重改翹葉提取物抑菌作用以及穩(wěn)定性研究

1、連翹葉提取物抑菌作用以及穩(wěn)定性研究原江鋒作者簡介：原江鋒（1978-），女，博士，主要從事生物活性成分的分析和應用研究?；痦椖浚郝尻柺锌萍脊リP項目(1201029A)；國家自然科學基金(31101324)；河南科技大學博士啟動基金(09001544)。，王大紅1，崔曉琴2，張清安3(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽471003；2. 長治醫(yī)學院附屬和濟醫(yī)院皮膚科，山西長治046000；3陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062)摘 要：對連翹葉提取物(Forsythia Suspensa leaves extract, FSLE)抑菌性能進行研究，同時以大腸桿菌

2、、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌研究FSLE抑菌成分的穩(wěn)定性。結果表明：FSLE的抑菌活性具有良好的熱穩(wěn)定性；在中性和弱酸性環(huán)境中FSLE抑菌活性較強；在大于30min紫外線照射對FSLE抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌活性有一定影響；H2O2對FSLE抑菌活性影響較大；金屬離子Na+、K+對FSLE抑菌性能影響不大，Ca2+、Cu2+、Fe3+有增強FSLE抑菌能力作用。關鍵詞：連翹葉提取物，抑菌，穩(wěn)定性Study on antimicrobial activity and stability of Forsythia Suspensa leaves extract YUAN Jian

3、g-feng1，WANG Da-hong1，CUI Xiao-qin2，ZHANG Qing-an3(1. College of Food & Bioengingeering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China;2. Department of Dermatology, Heji Hospital Affiliated to Changzhi Medical College Changzhi, 046000, China；3College of Food Engineering and N

4、utrition Science, Shaanxi Normal University, Xian, 710062, China)Abstract：The antimicrobial activity from Forsythia Suspensa leaves extract (FSLE) and its stability were studied with Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, and Escherichia coli as the indicator strain. The results showed that the e

5、xtract had very strong antimicrobial activity, and it kept the high thermostability. The FSLE had obvious antibacterial activity on range of pH from weak acid to neutral. At greater than 30min ultraviolet radiation had slight effect on Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis, H2O2 had obvious ef

6、fect, and Na+、K+ showed a little effect on the antimicrobial activity, Ca2+、Cu2+、Fe3+ enhanced antibacterial activity of FSLE. Key words：Forsythia Suspensa leaves extract (FSLE); antimicrobial activity;stability中圖分類號：TS 202.3 文獻標識碼：A 文章編號：食品的腐敗變質主要由微生物引起的1，食品防腐劑在延長食品貯藏期、保證食品品質的過程中具有非常重要的作用。傳統(tǒng)食品防腐劑是以

7、化學合成品多見，由于化學合成的防腐劑涉及到安全性問題，許多國家已逐步禁止或限制使用。因此研究天然食品防腐劑已經成為食品科學領域研究的熱點。伏牛山區(qū)中藥資源占河南省總數(shù)的76.9%，藥用植物的品種數(shù)量和儲存量均位于全國前列，是全國藥用植物主要產區(qū)之一，其中連翹年產量占全國總產量的40%。伏牛山區(qū)連翹果實中連翹苷和連翹酯苷的含量遠遠高于其他地區(qū)2；近年來的研究發(fā)現(xiàn)連翹葉中有效成分如連翹苷、連翹脂苷、蘆丁等的含量高于果實3-4。由于連翹葉沒有進入國家藥典，因此連翹葉資源尚未得到足夠的開發(fā)利用，造成大量的連翹葉片被遺棄，將連翹葉提取物作為天然防腐劑應用在食品工業(yè)中，既可以提升連翹葉的價值，又可以為食品

8、工業(yè)發(fā)掘新原料。本研究在伏牛山地區(qū)FSLE抗菌性能的基礎上，進一步研究熱處理、pH、紫外線、氧化劑和金屬離子對連翹葉提取物(Forsythia Suspensa leaves extract, FSLE)抑菌穩(wěn)定性的影響，為伏牛山地區(qū)FSLE開發(fā)成安全可靠的食品天然防腐劑提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料與儀器連翹葉采自河南省伏牛山地區(qū)，自然晾干，對其進行研磨粉碎備用。銀杏葉提取物是河北天成藥業(yè)股份有限公司市售產品(總黃酮醇苷9.6mg/g，萜類內酯2.4mg/g)。指示菌：細菌包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis

