[譯文]Development of a novel amide-silica stationary phase

1、一種新型酰胺基固定相的研發(fā)反相HPLC色譜對不同組分植物激素的分離摘要：一種新型酰胺基硅膠固定相的制備始于N-Boc-苯丙氨酸、酚酞單磷酸二環(huán)己胺鹽以及球型硅膠(4 mm, 60Å)。酰胺基配體的合成具有高收率。通過SEM、IR以及元素分析對所得的酰胺基固定相進(jìn)行表征。得到能夠承載極性酰胺基組分的選擇體會(huì)被用于從13種不同組分植物激素的反相色譜分離。酰胺基固定相分離所得的分析物的色譜分析狀況會(huì)與相同條件下的RP-C18色譜柱的色譜分析狀況進(jìn)行比較。流動(dòng)相、pH值、流速、溫度等因素對該分離系統(tǒng)的影響將會(huì)被研究。通過調(diào)節(jié)梯度洗脫的水體流動(dòng)相pH=6.85，磷酸鉀緩沖液（20mM）以及20

2、柱溫度的乙腈的反相HPLC能夠?qū)崿F(xiàn)最佳分離。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，12種植物激素能夠被分離出來并能夠在230nm或270nm的波長下檢測出來。1. 簡介高效液相色譜分析對于化學(xué)物組分廣泛的分析具有非常重要的作用。所用固定相的性能對該技術(shù)分離效果的影響很大。所以，高效固定相的設(shè)計(jì)對HPLC的色譜分析而言尤為重要。對色譜分析來講，新型酰胺基固定相的研發(fā)仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。C8和C18烷基鏈的改性硅膠仍然是反相HPLC應(yīng)用最廣泛的固定相。除了用以分離酸性、堿性極性化合物的非極性RP配體以外，RPLC的最新發(fā)展趨勢還涉及到含有極性基團(tuán)的固定相的應(yīng)用?；瘜W(xué)鍵合氰基，二醇，環(huán)糊精，內(nèi)嵌酰胺聚乙二醇和烷基氨基

3、甲酸酯或其他功能的中等極性固定相，最初主要打算在反相富水流動(dòng)相中應(yīng)用。隨后，極性固定相對極性分析物展現(xiàn)了新的性能。最新的研究調(diào)查表明含有極性基團(tuán)的固定相在分離堿性分析物方面要比傳統(tǒng)的C8和C18色譜柱具有更為優(yōu)越的性能。極性基團(tuán)，特別是酰胺基，最初之所以被選用就是因?yàn)槠渚哂信c堿性分析物發(fā)生反應(yīng)的能力。此外，酰胺基基團(tuán)還對低分子量的酸性分析物有較高的選擇性。含有嵌入式極性基團(tuán)的固定相具有不同的選擇性，較小的保留性，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的濃度更低。低濃度的激素植物在植物發(fā)育的不同階段，如細(xì)胞分裂，擴(kuò)大和分化；器官形成；種子休眠與萌發(fā)；葉器官的衰老和脫落等，參與發(fā)揮了許多重要的作用。自從第一個(gè)植物激素，

4、生長素，發(fā)現(xiàn)于1926年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)植物激素的幾種類型，主要包括生長素，細(xì)胞分裂素，赤霉素，脫落酸，乙烯。與生長素類似性能的氯化苯氧基酸也被稱為除草劑（方案1：2,4-D，2,4-DP，2,4-DB，2,4,5-T和4-PA）。除草劑能夠在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)遷移，由于其在水中的溶解度，會(huì)造成地表水和地下水的污染。 方案1. 通過新型酰胺基硅膠色譜柱分離的植物激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)HPLC在分離這些極性植物激素的分析物方面是一種應(yīng)用極為廣泛的技術(shù)手段。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)也被提出用于C18柱測定生長素和脫落酸。然而，生長素，細(xì)胞分裂素，脫落酸有著非常不同的植物生理功能和化學(xué)性質(zhì)。所以研發(fā)用以分

