融合蛋白表統(tǒng)

1、第二章第二章 基因工程的工具酶與載體基因工程的工具酶與載體第三節(jié)第三節(jié) 表達(dá)載體表達(dá)載體二、融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)二、融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu)表達(dá)載體的基本結(jié)構(gòu) 表達(dá)蛋白的識(shí)別？表達(dá)蛋白的識(shí)別？表達(dá)蛋白的分離？表達(dá)蛋白的分離？表達(dá)蛋白的活性？表達(dá)蛋白的活性？蛋白表達(dá)的高效性？蛋白表達(dá)的高效性？蛋白表達(dá)的可控性？蛋白表達(dá)的可控性？1 1、融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的概念、融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)的概念v蛋白質(zhì)融合表達(dá)是指外源基因與載體已有蛋白質(zhì)融合表達(dá)是指外源基因與載體已有的擔(dān)體蛋白的編碼基因拼接在一起，并作的擔(dān)體蛋白的編碼基因拼接在一起，并作為一個(gè)新的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行表達(dá)。為一個(gè)新的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行表達(dá)。目的基

2、因目的基因啟動(dòng)子啟動(dòng)子擔(dān)體基因擔(dān)體基因接頭接頭metstop載體載體- -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（laczlacz） 容易識(shí)別、免疫親和分離容易識(shí)別、免疫親和分離綠色熒光蛋白（綠色熒光蛋白（gfpgfp） 容易識(shí)別容易識(shí)別谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（gstgst） 免疫親和分離、維持良好構(gòu)象免疫親和分離、維持良好構(gòu)象金黃色葡萄球菌蛋白金黃色葡萄球菌蛋白a a（sapasapa）免疫親和分離免疫親和分離泛素蛋白（泛素蛋白（ubiubi） 維持良好空間構(gòu)象維持良好空間構(gòu)象硫氧化還原蛋白（硫氧化還原蛋白（trxatrxa） 維持良好空間構(gòu)象維持良好空間構(gòu)象2 2、用于融合蛋白構(gòu)建的高表達(dá)的擔(dān)體蛋

3、白、用于融合蛋白構(gòu)建的高表達(dá)的擔(dān)體蛋白mcspuc18/19載體載體lac z 目的蛋白目的蛋白3 3、融合蛋白表達(dá)載體、融合蛋白表達(dá)載體t7t7載體系統(tǒng)載體系統(tǒng)hishis標(biāo)簽標(biāo)簽 + +目的蛋白目的蛋白谷胱甘肽谷胱甘肽s s轉(zhuǎn)移酶（轉(zhuǎn)移酶（gstgst）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)）融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)atg gst目的蛋白目的蛋白加強(qiáng)加強(qiáng)gfpgfp表達(dá)表達(dá)的哺乳動(dòng)物的哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合蛋細(xì)胞融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒白表達(dá)質(zhì)粒 目的蛋白目的蛋白 egfpgfpgfp融合蛋白的表達(dá)融合蛋白的表達(dá)dna t4連接酶連接酶sac i 6100bppst i 6100bpsac i + pst i 4700+1400bp

4、cos7細(xì)胞系細(xì)胞系目的基因目的基因znf325znf325mcs目的基因目的基因znf325znf325egfpn蛋白內(nèi)切酶蛋白內(nèi)切酶切割位點(diǎn)切割位點(diǎn)梭菌蛋白酶梭菌蛋白酶 arg-c葡萄球菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶 glu-c假單孢菌蛋白酶假單孢菌蛋白酶 lys-c豬胰蛋白酶豬胰蛋白酶 arg-c lys-carg cnc擔(dān)體蛋白擔(dān)體蛋白目的蛋白目的蛋白化學(xué)斷裂法化學(xué)斷裂法：溴化氰（溴化氰（cnbrcnbr）甲硫氨酸殘基甲硫氨酸殘基酶促裂解法酶促裂解法單殘基位點(diǎn)與多單殘基位點(diǎn)與多殘基位點(diǎn)斷裂法殘基位點(diǎn)斷裂法 4 4、融合蛋白中目的蛋白的分離和回收、融合蛋白中目的蛋白的分離和回收啟動(dòng)子啟動(dòng)子擔(dān)體基

5、因擔(dān)體基因接頭接頭 目的基因目的基因metstop ile-glu-gly-arg凝血因子凝血因子xaxa的識(shí)別、作用序列的識(shí)別、作用序列ile-glu-gly-arg表達(dá)表達(dá)親和層析親和層析酶解回收酶解回收酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)酶促裂解法：多殘基位點(diǎn)4 4、融合蛋白中目的蛋白的分離和回收、融合蛋白中目的蛋白的分離和回收 表達(dá)率高，穩(wěn)定性好；表達(dá)率高，穩(wěn)定性好； 通過(guò)親和層析通過(guò)親和層析容易對(duì)擔(dān)體蛋白進(jìn)行分離和純化容易對(duì)擔(dān)體蛋白進(jìn)行分離和純化； 可以幫助目的蛋白形成正確的空間結(jié)構(gòu)可以幫助目的蛋白形成正確的空間結(jié)構(gòu)。 容易將擔(dān)體蛋白從目的蛋白中裂解出來(lái)容易將擔(dān)體蛋白從目的蛋白中裂解出來(lái)。 5 5、融合蛋白表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)、融合蛋白表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)6 6、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體的注意事項(xiàng)、構(gòu)建融合蛋白表達(dá)載體的注意事項(xiàng)目的蛋白目的蛋白的方向的方向終止密碼終止密碼子問(wèn)題子問(wèn)題目的基因目的基因移碼問(wèn)題移碼問(wèn)題atgecor i p1引物p2引物 bamh itga acg終止密碼子問(wèn)題終止密碼子問(wèn)題融合蛋白表達(dá)載體移碼問(wèn)題融合蛋白表達(dá)載體移碼問(wèn)題 atg cca gac ggg ccc aat acctaa 目的基因酶切末端加酶切末端加atgatg之間的堿基序列必須是之