9、)和大腸桿菌(Escherichia coli)；真菌包括黑曲霉(Aspergillus niger)、根霉(Rhizopus)；以上菌種均由河南科技大學食品與生物工程學院實驗教學中心提供。指示菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基5。RE2000旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；HK-02A手提式粉碎機 廣州市旭朗機械設備有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；BS210S分析天平 北京賽利斯天平有限公司；DL-5-B離心機 上海安亭科學儀器廠；202電熱恒溫干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；HH-4

10、數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；YQDL201，YQDL204微量移液器 北京東林昌盛生物科技有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器。1.2 實驗方法1.2.1 FSLE的制備 連翹葉以1:10(w:w)比例加蒸餾水，于80提取30min后過濾，濾渣再重復煎煮兩次，合并3次濾液，濃縮干燥至浸膏，臨用前用不同條件處理后配成5%溶液濃度。1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備6 將所有供測試的細菌和真菌分別接種于牛肉膏蛋白胨和PDA固體斜面培養(yǎng)基上，細菌置37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，霉菌置28恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，連續(xù)傳代2次。將上述活化好的各種菌分別挑取一環(huán)制成初試菌懸液，取

11、適量初試菌懸液用生理鹽水將其稀釋成含菌量為106107CFU/mL的菌懸液備用。1.2.3 FSLE抑菌性實驗7 將吸水性強的濾紙片用打孔器制成直徑為6mm的圓形濾紙片。將濾紙高壓滅菌后用無菌鑷子將濾紙片浸入無菌水、質量濃度為5%無菌過濾的FSLE和銀杏葉提取物的溶液中30min，烘干備用。分別在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或PDA表面加入0.2mL供試菌的菌懸液，用無菌涂布器涂布均勻，15min后用無菌鑷子夾取濾紙片貼于涂菌平板上。細菌于37恒溫培養(yǎng)24h，霉菌于28恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落生長情況，采用十字交叉法測定抑菌圈兩個垂直方向的直徑大小，取其平均值(mm)為測定結果，每項抑菌實驗均平行重復3

12、次。以上操作均在超凈工作臺上完成。1.2.4 溫度對FSLE穩(wěn)定性的影響8 將FSLE分別在80、100、121處理30min，用蒸餾水配制成質量濃度為5%的溶液，無菌過濾。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，按1.2.3方法測定其抑菌活性。1.2.5 pH對FSLE抗菌效果的影響9 用1mol/L HCl和NaOH溶液把質量濃度為5% FSLE調至pH4、5、6、7、8、9，無菌過濾，平衡24h后以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后測定抑菌圈直徑大小，試驗重復3次。1.2.6 紫外照射對FSLE抑菌活性的影響10 稱取若干份樣品，分別置于

13、20W的紫外等下照射10、30、60、90、120min，用蒸餾水配成5%的樣液，無菌過濾。同樣以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，每項抑菌實驗均平行重復3次。1.2.7 氧化劑對FSLE抑菌活性的影響 將FSLE配制成含3% H2O2的5%的樣液，無菌過濾后測定對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率。以未處理的樣品作為對照，實驗均重復3次。1.2.8 金屬離子對FSLE穩(wěn)定性的研究9 用1mol/L的不同金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+)溶液浸泡FSLE，將處理過的FSLE配制成5%的樣液，12h后測定其抑菌活性，實驗重復3次。2 結果與分析2.1

14、 FSLE的抑菌活性測定由表1可知，F(xiàn)SLE對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，其次是對大腸桿菌的抑制作用，對枯草芽孢桿菌的抑制作用較弱；而對根霉和黑曲霉無抑制作用。對不同的供試菌種的抑制效果在淡竹葉提取物中也有相同結果報道11。因此選取大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌作為對FSLE的穩(wěn)定性實驗的菌種。表1 FSLE和銀杏葉提取物對常見菌的抑制效果Table 1 Inhibitory effect of Forsythia Suspensa leaves extract and Ginkgo leaves extract on common bacteria strains供試菌種連翹葉抑菌

15、圈直徑(mm)銀杏葉抑菌圈直徑(mm)細菌大腸桿菌12.612.2枯草芽孢桿菌11.57.2金黃色葡萄球菌17.515.5真菌根霉66黑曲霉66 這一特點提示：FSLE添加于食品中對細菌類具有較強的抑制活性，對真菌類的抑制還需要其它的防腐劑配合使用。由表1還可以看出，連翹葉提取物和陽性對照銀杏葉提取物的抑菌活性相比，F(xiàn)SLE具有較強的活性。2.2溫度對FSLE抑菌活性的影響圖1 溫度對FSLE抑菌的影響Fig.1 The impact of temperature on the Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial由圖1可知，隨溫度上升

