檢測細(xì)胞中1―磷酸鞘氨醇含量LC―MS-MS研究方法建立

1、檢測細(xì)胞中1 一磷酸鞘氨醇含量lc-ms/ms研究方法建立摘要目的建立并確證可以檢測1-磷酸鞘氨醇(s1p)快速、靈敏、特異的lc-ms/ms定量分析方法。方 法采用c17-s1p作為內(nèi)參，甲醇一步法進(jìn)行蛋白沉淀，隨 后進(jìn)行正相電噴霧離子化lc-ms/ms分析。流動(dòng)相為甲醇 -0.1%甲酸水(95 ： 5, v/v),流速0. 2ml/min,每個(gè)樣品的 分析時(shí)間為4 min。細(xì)胞經(jīng)tnf- a處理后s1p含量顯著增加; 而經(jīng)dms處理后s1p含量顯著下降。結(jié)果s1p的標(biāo)準(zhǔn)曲線 線性范圍為0. 110ng/ml。相關(guān)系數(shù)r2均大于0.989。結(jié) 論 該方法可以快速，靈敏，特異性地同時(shí)檢測生物樣

2、品中 s1p的含量。關(guān)鍵詞含量測定；1-磷酸鞘氨醇；液質(zhì)聯(lián)用中圖分類號(hào)r743. 3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼a 文章編號(hào) 2095-0616 (2013) 09-09-03鞘磷脂不僅是細(xì)胞膜的主要成分，也可作為信號(hào)分子調(diào) 控多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞增殖，分化，存活，死亡以及一 些細(xì)胞的炎癥反應(yīng)1-2 o幾種磷脂類代謝物，特別是鞘氨 醇(sph)和1-磷酸鞘氨醇(s1p)被認(rèn)為是具有顯著生物活 性的關(guān)鍵分子，控制著細(xì)胞生存和死亡。s1p可以被s1p磷 酸酶去磷酸化為spho sph作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子，抑制細(xì)胞增 殖和促進(jìn)凋亡。相反，s1p作為sph的磷酸化產(chǎn)物，參與了 促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡過程3。目前已有一些

3、方法用于 測定生物樣品中低豐度的s1p含量。這些方法包括放射性同 位素?fù)饺朊复俜磻?yīng)實(shí)驗(yàn)4,放射性受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)5, hplc 柱前衍生化6-7,質(zhì)譜8-9以及l(fā)c-ms/ms等。在本研究中，我們建立了一種快速，簡便，靈敏的lc-ms/ms分析方法。本方法成功地測定了 hek293細(xì)胞中 s1p的含量。1儀器與試藥finnigan tsq quantum 三重四極桿質(zhì)譜儀(thermo electron, san jose, ca, usa),色譜分析柱為 luna-rpc18 色譜柱 (150 mm lx2 mm i. d. , 5 y m particle size and 100 ? por

4、e size)；外加 c18 保護(hù)預(yù)柱(4. 0 mm l x2. 0 mm i. d. ) (phenomenex, torrance, ca, usa)o derythro-1- 磷酸鞘氨醇(sip), c17-d-erythro-l-磷酸鞘氨醇(c17-s1p) 購自 avanti polar lipids (美國)。sip 和 c17-s1p 的貯存 液dms0/濃鹽酸(100 : 2, v/v)配制，濃度均為100 u g/mlo 用甲醇配制并于-2(rc保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)貯存液用甲醇進(jìn)一步稀 釋成工作液。hplc級(jí)甲醇和甲酸購自tedia公司(美國)。 其他所有有機(jī)溶劑和化學(xué)品均為分析純

5、級(jí)。tnf-a購自 biosource(美國)；二甲基鞘氨醇(dms)購自 biomol research laboratories公司(美國)；超純水由milli-q plus水純化 設(shè)備提供(美國)。2方法和結(jié)果2. 1色譜條件溶劑及樣品經(jīng)finnigan自動(dòng)進(jìn)樣器和質(zhì)譜泵進(jìn)行分離。 柱溫為25°co流動(dòng)相為甲醇-水(95 : 5, v/v)(水中含0. 1% 甲酸)；流速為0. 2 ml/mino每個(gè)樣品的分析時(shí)間為4 min。 流動(dòng)相調(diào)控色譜行為和恰當(dāng)?shù)碾x子化。為了摸索最優(yōu)流動(dòng)相 條件，我們研究了不同比例的甲醇，乙睛和水對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。 乙睛能夠降低樣品的分析時(shí)間，每個(gè)樣品可以