5、離不同組分植物激素的反相HPLC的固定相和分離方法非常具有挑戰(zhàn)性?；谖覀兊奈墨I(xiàn)綜述，關(guān)于處理不同類型的植物激素分離的文章很有限。在過去的幾年中，據(jù)報(bào)道Zhen Maa和其同事采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)通過C18色譜柱成功分離了四組激素。作者指出該論文是第一個(gè)實(shí)現(xiàn)四種類型植物激素分離的文章。在這個(gè)研究種，8種植物激素在50分鐘內(nèi)被分離出來。在許多其他類似的研究，反相高效液相色譜法多用于激素測定和分離。在我們廣泛的文獻(xiàn)回顧種，我們未能發(fā)現(xiàn)任何一篇描述用高效液相色譜法測定不同類別的十二個(gè)激素的分離。因此，我們在這里描述的是一種新的酰胺固定相的發(fā)展，用作13種植物激素分離的一種色譜柱，包括吲哚-3-

6、乙酸（IAA），吲哚丙酸（IPA），吲哚丁酸（IBA），脫落酸（ABA），玉米素（Z），6-芐氨基嘌呤（BAP），激動(dòng)素（K），萘乙酸（NAA），2,4,5 -三氯苯氧乙酸（2,4,5-T），2,4-二氯苯氧基丙酸（2,4-DP），2,4-滴丁酸（2,4-DB），對氯苯氧乙酸（抑制）和二氯苯氧乙酸（2,4-D）（方案1）。新型固定相的制備涉及酰胺配體和通過將該配體附于球形硅膠粒子表面（4mm，60Å）的改性硅膠的合成。流動(dòng)相，流速和溫度，pH值等不同分離條件在這個(gè)13種植物激素系統(tǒng)中的保留行為的影響的被研究，12種植物激素會(huì)被分離出來。現(xiàn)有市場上效果最好的ODS柱C18在兩種不同的p

7、H條件下對13種植物激素進(jìn)行反相色譜反相，兩類色譜柱所得的結(jié)果會(huì)相互比較。兩類色譜柱的最佳分離條件在圖1和圖2.中已經(jīng)給出。 圖1. 在最佳條件下，pH=6.85時(shí)，L-Pr-Si和ACE-C18兩類色譜柱對植物激素的分離。梯度洗脫：磷酸緩沖液中的ACN(pH:6.85,20mM), 020 min;1025%, 2030 min;2590%.流速：013min;0.9mL/min,1330dk;1.2mL/min。溫度：22。注入量：5mL。檢測波長：230nm。分析物：1:IAA,2: 4-PA,3.IPA,4:ABA,5:IBA,6:2,4-D,7:2,4-DP, 8:NAA,9:2,4

8、,5-T, 10:Z,11:2,4-DB,12:K,13:BAP. 實(shí)驗(yàn)2.1. 試劑和材料球型硅膠 (SuperSpher Si 60 ,4 mm, 60Å)，購買于Merck公司。硅膠 60 (Merck,0.0400.063mm)和硅膠/TLC卡 (F254)，分別用于柱的色譜分析和TCL。ACE 5C18柱 (2504.6 mm,5 mm, 100Å, 碳負(fù)載15.5%,表面積300m2/g) 用于作對比。HPLC中所用到的溶劑是HPLC級別的，購買于Merck公司。所有被選用的分析物和其它反應(yīng)物、試劑購買于Sigma-Aldrich公司和Merck公司。除了特別說

9、明，所有用于合成的試劑均為試劑級別。通過帶有空心毛細(xì)管的電熱9300儀測定熔點(diǎn)。紅外光譜記錄在Mattson 1000 FT-IR光譜儀上。通過 Thermo Scientific FLASH 2000儀進(jìn)行元素分析。去離子水是用微孔Milli-Q水系統(tǒng)純化而成的。用JEOL/JSM-6510 LV儀器獲得掃描電子顯微鏡（SEM）的圖像。1H（400 MHz）和13C核磁共振譜（100 MHz）記錄于Bruker DPX-400高性能數(shù)字FT-NMR儀器上?；瘜W(xué)位移（D）和耦合常數(shù)（J）分別用每百萬分之（ ppm）和赫茲表示。 圖2. 在低pH(3.25)條件下，L-Pr-Si和ACE-C18

