一株放線菌藍色素的提取及相關研究

1、    一株放線菌藍色素的提取及相關研究    李增政韋瑤梁亞平曹雪蓮肖齊勝摘 要 從百合鱗莖中發(fā)現(xiàn)一株產藍色素的放線菌，應用發(fā)酵和平板培養(yǎng)兩種方法生產藍色素，采用酸堿法提取了該菌的藍色素粗提物，并對這兩種生產所得的藍色素粗提物分別進行了抑菌活性、溫度等的實驗，發(fā)現(xiàn)該綠色素粗提物對肺炎雙球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等具有拮抗性；在4-60溫度下平板生產的色素比用發(fā)酵生產的色素要穩(wěn)定。關鍵詞 藍色素 抑菌活性 溫度 酸堿法 發(fā)酵：q939.9 ：a0前言次級代謝產物是指生物生長到一定階段后通過次級代謝合成的分子結構十分復雜、對該生物無明顯生理功能，或并非

2、是該生物生長和繁殖所必需的小分子物質，如抗生素、毒素、激素、色素等。色素廣泛應用于食品、服裝、化妝品等行業(yè)，藍色素作為三種基本顏色之一，可與紅、黃色素調配稱多種色調，所以開發(fā)藍色素在各個領域中的應用具有很大的現(xiàn)實意義和良好的市場前景。1材料與方法1.1 材料1.1.1目標菌株從百合鱗莖中分離所得具有產生藍色素功能的放線菌。1.1.2 主要試劑和藥品75% 乙醇溶液、大量高溫滅菌的蒸餾水、無水乙醇、無水乙酸乙酯、甘油、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、重鉻酸鉀、制霉菌素、放線菌酮、萘啶酮酸等。1.1.3主要器材及儀器9cm培養(yǎng)皿、剪刀，鑷子，酒精燈，酒精棉球，移液槍，槍頭（藍色，黃色）、超凈工作臺、蒸汽滅菌鍋

3、、搖床培養(yǎng)箱、1000ml錐形瓶、打孔器、離心機、旋轉蒸發(fā)儀、冷凍干燥機等。1.2 實驗方法1.2.1 培養(yǎng)基及抑菌劑的配制改良高氏i號：可溶性淀粉 20 g；k2hpo4·3 h2o，0.5 g；mgso4·7h2o，0.5 g；feso4·7h2o，0.01g；kno31 g；nacl0.5g；distilled water1000ml；瓊脂18g。抑菌劑：重鉻酸鉀（50 g/ml），萘啶酮酸（20 g/ml），放線菌酮（50 g/ml），制霉菌素（50 g/ml）。發(fā)酵種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉15g，葡萄糖5g，黃豆粉10g，氯化鈉1g，蛋白胨5g，酵母提取物

4、5g，碳酸鈣5g，蒸餾水1000ml，ph7。發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉20g，酵母粉15g，葡萄糖10g， k2hpo4 1g， 碳酸鈣3g，氯化鈉1g，蒸餾水1000ml，ph7.2左右。1.2.2放線菌的培養(yǎng)將所得的目標菌株采用平板劃線法劃到改良高氏i號固體平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為2326。培養(yǎng)5天左右就可以看到平板上的白色菌落，15天左右就可看到平板上有藍色素產生。1.2.3發(fā)酵從生長到對數(shù)期的平板中挑取一定數(shù)量的單個菌落接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基于搖床中160r/min培養(yǎng)溫度26 培養(yǎng)時間3天左右。種子培養(yǎng)基占發(fā)酵培養(yǎng)基的10%。將活化兩天以后的種子培養(yǎng)基接種于發(fā)酵培

5、養(yǎng)基中，溫度26 ph7.2置于160r/min搖床中發(fā)酵直至發(fā)酵培養(yǎng)基變成藍綠色為止。（方法一）1.2.4平板培養(yǎng)法將該菌采用平板劃線法劃到改良高氏i號固體平板上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為2326。培養(yǎng)至平板完全變成藍色為止，然后將平板浸泡在無菌水中帶水溶液變成藍色為止。（方法二）1.2.5色素提取提取方法采用酸堿提取法，將發(fā)酵液和浸泡液分別調ph至12然后4 4000r離心10分鐘：將離心后的上清ph調至12，再次4 4000r離心10分鐘；最后去上清將沉淀物真空冷凍干燥得到藍色素粗提物。1.2.6色素抑菌活性實驗抑菌活性采用濾紙片法濾紙片直徑為9mm，溶劑采用三種分別是蒸餾水（1）、99

6、.9%乙醇（2）、乙酸乙酯（3），色素粗提物濃度均為0.003g/ml。操作時將濾紙片浸濕在色素粗提物溶液中然后待風干以后再操作方法一生產的色素抑菌活性：方法二生產的色素抑菌活性1.2.7溫度對色素粗提物的影響方法二所生產的色素：方法二生產的色素0.1g溶于50ml水中：方法一生產的色素0.15g溶于50ml水中：應用兩種生產色素方法來生產色素，提取色素粗品以后進行溶解時發(fā)現(xiàn)：方法一生產的色素需要將ph調為1112（起始ph為2.8）才能變成藍色放置一段時間后溶液會變成黃色，而應用方法二生產的色素溶于水以后溶液直接變成藍色長時間保存不變色。2結果及分析應用兩種方法生產所得的色素在色澤上差異很大

7、。方法一所得的色素需要經過調節(jié)ph才能呈現(xiàn)藍色但是暗淡，在常溫下放置一段時間后會變成黃色，在熱水80凹？0耙隕霞尤？0s會變成黃色在溫度對色素的影響實驗中也發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高od值逐步減小，顏色也越來越淡偏向黃色所以應用該方法所生產的藍色素不穩(wěn)定；方法二所得的色素色澤鮮亮藍色明顯，常溫下放置不會變色加熱到90耙膊換岜瀋琌d值也沒有呈現(xiàn)逐步減小，所以方法二所生產的色素相對比較穩(wěn)定。在抑菌活性實驗中，兩種方法所生產的色素均表現(xiàn)出了不同的抑菌活性其中金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌是兩種色素在乙醇和乙酸乙酯溶劑下都有抑菌活性，不同方法生產的色素在不同溶劑中表現(xiàn)出來的抑菌活性有著明顯不同，造成這種原因是因為生產方式的不同；而相同色素在相同溶劑下對同一株菌的抑菌活性不同可能是因為色素是粗提物里面物質多樣在不同溶劑中表現(xiàn)出了不同溶解度?；饋碓矗簢壹壌髮W生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目一株產藍色素放線菌的色素提取及相關研究項目編號：201610742073。參