6、在2 min內(nèi)分 析完畢，但峰型比較寬，有一定的脫尾。而增加液相中甲醇 的比例可以改善靈敏度和峰型，盡管分析時(shí)間長了一些。此 外，加入少量甲酸可以提高靈敏度和改善峰型。最終，本實(shí) 驗(yàn)摸索的最優(yōu)流動(dòng)相組成為：95%甲醇和5%甲酸水(甲酸水 中含有0. 1%的甲酸)。在該流動(dòng)相條件下，每個(gè)樣品在4min 內(nèi)分析完成。2.2質(zhì)譜條件2. 3細(xì)胞培養(yǎng)人胚胎腎細(xì)胞293 (hek293)培養(yǎng)在含10% (v/v)胎牛 血清，2 mm谷氨酰胺，0.2% (w/v)碳酸氫鈉，100 u/ml青 霉素和100 ug/ml鏈霉素的dmem培養(yǎng)基中。細(xì)胞于37°c, 5% c02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至匯

7、合狀時(shí)，采用0.25%胰酶 進(jìn)行消化傳代。2. 4樣品收集和制備2. 5制備標(biāo)準(zhǔn)品2. 6方法學(xué)考察3討論s1p作為磷脂類小分子化合物，其在生物體內(nèi)的含量較 低。最早人們采用放射自顯影技術(shù)進(jìn)行s1p含量測定。該實(shí) 驗(yàn)采用放射性標(biāo)記的底物v-32p1atp進(jìn)行體外酶促反應(yīng)， 隨后采用有機(jī)溶劑抽提和tlc分離，再用放射自顯影方法捕 捉產(chǎn)物信號(hào)，最后采用液閃儀或磷屛掃描進(jìn)行定量分析4。 另一種分析方法涉及到放射性受體競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn) 通過3hs1p與未標(biāo)記的s1p競爭性與s1p1受體結(jié)合5。 以上這些方法不僅費(fèi)力耗時(shí)，而且難以區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的化合 物，例如s1p和dhsipo因此，隨后人們使用h

8、plc作為一種 替代方法來定量分析s1p以及相關(guān)化合物。使用hplc時(shí)， sph直接轉(zhuǎn)換成其熒光衍生物，而s1p則被堿性磷酸酶去磷 酸化轉(zhuǎn)變成sph,再進(jìn)行柱前衍生化。隨后，熒光衍生物經(jīng) hplc分離后被熒光分光光度計(jì)檢測5-6, 12-17。盡管hplc 方法避免使用到放射性試劑，但由于其樣品提取步驟繁瑣， 且需要柱前衍生化，不適合大樣本分析。質(zhì)譜技術(shù)是一類分析鞘磷脂代謝產(chǎn)物非常靈敏的分析 方法，特別適合生物樣本中低豐度s1p的定量分析18。質(zhì) 譜技術(shù)的成功應(yīng)用依賴于目標(biāo)物質(zhì)能否氣化，并且他們產(chǎn)生 的離子可以被特異性地檢測出來。由于鞘磷脂類分子較容易 離子化，而且所產(chǎn)生的碎片離子因其有特異的

9、官能團(tuán)和骨架 結(jié)構(gòu)而較容易鑒定區(qū)分19,因此磷脂類分子特別適合質(zhì)譜 分析。近來有通過將樣品提取液直接注入質(zhì)譜儀中進(jìn)行分析 的方法，該類方法較之hplc更為簡便和靈敏8。不過，由 于缺少色譜分離環(huán)節(jié)，該種方法需要多步提取來盡可能降低 諸如等離子干擾以及基質(zhì)效應(yīng)的影響，這些因素反過來又使 得這種方法存在費(fèi)力耗時(shí)的缺點(diǎn)，限制其廣泛使用。lc-ms/ms技術(shù)是hplc和ms技術(shù)的完美結(jié)合，具有更高的靈 敏度，選擇性，特異性以及高通量等特點(diǎn)，特別適合大樣本 分析。本實(shí)驗(yàn)建立并驗(yàn)證了一種運(yùn)用lc-ms/ms技術(shù)測量s1p含量的定量分析方法。該方法采用甲醇一步沉淀法 提取，無需樣品氣化，采用非放射性標(biāo)記的內(nèi)

10、標(biāo)(c17-s1p) 來檢測生物樣品中s1p的含量。流動(dòng)相組分為甲醇和0.1% 甲酸水(95 : 5, v/v)o每個(gè)樣品的分析時(shí)間控制在4 min 內(nèi)，可以滿足大樣本分析的要求。本方法將在研究s1p的生 物學(xué)效應(yīng)以及相應(yīng)靶標(biāo)藥物的篩選方面得到廣泛應(yīng)用。參考文獻(xiàn) huwiler a, zangemeis ter-w it tke u. targe ting the conversion of ceramide to sphingosine 1-phosphate as a novel strategy for cancer therapyjcrit rev oncol hematol, 200

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