10、兩類色譜柱對植物激素的分離。梯度洗脫：磷酸緩沖液中的ACN(10mM), 030 min,2080%.流速：1mL/min。溫度：22。注入量：5 mL。檢測波長：230nm。分析物：1:IAA,2:4-PA,3.IPA,4:ABA,5:IBA,6:2,4-D,7:2,4-DP,8:NAA, 9:2,4,5-T, 10:Z,11:2,4-DB,12:K,13:BAP.2.2.HPLC的條件色譜設(shè)備由Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，包括一個(gè)四元泵，脫氣器，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測器和恒溫柱室（Agilent,Waldbronn，德國）組成。填充柱（250-4.6mm，不銹鋼）在高壓下采用

11、注漿技術(shù)將改性硅膠填充到柱內(nèi)。每個(gè)分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1mg/ml）要在乙腈中制備，而激動(dòng)素（K）、6-芐氨基嘌呤（BAP）要在30:70的乙腈-0.1 NaOH的混合物中制備。所有的溶液都要存儲(chǔ)在25。用水進(jìn)一步稀釋溶液以獲得每100 ppm最終濃度的分析物（1300 ppm的總濃度）。檢測波長分別為230nm和275nm。色譜條件不同于本章節(jié)中給出的條件中所描述的數(shù)據(jù)。2.3. 合成2.3.1. N-Boc-酰胺（1）將二環(huán)己基碳二亞胺(DCC, 1.71g, 8.3mmol)溶解在DCM(15mmol)中，再添加到N-Boc-苯丙氨酸(2g、7.55mmol)和環(huán)己胺(820mg,8.3m

12、mol)的攪拌混合溶液中，之后再加入到放置在0下1小時(shí)的二氯甲烷(15ml)中。在室溫下攪拌一晚后,再將混合物過濾、蒸發(fā)。殘留物被通過硅膠柱層析法(H:EtOAc=4:1) 純化，得到的N-boc-酰胺(1)是一種白色固體。產(chǎn)量:3.11g,90%.Mp:134135. 1H NMR(CDCI3) :(ppm);0.901.95(m, 19H),2.912.99(m,1H),3.053.15(m,1H),3.653.76(m,1H),4.18-4.27(m,1H),5.18(bs,1H),5.57(bs,1H),7.217.33(m,5H).13C NMR (CDCI3):(ppm);26.6

13、4,25.41,32.71,38.96,48.08,56.73,79.11, 126.90,128.64,129.38,136.95,155.35,169.90.IR (cm-1);3341,3060,3020,29.60,2930,2853,1690,1649,15.38,1521,1449,1386,1291,1264,1166,743,699. 2.3.2. N-Boc基團(tuán)的脫保護(hù)（2）將TFA/AcOH (1:1) (1.2mL)添加到N-boc-酰胺(1)(1g, 2.89mmol)與0下5ml的二氯甲烷的攪拌混合溶液中。溶劑被蒸發(fā)以后，再向殘留物中加入1 N NaOH (5mL)。

14、用DCM(3*15mL)對混合物進(jìn)行萃取，再用Na2SO4進(jìn)行干燥，之后進(jìn)行再過濾、真空條件下蒸發(fā)。最終得到純凈的酰胺（2）是一種白色固體。:217(分解)。產(chǎn)量:710mg,99%. 1H NMR (CDCI3):(ppm); 1.12.2(m,12H),2.902.95 (m,1H),3.183.23 (m,1H),3.753.81 (m,1H),4.164.19(m,1H),6.07(s,1H),7.197.33 (m, 5H).13C NMR(CDCI3):(ppm); 24.94,25.77,28.99,37.78,51.29,57.44,127.28,128.66,129.44,1

