免疫共沉淀GEImmunoprecipitationStarterPack

1、免疫共沉淀(GE Immunoprecipitation Starter Pack )（一）基本原理研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的一種技術，其基本原理是，當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)間的相互作用被保存了下來，這時在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育后再加入與抗體FC片段特異性結(jié)合的結(jié)合于Agarose珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A/G（其親和力對pH值非常敏感，隨pH值的降低而急劇降低），若細胞中有正與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：“目的蛋 白一興趣蛋白一抗興趣蛋白抗體一Protein A/G PLUS-Agarose ”，經(jīng)沸水浴，

2、復合物中的四組分又被分開。然后經(jīng) Western blott ing檢測目的蛋白是否為預測蛋白。這種方法的優(yōu)點是：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用的蛋白 復合物。缺點為：（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結(jié)果，方 法本身具有冒險性。（二）實驗方法免疫共沉淀的實驗過程比較簡單，分為三個階段：

3、a.細胞裂解液的制備；b.細胞裂解液非特異性本底的預處理；c.免疫復合物的形成與純化。1. 10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，實驗當天細胞約長滿80- 90%2. 吸除細胞培養(yǎng)液，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS3. 加入 1ml 預冷的包含 1 x Protease Inhibitor Cocktail （ Roche）的細胞裂解液，4 °C 孵育10-15min，不時敲擊10cm培養(yǎng)皿壁。4. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養(yǎng)皿上刮下來后將裂解液轉(zhuǎn)移至預冷1.5mlEP 管。（如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高， 可用裂解液適當稀釋， 如果蛋白樣品濃度過低， 在以后的 裂解過程中宜適

4、當減少裂解液的用量）。5. 12,000g4°C離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至一新的 1.5ml EP管，不要吸取到白色沉淀，置于冰上（細胞裂解液可-80 °C長期保存）。6. 進行BCA法蛋白定量。7. 吸取適量的 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow/Protein G Sepharose 4 Fast Flow至 1.5ml EP 管（nProtein A Sepharose 4 Fast Flow and Protein G Sepharose 4 Fast Flow are supplied preswollen in 20% etha

5、nol）,加入 1ml PBS進行清洗，12000g 4° C離心 20秒，棄上清，反復兩次，然后用細胞裂解液配制成50%濃度的懸液，建議減掉槍尖部分，以避免在涉及瓊脂糖珠的操作過程中破壞瓊脂糖珠。8. （可選）如最后檢驗步驟是免疫印跡，則預處理可無須進行。a. EP 管加入 50 - 100 卩 l nProtein A Sepharose 4 Fast Flow 或 Protein G Sepharose 4Fast Flow懸液，放置靜音混勻器4° C混勻1h。b. 12000g4°C離心20秒，將上清轉(zhuǎn)移到一新的EP管，置于冰上。9. 根據(jù)測定結(jié)果取約 5

6、00ul 上清物（approximately 100- 500 卩 g total cellularprotein ）至一新的1.5mlEP管，確保每管蛋白總量相等，根據(jù)需要加入1-10卩l(xiāng)或0.2- 2ug的一抗（一般來說，2ug 一抗已足夠，如抗體過多的話容易產(chǎn)生非特異性本底，尤其是多克 隆抗體），4° C混勻1h （1h的孵育時間可使大部分抗體完成結(jié)合反應），同時留取少量上清液備總體蛋白 Western blot 分析 。10. 加入 50l 充分重懸的 nProtein A Sepharose 4 Fast Flow/Protein G Sepharose4 Fast Flo

7、w（50% slurry），放置靜音混勻器 4° C,混勻1h至過夜（盡管有些手冊建議反應過夜，但實際上并無好處，還會增加背景）。11. 12000g 4°C離心20秒，為了降低背景，去除未結(jié)合蛋白，應盡量吸除上清，但寧可留下少量上清也不能吸掉 Protein A/G PLUS-Agarose 。12. 1mlPBS 或細胞裂解液洗滌沉淀 4 次（ RIPA 裂解液有時候會破壞瓊脂糖珠 -抗原抗體復合物內(nèi)部的結(jié)合） ， 洗滌時離心條件和吸除上清的要求同步驟11。13. 完成最后一次洗滌后，去除上清，加入40卩I 1 X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液（DTT會使 IgG 輕

