(yán)重脫水，皮毛粗糙。病變位置只局限于小腸，在小腸的后2/3至1/3處的腸壁變薄，通透性增大，呈半透明狀，小腸絨毛萎縮。小腸內(nèi)部含有大量的黃色或灰黃色的液

16、體或絮狀物，有腥臭的氣味。胃壁弛緩，內(nèi)含有白色的凝乳塊，盲腸和結(jié)腸有黃色或褐色的內(nèi)容物且呈膨脹狀。5 發(fā)病機(jī)制發(fā)病機(jī)制病毒經(jīng)口進(jìn)入小腸，在胰酶的作用下，病毒被激活，感染小腸絨毛頂部上皮細(xì)胞，并在其中增殖，使絨毛上皮細(xì)胞死亡，絨毛萎縮，隱窩鱗狀上皮細(xì)胞代償性分裂， 導(dǎo)致腸內(nèi)容物吸收障礙，腸壁內(nèi)外的滲透壓比發(fā)生改變，體內(nèi)的離子和水分向腸腔分泌，造成腸腔內(nèi)液體蓄積，臨床上表現(xiàn)為水樣腹瀉。由于水分和電解質(zhì)的損失，進(jìn)一步引起脫水和酸堿失衡，嚴(yán)重者可以引起死亡6。6 診斷6.1 通過流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化等對該病進(jìn)行初步診斷，確診需要實驗室檢驗。6.2 實驗室診斷6.2.1 電鏡觀察（EM） 輪狀病

17、毒在電子顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特殊的輪狀， 將發(fā)生腹瀉的仔豬糞便或小腸內(nèi)容物離心，加雙抗滅菌，然后用磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察， 就會看到特異的的病毒粒子。6.2.2 免疫熒光技術(shù)（FA） 采集發(fā)病早期的仔豬的空腸或內(nèi)容物，刮取小腸絨毛作壓片或涂片，用丙酮固定后再用豬輪狀病毒熒光抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察， 可以在絨毛上皮的胞漿內(nèi)見到熒光。6.2.3 ELISA 將酶標(biāo)記抗體檢驗病料，如果有TGEV存在，則抗原和抗體結(jié)合，同時使酶對底物作用而顯色。此種方法敏感易行，實用性強(qiáng)13。6.2.4 核酸電泳法 輪狀病毒的核酸有11個節(jié)段，在PAGE電泳時呈現(xiàn)特異的電泳圖譜，不僅能與其他病毒區(qū)別開，也能初步鑒

18、定輪狀病毒的群。這是研究輪狀病毒分類學(xué)和流行病學(xué)最常見的方法。6.2.5 RT-PCR 輪狀病毒的核酸是RNA，通過反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，能夠快速檢出病毒。它的靈敏性高，適合早期診斷和分子流行病學(xué)檢查。6.2.6 核酸探針檢測 劉明軍等用光敏生物素標(biāo)記A群輪狀病毒的核酸，其敏感性接近于國內(nèi)報道的非同位素探針?biāo)?，特異性好，適合于A群輪狀病毒的檢測14。7 防治有關(guān)RV感染的治療研究不多。7.1 搞好環(huán)境衛(wèi)生 對豬舍定期清洗，消毒。在寒冷的季節(jié)要注意保暖，提高母豬和仔豬的抵抗力。同時豬舍實行全進(jìn)全出制，分娩舍和保育舍要分開，作好隔離。工作人員要注意消毒和隔離，禁止外來人員進(jìn)入和參觀。7.2 加強(qiáng)免疫 7.

19、2.1 非特異性免疫 由于輪狀病毒是腸道病毒，因此非特異性免疫特別是黏膜免疫在輪狀病毒的預(yù)防當(dāng)中具有重要作用。黏膜免疫可以通過口服途徑進(jìn)行。Shing C等人發(fā)現(xiàn)將輪狀病毒核酸疫苗用硅藻酸鹽包裹，可以在腸道中產(chǎn)生高水平的IgA15。7.2.2 傳統(tǒng)疫苗 傳統(tǒng)疫苗包括滅活苗和弱毒苗。滅活苗的抗原性不高，通常需要添加佐劑。弱毒苗在仔豬體內(nèi)可以增殖，有一定的保護(hù)性。油佐劑滅活苗在懷孕母豬分娩前30d免疫，仔豬在出生后7d和21各免疫1次。弱毒苗在分娩前5周和2周各免疫1次。7.2.3 異源疫苗 輪狀病毒不同血清型之間的免疫交叉性較差，一般用同一血清型的疫苗免疫，效果較好。但有報道稱輪狀病毒感染也可以

20、通過異源疫苗來免疫。異源苗免疫的主要機(jī)制是利用VP6的保護(hù)作用。7.2.4 亞單位疫苗 現(xiàn)在已經(jīng)在大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)中成功的表達(dá)了輪狀病毒不同的結(jié)構(gòu)蛋白，為研究不同結(jié)構(gòu)蛋白的作用以及亞單位疫苗的研制，提供了可能。7.2.5 核酸疫苗 核酸疫苗是新興的第三代疫苗。核酸免疫的具體機(jī)制還不太清楚，大多數(shù)人認(rèn)為基因被攝入宿主細(xì)胞，利用宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生免疫抗原，啟動機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，共同抵抗特異病原的攻擊。7.2.6 被動免疫 母源抗體可以防止仔豬感染輪狀病毒，即使感染，發(fā)病程度也較輕，發(fā)病率和死亡率大大減少，感染的程度與母源抗體的滴度有關(guān)。7.3 如果發(fā)現(xiàn)仔豬感染輪狀病毒，立即將病豬隔離

21、到清潔、消毒、干燥溫暖的環(huán)境中去，加強(qiáng)護(hù)理，對癥治療。對有感染威脅的仔豬或母豬要及時接種預(yù)防，使群體平均抗體水平迅速提高，增強(qiáng)對輪狀病毒的抵抗力。8 存在問題及展望RV基因組分11節(jié)段，核苷酸序列常因基因漂移轉(zhuǎn)移、重組等造成RV的變異多樣性。病毒蛋白復(fù)雜多樣且不同血清型RV之間的免疫交叉性很差，給RV免疫及疫苗研制帶來困難。所以，研制一種能夠廣泛交叉保護(hù)不同血清型RV感染的疫苗，具有重要意義。近幾年對RV疫苗的研究獲得了突破性進(jìn)展。陳元鼎等用RHV-RNA2載體系統(tǒng)中表達(dá)的(RV)VP4；胰酶切割位點區(qū)抗原表位可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生具有交叉中和反應(yīng)的血清抗體?？勺鳛樾乱淮鶵V抗原表位亞單位疫苗的侯選疫

22、苗抗原16。目前已將VP4、VP7在大腸桿菌、痘病毒、腺病毒、桿狀病毒中表達(dá)成功，獲得了融合蛋白，但效果還不理想。因此，如何制備高效的融合蛋白是努力的方向17。許多新的免疫方法如作亞單位疫苗的病毒顆粒、DNA疫苗、微量化病毒疫苗和其他的RV口服活疫苗以及腸道外免疫方法也在試驗之中5。基因重配技術(shù)的發(fā)展有望給RV活疫苗的研究提出一條新途徑。參考文獻(xiàn)1 王振龍，柴家前. 實用豬病防治學(xué)M北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1997，1611642 方群. 豬輪狀病毒感染J. 當(dāng)代養(yǎng)豬, 2004, 46. 3 甘肅農(nóng)坐大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)M北京：農(nóng)業(yè)出版杜，1996，9613834 殷震，劉景華動物病毒學(xué)M北京

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