15、34.97,173.17.IR(cm1);3259,3235,3100,3028,2936,2854,1701,1625,1569,1442,1338, 1348,1241,1192,1111,764,696. 2.3.3. 3-氯丙基硅烷（3）高品質(zhì)的HPLC球形硅膠(4 mm, 60Å)懸浮于甲苯(60mL)中，再把3-氯丙基三甲氧基硅烷(2g,CPTMS 10mmol)添加到混合物中。將混合物攪、拌回流天。甲苯被蒸發(fā)，通過索氏提取法應(yīng)用氯仿對3-氯丙基硅烷進(jìn)行一夜的洗滌，然后真空條件下干燥個(gè)小時(shí)，最終得到白色粉末。元素分析：C5.32,H1.09(1.11mmol氯丙基硅烷的負(fù)

16、荷/gCP-Si(3) 基于C)。2.3.4. 酰胺基固定相（4）的3-氯丙基硅烷（）懸浮于甲苯(60mL)中，再將酰胺(2) (1.5g,6mmol)添加到混合物中。將混合物攪、拌回流天。甲苯被蒸發(fā)，通過索氏提取法應(yīng)用氯仿對改性硅膠進(jìn)行小時(shí)的洗滌，然后真空條件下干燥個(gè)小時(shí)，最終得到白色粉末。元素分析：C21.45,H 3.24,N2.46(0.88mmol酰胺的負(fù)荷/gSP(4) 基于N。這意味著每克CP-Si(3)會(huì)結(jié)合1.11mmol酰胺基配體)。另一方面,氯仿被蒸發(fā)，殘留物被干燥，可獲得370mg的非鍵合型配體。根據(jù)恢復(fù)的配位體數(shù)量的原因，產(chǎn)物每克都會(huì)鍵合282mg(1.15mmol)

17、的酰胺配體)。3. 結(jié)果與討論3.1. 合成酰胺基功能團(tuán)硅膠的制備工藝在方案2.中已經(jīng)繪圖概述了。這種固定相因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)能夠承載胺和酰胺基極性基團(tuán)，可以酸性、堿性分析物發(fā)生反應(yīng)，因此被選用。該固定相還含有脂肪族和芳香族基團(tuán)，它們對含有芳香環(huán)基團(tuán)和脂肪鏈基團(tuán)的極性分析物有選擇性。對該固定相的合成而言，酰胺基配體是在前兩步中率先被合成的（方案2.）。通過N-Boc-苯丙氨酸與環(huán)己胺的反應(yīng)，N-Boc-酰胺（1）可獲得90%的收率。產(chǎn)物1的去保護(hù)可獲得酰胺基配體（2）的定量生產(chǎn)。3-氯丙基三甲氧基硅烷（CPTMS）附著在如HPLC般優(yōu)質(zhì)的球形硅膠(4 mm, 60Å)上可獲得3-氯丙基硅烷

18、（3）。使用150mL的氯仿采用索氏提取法對產(chǎn)物3淋洗一夜，然后再真空干燥，化合物2與產(chǎn)物3共價(jià)結(jié)合獲得酰胺基固定相（4）。方案2. 試劑和條件。(i)DCC,0 1C-rt,24h;(ii)TFA/AcOH(1:1,v-v),DCM;(iii)甲苯，回流，4天。·3.2. 固定相的表征通過SEM，F(xiàn)T-IR和元素分析對制備的酰胺基硅膠固定相進(jìn)行表征。元素分析的 結(jié)果和選用的IR吸光度在實(shí)驗(yàn)部分已經(jīng)給出。表1.展示了空白硅膠（Si）、氯丙基 化硅烷( CP-Si,3) 以及鍵合式硅膠(L-Pr-Si,4)的元素分析。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，所有的CPTMS 都可以用酰胺基硅膠替代。所得的固定相

19、是由每一克固定相鍵合0.88mmol 酰胺基配體而成的。 表1.硅膠、硅烷化硅膠、配體鍵合式硅膠的元素分析結(jié)果·Si的IR光譜展示了在3484cm-1處存在一個(gè)很強(qiáng)的SiOH色譜帶。而CP-Si的IR光譜卻沒有該色譜帶（或很微弱）。在1636cm1 和963cm1 的色譜帶也很微弱，在29902980cm處也出現(xiàn)新的微弱色譜帶，此處代表對的對稱和非對稱伸縮。所以，CP-Si（）在表面的覆蓋率很高。L-Pr-Si（4)在29702980cm處存在一個(gè)很強(qiáng)的色譜帶，在16101450cm和900600cm1也存在一些新的色譜帶。所以從固體樣品的FT-IR的光譜可以證明硅膠表面反應(yīng)的成功。

