PCR技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用

1、昆蟲(chóng)分子生物學(xué)課程論文學(xué) 院: 植物保護(hù)學(xué)院 課 程: 昆蟲(chóng)分子生物學(xué) 學(xué) 號(hào): 姓 名: 任課教師: 職稱: 教授 成 績(jī): 2015年8月29日PCR技術(shù)在微生物鑒定中的應(yīng)用摘要 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突破，PCR技術(shù)已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，特別是在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用。細(xì)菌16S rDNA測(cè)序鑒定需進(jìn)行DNA擴(kuò)增、測(cè)序和分析，其設(shè)備條件和實(shí)驗(yàn)成本比傳統(tǒng)的表型鑒定更高，從鑒定的準(zhǔn)確率來(lái)看，其具有的優(yōu)勢(shì)毋庸置疑。同時(shí)，隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,BOX-PCR技術(shù)在微生物的多樣性研究中也已得到應(yīng)用。使用真菌ITS區(qū)域序列通用引物PCR擴(kuò)增和DNA序列測(cè)定的方法，簡(jiǎn)便快速、成本低穩(wěn)定性好、結(jié)

2、果可靠，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用，可用于常見(jiàn)的和疑難真菌菌種快速鑒定。關(guān)鍵詞 PCR；16S rDNA；BOX-PCR；ITS；細(xì)菌；真菌PCR(polymerase chain reaction, PCR)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，它是一種體外酶促合成擴(kuò)增特定DNA片段的方法，1985年美國(guó)Karray等學(xué)者首創(chuàng)了PCR技術(shù)并由美國(guó)Cetus公司開(kāi)發(fā)研制1。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突破，PCR技術(shù)已在多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛地應(yīng)用，如微生物檢測(cè)、獸醫(yī)學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、環(huán)境科學(xué)、食品安全等領(lǐng)域，包括基因的克隆、修飾、改建、構(gòu)建cDNA文庫(kù)、遺傳病傳染病的診斷、法醫(yī)學(xué)鑒定、物種起源、生物進(jìn)化分析、流行病學(xué)調(diào)查等。由于該技術(shù)具

3、有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，又能快速進(jìn)行檢測(cè)，因而其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷延伸2-3。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上又衍生出了許多技術(shù)，如多重PCR（mutiplex，PCR）技術(shù)4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR）技術(shù)5、單分子PCR技術(shù)6等。1 PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)是根據(jù)待擴(kuò)增的已知DNA片段序列，人工合成與該DNA 2條鏈末端互補(bǔ)的2段寡核苷酸，引物在體外將待檢DNA序列模板在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的整個(gè)技術(shù)過(guò)程經(jīng)若干個(gè)循環(huán)組成，一個(gè)循環(huán)包括連續(xù)的3個(gè)步驟：第1步是高溫條件下的DN

4、A模板變性，即模板DNA在9394的條件下變性解鏈；第2步是退火，即人工合成的2個(gè)寡核苷酸引物與模板DNA鏈3端經(jīng)降溫至55退火；第3步是延伸，即在4種dNTP底物同時(shí)存在的情況下，借助TaqDNA聚合酶的作用，引物鏈將沿著53方向延伸與模板互補(bǔ)的新鏈7。經(jīng)過(guò)這個(gè)循環(huán)后合成了新鏈可將其作為DNA模板繼續(xù)反應(yīng)，由此循環(huán)進(jìn)行。循環(huán)進(jìn)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的量，以指數(shù)級(jí)方式增加，一般單一拷貝的基因循環(huán)2530次，DNA可擴(kuò)增l00萬(wàn)200萬(wàn)倍1。2 PCR技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用細(xì)菌檢測(cè)包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、生化鑒定、免疫分析等多種方法，其中細(xì)菌的分離培養(yǎng)最為關(guān)鍵，但對(duì)苛養(yǎng)菌及生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌分離培養(yǎng)很

5、棘手。近年來(lái)各種基因診斷技術(shù)在細(xì)菌檢測(cè)中不斷開(kāi)發(fā)利用，尤其是基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的基因診斷技術(shù)發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。2.1 16S rDNA在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用16S rDNA是編碼原核生物16S rRNA的基因,長(zhǎng)度約1500bp,存在于所有細(xì)菌、衣原體、支原體、立克次體、螺旋體和放線菌等原核生物的基因組中，由多個(gè)保守區(qū)（conserved region）和與之相間的多個(gè)可變區(qū)(variable region)組成保守區(qū)，為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無(wú)顯著差異8；可變區(qū)在不同細(xì)菌之間存在一定的差異，具有細(xì)菌屬或種特異性。PCR擴(kuò)增16S rDNA包含兩層含義:在保守區(qū)設(shè)計(jì)PCR通用引物，理