8、重鏈解離） ，瞬時高速離心把樣品離心至管底。14. 上樣樣品95-100 C處理3-10min后12000g離心20秒（免疫復合物經(jīng)電泳上樣緩沖 液及沸水浴后 , 原先和 Protein A/G PLUS-Agarose 結(jié)合的抗體及興趣蛋白都會脫落下來 , 離 心沉淀protein A/G PLUS-Agarose ）。將上清轉(zhuǎn)移到另一個 EP管，取20卩I上清液按相應 的 Western BIot 步驟繼續(xù)實驗，應選擇合適濃度的凝膠以使目的蛋白與 IgG 的輕重鏈盡量 分離以避免干擾。（三）注意事項1. 免疫共沉淀 （co-IP） 通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可

9、以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳。2. 如何避免 IgG 輕重鏈的影響 （只要 IP 和 IB 用的是同一種屬的抗體，且興趣蛋白與 IgG 輕、重鏈分子量有差異，就應該能夠看到輕、重鏈兩條帶，尤其是重鏈，輕鏈可能比較 模糊） ：a. 采用不同種屬來源的抗體，如用鼠抗作 co-IP, 兔抗作 Western BIot 檢測（因為一般情況下，用于免疫沉淀捕獲抗原的抗體也也會一塊跟著跑SDS-PAGE并轉(zhuǎn)膜，如果 WesternBIot 還用同樣來源的抗體，那么二抗在結(jié)合一抗的同時，也會識別膜上捕獲抗原的抗體的輕重鏈，出現(xiàn)25KD 55KD兩條雜帶，干擾試驗結(jié)果，尤其是你的目的蛋白的

10、分子量與抗體 輕重鏈相近的時候。 而不同種屬來源的一抗因為跟二抗沒有交叉反應， 所以可以避免這個問 題）。b. 使用 eBioscience 的 TrueBIot 系列二抗 ,此二抗特異性識別輕重鏈間的二硫鍵， 不能 識別分開的輕鏈和重鏈。c. 采用合適的試劑盒，如 Pierce Co-Immunoprecipitation Kit ， GenScript One-Step CompIete IP-Western Kit 。3. 設置對照：a. 同型抗體對照：如果 co-IP 的一抗是鼠源的 IgG, 就用 normaI mouse IgG 做對照 ,說 明蛋白是特異性的抗體 IP 下來的。b

11、. 不加一抗的對照：如果結(jié)果有很多雜帶或根據(jù)分子量仍不好判斷目的蛋白的話，可設立這個對照。4. 抗體的性質(zhì)對免疫沉淀影響很大。般來說，多抗是免疫沉淀最好的選擇。另外，純化的單抗、腹水和雜交瘤上清液也可用于免疫沉淀。? Polyclonal serum contains antibodies against multiple epitopes of an antigen,which helps stabilize the antigen-antibody- Protein A/G PLUS-Agarose complexes, but which also constitutes a probl

12、em with regard to high background during analysis.? Monoclonal antibodies are more specific, which reduces background but sometimes means that less stable immune complexes are formed due to lower affinity. This can be overcome by using pools of different monoclonal antibobodies.5. 從蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣

13、品都必須在4 C或冰上操作。6. 1 X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液：60 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)100 mmol/L 二硫蘇糖醇( DTT)2% w/v SDS0.01% w/v 溴酚藍10% 甘油不含有二硫蘇糖醇 (DTT)的1 X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液可保存于室溫，二硫蘇糖醇(DTT)配成1 mmol/L的貯存液，使用前現(xiàn)加。1 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT):用20ml 0.01mol/L 的乙酸鈉溶液(pH 5.2 )溶解3.09g DTT,過濾除菌后分裝成1ml小份貯存于-20 C。7. Protein A和Protein G對不同類型的抗

14、體結(jié)合能力存在差異，Protein A和ProteinG的選擇主要取決于實驗所用抗體的來源與亞類。Species Immunoglobulin IsotypeProtein AProtein GHuman IgG1+IgG2+IgG3-+IgG4+IgMUse anti Human IgMIgE-+IgA-+Mouse IgG1+IgG2a+lgG2b+lgG3IgMRat IgG1IgG2aIgG2bIgG2cGoat All isotypesRabbit All isotypesSheep All isotypes-=no binding+ = weak binding+ +Use anti Mouse IgM- +-+-+-+ +- + + = medium binding+ + + = stro ng8.常見裂解液配方如下:NameDescriptionStringencyLow salt1% IGEPAL CA-630± 50 mM Tris, pH 8,at 1 mM PMSF+NP-40(IGEPAL 匚A