20、硅膠材料顆粒的形態(tài)、形狀以及尺寸可通過高分辨率掃描電子顯微鏡進(jìn)行表征?？瞻坠枘z與酰胺基硅膠的SEM光譜比較表明定義良好的球型硅膠以狹窄的顆粒大小分布。所以，新型的酰胺基硅膠可以由球型硅膠合成，SEM，F(xiàn)T-IR和元素分析等相應(yīng)儀器能夠證明衍生的成功。3.3. 的評估色譜反相的評估通過一個(gè)填充有酰胺基硅膠固定相的色譜柱來實(shí)現(xiàn)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的13種植物激素的混合物檢測。13種植物激素分別是吲哚-3-乙酸（IAA），吲哚丙酸（IPA），吲哚丁酸（IBA），脫落酸（ABA），玉米素（Z），6-芐氨基嘌呤（BAP），激動(dòng)素（K），萘乙酸（NAA），2,4,5 -三氯苯氧乙酸（2,4,5-T），2,4-二氯苯氧

21、基丙酸（2,4-DP），2,4-滴丁酸（2,4-DB），對氯苯氧乙酸（抑制）和二氯苯氧乙酸（2,4-D）（方案1.）。流動(dòng)相，流速和溫度，pH值等不同分離條件在這個(gè)13種植物激素系統(tǒng)中的保留行為的影響的被研究，12種植物激素會(huì)被分離出來。通過測試不同種類的梯度洗脫模式來證明13種植物激素分離的最佳條件。通過應(yīng)用一個(gè)水體流動(dòng)相pH=6.85，磷酸鉀緩沖液（20mM）以及20柱溫度的乙腈的梯度洗脫可實(shí)現(xiàn)最佳的分離效果。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，12種植物激素能夠被分離出來并能夠在230nm或270nm的波長下檢測出來。酰胺基固定相分離所得的分析物的色譜分析狀況會(huì)與相同條件下的RP-C18色譜柱的色譜分析狀

22、況進(jìn)行比較，兩類不同的梯度洗脫條件和流動(dòng)相pH (6.85 和3.25)分別在圖.和圖.中展示。在色譜圖上可以觀察到L-Pr-Si和C18色譜柱都很相似，并在pH方面展現(xiàn)了很高的選擇性。分析物的數(shù)目和分析時(shí)間很相似，但兩個(gè)色譜柱的分析物洗脫順序不同，特別是不同組分分析物的比較。通常，疏水性分析物在這些色譜柱中更容易保留。但在不同組分中，親水性分析物在C18色譜柱中的保留性弱，而在L-Pr-Si色譜柱中的保留性強(qiáng)。例如，氯化酸在C18色譜柱中的保留性強(qiáng)，堿性分析物BAP, Z 以及 K 在L-Pr-Si色譜柱中的保留性強(qiáng)。這個(gè)例子表明疏水反應(yīng)和極性反應(yīng)對L-Pr-Si色譜柱上的分析物的色譜分析狀

23、況有影響。3.3.1. pH對分離過程的影響通過影響反相色譜流動(dòng)相中的溶質(zhì)電離作用，流動(dòng)相的pH會(huì)對分析物的保留性和選擇性造成極大的影響。本次研究使用不同pH的緩沖液，調(diào)查RPLC分離中的流動(dòng)相pH的影響。一個(gè)20毫米的磷酸二氫鉀/磷酸鉀緩沖液被選用pH=67(6.42,6.73,6.85,以及7.03)(圖4.)。首先制備的是常備溶液：20mM,pH6.73磷酸鹽緩沖液，然后將常備溶液的pH調(diào)節(jié)成所需的pH(6.42, 6.85, 7.03)。磷酸二氫鉀/磷酸二氫鉀緩沖液可被選用于一個(gè)低pH (pH=3.12,10mM) (圖3.)。在（圖.）中使用pH=4.6，乙酸乙銨酸緩沖液(10mM)