6、論上可將存在于待測(cè)標(biāo)本中的各種細(xì)菌都擴(kuò)增出來(lái)；若選擇可變區(qū)設(shè)計(jì)PCR特異性引物，則可將標(biāo)本中的細(xì)菌鑒定到屬種乃至菌株水平，因此16S rDNA已成為細(xì)菌鑒別與分類研究中較理想的靶序列9。細(xì)菌16S rDNA中含有個(gè)可變區(qū)，命名為V1-V9區(qū)，確定某個(gè)可變區(qū)內(nèi)具有細(xì)菌種特異性的序列就可能獲得細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室診斷的有用靶點(diǎn)，除V2、V3、V4區(qū)稍長(zhǎng)外，其他各高變區(qū)序列都很短，沒(méi)有哪個(gè)高變區(qū)能區(qū)分所有細(xì)菌10。目前，已有很多基于16S rDNA全長(zhǎng)或部分序列的應(yīng)用研究：王永智等在對(duì)20余種致病菌進(jìn)行16S rDNA多序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的熒光定量PCR通用引物，檢測(cè)血液細(xì)菌污染模

7、擬標(biāo)本11；應(yīng)燕玲等通過(guò)13種標(biāo)準(zhǔn)菌株建立了一種基于16S rDNA全長(zhǎng)特異性擴(kuò)增和測(cè)序的方法，利用與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，成功鑒定出血制品污染的11種未知細(xì)菌12；美國(guó)Maastricht大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究的實(shí)時(shí)定量16S rDNA PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，利用通用探針外加種或?qū)偬禺愋蕴结樀亩嗵结樂(lè)ǎ茉?h內(nèi)對(duì)血液感染中常見(jiàn)的幾種細(xì)菌，包括革蘭陰性的假單胞菌、大腸埃希菌及革蘭陽(yáng)性的葡萄球菌、腸球菌、鏈球菌等進(jìn)行快速鑒定13。細(xì)菌16S rDNA測(cè)序鑒定需進(jìn)行DNA擴(kuò)增、測(cè)序和分析，其設(shè)備條件和實(shí)驗(yàn)成本比傳統(tǒng)的表型鑒定更高，但不能對(duì)所有細(xì)菌都鑒定至種的水平。從鑒定的準(zhǔn)確率來(lái)看，建立在細(xì)菌分離株

8、基礎(chǔ)上的16S rDNA擴(kuò)增及測(cè)序具有的優(yōu)勢(shì)毋庸置疑，因此被視為細(xì)菌鑒定與分類的“金標(biāo)準(zhǔn)”。2.2 BOX-PCR技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用BOX-PCR指紋圖譜分析技術(shù),是根據(jù)BOX插入因子設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增微生物基因組DNA的重復(fù)性片段,補(bǔ)充散布的重復(fù)序列,使不同大小的DNA片段與位于這些片段之間的序列得到擴(kuò)增,最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性的一種微生物鑒定方法14。隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展,BOX-PCR技術(shù)在微生物的多樣性研究中已得到應(yīng)用。在細(xì)菌的基因組中已發(fā)現(xiàn)存在10種以上可用于基因指紋分析鑒定的短重復(fù)序列，其中以REP和ERIC應(yīng)用較多，后來(lái)在細(xì)菌重復(fù)序列中發(fā)現(xiàn)了BOX插入因子，大小

9、為154 bp，由保守性不同的box A(57bp)、box B(43bp)和boxC(50bp)等亞單位組成，其中只有box A存在細(xì)菌菌株、種、屬水平的分布差異及進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出多拷貝和高保守性，Versalovic等根據(jù)BOX片段中的box A亞單位設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，使重復(fù)序列之間的不同基因區(qū)域得以選擇性擴(kuò)增，得到大小不等的DNA擴(kuò)增片段，進(jìn)而對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳圖譜分析獲得分類學(xué)信息15。BOX-PCR指紋圖譜分析技術(shù)與REP-PCR和ERIC-PCR技術(shù)相似，但操作更為簡(jiǎn)單快捷，容易獲得較為豐富的擴(kuò)增條帶，不需要菌株、種的特異性DNA探針，只需要一條單引物就能夠完成大量菌株的DNA多

10、態(tài)性分析，擴(kuò)增的結(jié)果可直接進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)。BOX-PCR基因指紋分析獲得的分類信息來(lái)自于完整的基因組，能在種及菌株水平上反映出細(xì)菌的基因型、系統(tǒng)發(fā)育和分類關(guān)系，分辨率高、穩(wěn)定、可重復(fù)性高，是一種快速而有效的DNA指紋技術(shù)，因此可作為檢測(cè)細(xì)菌菌株多樣性的方法。3 PCR技術(shù)在真菌鑒定中的應(yīng)用真菌DNA的堿基組成遺傳穩(wěn)定,不易受環(huán)境影響,而且在生活史任何階段均可獲得。ITS區(qū)域在不同菌株間存在豐富的變異,對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行序列分析不僅豐富了真核生物核糖體基因ITS的序列信息,為病原菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了十分重要的資料和依據(jù),而且為建立病原菌的分子疫病的快速診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ),對(duì)植物病害