16、，其抑菌效果呈下降趨勢，說明溫度對FSLE的抑菌活性有一定的影響。但總體來說，F(xiàn)SLE在80121°C范圍內處理30min仍具有較強的抑菌效力，表明FSLE比較穩(wěn)定，不易產生熱變性，具備在食品中的使用要求。這與陳佳佳12得出桑葉提取物具備良好抗熱性的結論一致。這一熱穩(wěn)定性的特點提示：FSLE即使添加于需進行加熱處理的食品中，也可穩(wěn)定保持其抗菌防腐性能，可作為熱加工食品中的防腐劑。2.3 pH對FSLE抑菌作用的影響圖2 FSLE在不同pH下的抑菌活性Fig.2 The antibacterial activity of Forsythia Suspensa leaves extrac

17、t at different pHpH對FSLE抑菌作用的影響見圖2，在pH6時，F(xiàn)SLE抑菌效果達到最好，當pH5或pH7時，隨著FSLE處理的pH值逐漸降低或升高，F(xiàn)SLE的抑菌效果均會逐漸降低?？赡茉蚴?，pH升高或降低，改變了提取物有效抑菌成分結構；而在在中性和弱酸的環(huán)境下FSLE的結構較穩(wěn)定，具有較強的抑菌活性。這一提點提示，F(xiàn)SLE作為防腐劑添加在食品中，在中性和弱酸性環(huán)境中抑菌活性較強。2.4 紫外線對FSLE抑菌作用的影響圖3 紫外照射對FSLE抑菌效果的影響Fig.3 Effect of ultraviolet on antibacterial activity of For

18、sythia Suspensa leaves extract紫外照射實驗結果由圖3可知，F(xiàn)SLE經不同時間的紫外照射后，在少于30min對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制能力幾乎沒有影響，但是在30120min范圍，F(xiàn)SLE的抑菌能力還是稍有影響；而對大腸桿菌幾乎無抑制作用。由此看出對于不同菌種，F(xiàn)SLE的抑菌活性具有不同的紫外光穩(wěn)定性，推測原因為FSLE對不同菌種的抑菌機制存在差異。這一提點提示，環(huán)境中的紫外線的存在和長時間照射可能會影響到FSLE抑菌性能的發(fā)揮。2.5氧化劑對FSLE穩(wěn)定性的影響圖4 氧化劑對連翹葉抑菌的影響Fig.4 Effect of oxidants on the

19、Forsythia Suspensa leaves extract antibacterial由圖4可以看出，氧化劑H2O2對FSLE的穩(wěn)定性影響較大，可能原因是FSLE有效抑菌成分大多含不飽和雙鍵和其他可氧化基團，使得氧對FSLE的有效抑菌成分造成破壞，從而導致其有效抑菌成分濃度的降低，所以FSLE應密封保藏。這一特點提示：FSLE作為防腐劑，應避免長期與空氣接觸造成其抑菌效果的降低的問題。2.6金屬離子穩(wěn)定性的研究圖5 金屬離子對提取物抑菌活性的影響Fig.5 Effect of metal ions on antimicrobial activity of Forsythia Suspe

20、nsa leaves extract由圖5可以看出，經Na+、K+處理后，F(xiàn)SLE仍具有較強抑菌性能，但與未處理組相比，抑菌活性略有下降。而經鈣、銅、鐵離子處理后其抑菌活性稍提高，其原因可能是重金屬及過渡金屬離子本身對菌體的生長存在抑制作用。這一特點提示：FSLE作為防腐劑可以應用在含有鈉、鉀、鈣、銅和鐵等金屬離子較豐富的食品中。3 結論 3.1本實驗中，F(xiàn)SLE對所試三種細菌具有比較好的抑制作用，而對所試真菌的抑制效果不明顯。植物中的提取物中如萜烯類、生物堿、類黃酮、甾類、酚類、獨特的氨基酸和多糖等都具有殺蟲和抗菌活性，本課題組下一步將進行FSLE主要抑菌活性物質的分離純化與結構分析研究，從而明確抑菌的物質基礎。3.2 FSLE的抑菌活性具有良好的熱穩(wěn)定性；在中性和弱酸性環(huán)境中FSLE抑菌活性較強；紫外線對FSLE抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌影響不大，但對大腸桿菌的影響較大；應盡量減少FSLE在空氣中的暴露時間；不同的金屬離子對FSLE抑菌性能影響不同，這些都是在實際應用中需要切實考慮的問題。參考文獻1 Moleyar V, Narasimham P. Modified atmosphere packaging of vegetables: an appraisal J. Food Sci Tech