24、。圖3. 緩沖液pH=6.417.03時(shí)對于植物激素分離的影響。梯度洗脫：磷酸緩沖液中的ACN(20mM),020 min;1025%, 2030 min;2590%。流速：013min;0.9mL/min,1330 min;1.2mL/min.溫度:22。注入量:5mL. 檢測波長:270nm.分析物 ：1:IAA, 2:4-PA, 3:IPA, 4:ABA, 5:IBA, 6:2,4-D,7:2,4-DP, 8: NAA,9:2,4,5-T,10:Z,11:2,4-DB,12:K,13:BAP.圖4. pH=4.6和3.25時(shí)對于植物激素分離的影響。溫度:22，流速：1mL/min，注入量

25、:5mL。試劑。（A）梯度：醋酸銨緩沖液中的ACN(20mM)；1025%， 0-20 min。（B）梯度：磷酸緩沖液中的ACN(10mM)；2080%， 0-30 min。檢測波長:270nm.分析物 ：1:Z,2:4-PA,3:IAA,4:2,4-D,5:K,6:IPA,7:ABA,8:2,4-DP,9:2,4,5-T,10:BAP,11:NAA,12:IBA,13:2,4-DB.圖.和.圖展示了酸度對保留時(shí)間和分離效果的比較，增加酸度會(huì)導(dǎo)致堿性分析物BAP, Z 和K 保留時(shí)間的減少，但會(huì)導(dǎo)致酸性分析物的保留時(shí)間的增長。氯化酸酸度的增大會(huì)導(dǎo)致酰胺基固定相保留時(shí)間的減少。所有的氯化酸在pH

26、 =3.25會(huì)被最后被洗脫出來，而在pH =7.03卻較早地被洗脫出來。此外，氯化酸地分離效果隨著流動(dòng)相pH德降低而降低。只考慮氯化酸，對應(yīng)于醋酸銨緩沖液，在pH=4.6時(shí)可以觀察到最有效的分離。然而對堿性分析物（BAP，Z和K，稱為細(xì)胞分裂素）的分離效率，不隨酸性的增加而變化，盡管洗脫時(shí)間會(huì)降低。酰胺硅膠固定相顯示對這些堿性物選擇性好?？赡苁且?yàn)樗鼈兒兴嵝院突净鶊F(tuán)，吲哚衍生物（IAA，IPA，IBA）成為氯化酸和細(xì)胞分裂素的洗脫中間體，這都取決于pH值。這項(xiàng)研究中pH值會(huì)對酸性和酸性堿性混合分析物的分離有顯著影響。極性和不同類別的分析物的洗脫順序之間的關(guān)系是強(qiáng)烈地依賴于流動(dòng)相的pH值。雖

27、然非極性分析物在一個(gè)組分中一般是較晚離開色譜柱的，不同組分的分析物之間的比較就更為復(fù)雜。例如，在同一個(gè)組分中，IAA，IBA和IPA的保留時(shí)間：IBAIPAIAA。相似的，細(xì)胞分裂素這類堿性分析物的保留次序：BAPKZ。在這兩種情況下，三個(gè)化合物含有的極性基團(tuán)相同，但非極性基團(tuán)不同。因此，更多的疏水性化合物較晚離開色譜柱；疏水性難溶于水的分析物與含苯和環(huán)己基的固定相會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)烈的相互作用。然而，在不同類別的化合物（含有不同類型和不同數(shù)量的極性和非極性基團(tuán)）不能以一個(gè)簡單的方式進(jìn)行比較，因?yàn)檫@是分析物與移動(dòng)相和固定相的相互作用。在固定相上的酸性酰胺，堿性胺基的脂肪環(huán)和芳香環(huán)，會(huì)與承載不同極性和非