11、的防治具有一定意義抗藥性機(jī)理的研究是抗藥性治理的基礎(chǔ)。核糖體DNA是由核糖體基因及與之相鄰的間隔區(qū)組成,其基因組序列從5到3依次為:外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(external transcribed spacer, ETS)、18S基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer, ITS1)、5.8S基因、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)、28S基因和基因間隔序列(intergenicspacer, IGS)16。核糖體DNA中的18S、5.8S和28S的基因組序列在大多數(shù)真菌中趨于保守,在生物種間變化小,而內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1和ITS2作為非編碼區(qū),承受的選擇壓力較小,相對(duì)

12、變化較大,并且能夠提供詳盡的系統(tǒng)學(xué)分析所需要的可遺傳性狀。White等為真菌rRNA基因的ITS設(shè)計(jì)了3種特異引物,即ITS1、ITS4和ITS5,用于大多數(shù)擔(dān)子菌和子囊菌,但這些引物也能擴(kuò)增一些植物ITS區(qū)域17。Gardes等為真菌和擔(dān)子菌分別設(shè)計(jì)了特異引物ITS1-F和ITS4-B18。楊佩文等應(yīng)用真菌核糖體基因ITS區(qū)段通用引物ITS1和ITS4，對(duì)十字花科蔬菜根腫病菌(Plasmodiophora brassicae) rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序分析和特異引物的設(shè)計(jì)，獲得根腫菌一特異性分子片段并對(duì)不同寄主植物進(jìn)行了檢測(cè)19。謝勇等根據(jù)從Gene Bank database獲得的疫霉

13、屬真菌(Pytophthora spp.) rDNA ITS區(qū)段序列，設(shè)計(jì)合成了煙草寄生性疫霉的特異性引物，并從不同病組織及土壤中均檢測(cè)到煙草寄生疫霉，而參試的其他菌株如交鏈孢菌菌株、鐮刀菌菌株、炭疽菌菌株、立枯絲核菌菌株、稻瘟病菌菌株和野火病菌菌株均沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物20。使用通用引物PCR擴(kuò)增和DNA序列測(cè)定的方法，簡(jiǎn)便快速、成本低穩(wěn)定性好、結(jié)果可靠，適合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用，可用于常見(jiàn)的和疑難真菌菌種快速鑒定。使用真菌通用引物雖然無(wú)法將所有的菌株鑒定到種，但是可以鑒定到屬的水平。相信隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,采用分子方法進(jìn)行物種間分類、鑒定、確定種間系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等諸多方面能夠更加貼近生物的本原。4 研

14、究展望各項(xiàng)研究表明,PCR技術(shù)從分子水平上迅速、準(zhǔn)確的進(jìn)行微生物的分類和鑒定。但是,在該技術(shù)的廣泛應(yīng)用和不斷改進(jìn)中,某些樣品的復(fù)雜性等問(wèn)題會(huì)給研究造成一定的困難。首先,由于PCR反應(yīng)的靈敏度很高,所以環(huán)境中存在的抑制劑以及在樣品保存、濃縮和提純過(guò)程中所帶來(lái)的污染會(huì)抑制PCR反應(yīng),或是造成假陽(yáng)性后果,從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；其次,由于DNA檢測(cè)無(wú)需使用活細(xì)胞,PCR反應(yīng)對(duì)樣品中存在的核酸物質(zhì)都可以進(jìn)行擴(kuò)增,故PCR技術(shù)無(wú)法區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞；此外,分子生物學(xué)尚不能完全取代傳統(tǒng)微生物技術(shù),還需采用傳統(tǒng)微生物技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合,對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。隨著PCR技術(shù)的成熟與發(fā)展,以此為基礎(chǔ)的

15、分子生物學(xué)技術(shù)將成為微生物分類鑒定的技術(shù)前沿,它必將會(huì)為微生物分類學(xué)帶來(lái)廣闊的發(fā)展前景。參考文獻(xiàn)1 常世敏. PCR 在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用J. 邯鄲農(nóng)業(yè)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào), 2004,21(4): 23-25.2 唐永凱, 俞菊華, 徐跑等. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其在水產(chǎn)上的應(yīng)用J. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, (21): 422-426.3 吳學(xué)貴. LPS 刺激點(diǎn)帶石斑魚(yú)免疫相關(guān)基因的克隆與組織表達(dá)差異性分析D. ?？? 海南大學(xué), 2011.4 侯立華, 黃新, 朱水芳等. 雙色熒光多重PCR技術(shù)及在禽流感病毒檢測(cè)中的應(yīng)用J. 生物技術(shù)通報(bào), 2010, (1): 168-172.

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