28、極性基團(tuán)的不同種類分析物發(fā)生大量的相互作用。然而，細(xì)胞分裂素因?yàn)榫哂懈嗟臉O性基團(tuán)，在pH 67范圍會(huì)保留更長。雖然一些氯代酸(2,4-D, 4-PA, 2,4-DP)在pH 67范圍會(huì)被較早地洗脫出來，而在pH 3.2會(huì)很晚被洗脫。保留時(shí)間與所有其他分析物的洗脫序列回收pH值變化的影響。圖5. 梯度洗脫中緩沖液的濃度對植物激素分離的影響。其他所有條件都與最佳分離條件相同(如圖1.所示)。檢測波長：270nm。分析物：1:IAA,2:4-PA,3:IPA, 4:ABA,5:IBA,6:2,4-D, 7:2,4-DP, 8:NAA, 9:2,4,5-T,10:Z,11:2,4-DB,12:K,1

29、3:BAP.3.3.2. 流動(dòng)相對分離過程的影響即使不同的有機(jī)改性劑，如醇，四氫呋喃和乙腈，已經(jīng)用在HILIC或 RPLC流動(dòng)相中隊(duì)混合物組分的分離，ACN更好的結(jié)果已經(jīng)被報(bào)告。事實(shí)上，應(yīng)用這一分離模式的流動(dòng)相通常包含水和乙腈的混合物。因此，所有的色譜評價(jià)的進(jìn)行都要利用乙腈和含鉀磷酸鹽或銨醋酸鹽緩沖液的水體流動(dòng)相的梯度洗脫。在最適pH=6.85，用0, 5, 10, 20 and 40mM的水-磷酸鉀緩沖液來研究緩沖液濃度對保留時(shí)間的的影響（圖5.）。最好的分離是通過20毫米的緩沖區(qū)的實(shí)現(xiàn)。不使用含水乙腈緩沖液就不能取得合適的分離；一個(gè)時(shí)間長的分析中，會(huì)觀察到差的峰和低選擇性（數(shù)據(jù)未顯示）。使

30、用5mm能夠改進(jìn)色譜圖。通過增加緩沖液的濃度可使酸性分析物的分離選擇性介于0-10分鐘洗脫時(shí)間增加。酸性分析物在緩沖液濃度方面的差異不同于堿性分析物（BAP，Z和K），特別是氯化酸會(huì)隨緩沖液濃度的變化而產(chǎn)生極大地影響。隨著緩沖液濃度的增大，酸性分析物從色譜柱中的洗脫會(huì)變慢，正如圖5.所示。所以在20mM的緩沖液會(huì)獲得最佳的分離。高濃度(40mM)會(huì)導(dǎo)致峰的合并，通過520mM的緩沖液可實(shí)現(xiàn)分離。通過改變在590%，1090% 和1590% 范圍內(nèi)的V / V超過40分鐘，保持一個(gè)恒定的濃度20mm的磷酸鹽緩沖液（pH值：6.85）的梯度洗脫的起始濃度測定ACN含量對強(qiáng)度的影響。雖然只有11種分

31、析物5%和15%的起始濃度的乙腈中被分離出來，12中分析物可以從10%的起始濃度的ACN中分離出來。此外，增加流動(dòng)相乙腈的含量可使分析時(shí)間縮短，這是反相色譜柱的典型行為。然而，根據(jù)它們的極性，分析物的洗脫順序在RPLC中不完全相同。分析物的洗脫順序在上面已經(jīng)討論了。3.3.3. 柱溫對分離過程的影響柱溫是影響分析物保留性的一個(gè)重要參數(shù)。在大多數(shù)情況下，柱溫的增加會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間的減少，因?yàn)樵诘湫偷姆聪嗌V系統(tǒng)中，與溶質(zhì)從流動(dòng)相轉(zhuǎn)移到固定相相關(guān)聯(lián)的放熱焓的變化主導(dǎo)著保留性過程。柱溫的功能在選擇性方面的這一變化取決于分析物、固定相以及流動(dòng)相結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)。在高溫下移動(dòng)相變得更加疏水，減少了在反相高效液相色譜中分析物的保留性，這些理論已經(jīng)被廣泛接受的?；谶@一理論，相反的現(xiàn)象應(yīng)該發(fā)生在HILIC中：由于流動(dòng)相的強(qiáng)度下降，隨著溫度的作用，親水性化合物的