β-內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展

1、-內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展 -內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展摘要：青霉素于40年代初首次用于臨床，幾年后就從鏈球菌中分離到了青霉素酶，以后隨著-內(nèi)酰胺類抗生素的不斷開發(fā)和廣泛應(yīng)用，特別是近幾十年來超廣譜新品種的大量應(yīng)用，-內(nèi)酰胺酶的種類、底物譜和耐藥程度均以驚人的速度在發(fā)展，不能不引起格外的重視。關(guān)鍵詞：細(xì)菌，-內(nèi)酰胺酶，耐藥任何生物都試圖適應(yīng)周圍環(huán)境并生存下去，細(xì)菌個體小，易變異,擁有耐藥能力，這是自然界的法則?？茖W(xué)界有一種理論叫“中性突變漂變學(xué)說”，以“中性突變”為基礎(chǔ)的分子進(jìn)化學(xué)已逐漸形成。這個學(xué)說認(rèn)為，在分子水平上看，大部分基因突變對于生命體的生存既不產(chǎn)生有利效應(yīng)，也不釀成不利后果，因此，這類突變在自然選擇

2、中是“中性”的。在億萬年中，生物體內(nèi)的基因不斷產(chǎn)生中性突變，他們不受自然選擇的支配，而是通過隨機(jī)的偶然過程（即遺傳漂變）在群體中固定下來或是被淘汰，結(jié)果就造成了基因和蛋白質(zhì)分子的多樣性，實現(xiàn)了分子的進(jìn)化。在藥物選擇性壓力下，產(chǎn)-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌被篩選出來，得以泛濫。為了對-內(nèi)酰胺酶有一個教深入了解，現(xiàn)將-內(nèi)酰胺酶的研究綜述如下。1 -內(nèi)酰胺類藥物作用機(jī)理肽聚糖合成的最后一步是被稱為青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，即PBPs）的轉(zhuǎn)肽酶形成的。 內(nèi)酰胺類抗生素與D-丙氨酰-D-丙氨酸結(jié)構(gòu)上的相似使得它們與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合（圖一）。-內(nèi)酰胺核不可逆地與青霉素結(jié)

3、合蛋白的Ser403單元結(jié)合，使其失活，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成。此外這個結(jié)合可能還激活細(xì)胞壁中的自溶酶。 圖1 青霉素與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合使酶失活 2 -內(nèi)酰胺酶起源-內(nèi)酰胺酶是指能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)及其 N-?；苌锓肿又?內(nèi)酰胺環(huán)酰胺鍵的滅活酶。-內(nèi)酰胺酶來源于細(xì)菌細(xì)胞壁合成酶(即PBPs)，是由于細(xì)菌合成PBPs的過程中的基因的變異而造成的（圖2）。-內(nèi)酰胺類藥物在這類酶的作用下，使-內(nèi)酰胺環(huán)水解開環(huán)，而-內(nèi)酰胺環(huán)是與PBPs結(jié)合的活性功能部位，因此-內(nèi)酰胺環(huán)的破壞使其失去了干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的功能。 圖2 PBPs突變?yōu)槊负罂山Y(jié)合

4、青霉素并將其破壞 3 -內(nèi)酰胺酶破壞-內(nèi)酰胺抗生素的作用機(jī)制-內(nèi)酰胺酶破壞-內(nèi)酰胺抗生素的-內(nèi)酰胺環(huán)有兩種作用機(jī)制。第一，絕大多數(shù)常見的-內(nèi)酰胺酶有一個依賴絲氨酸發(fā)揮作用的機(jī)制，并且根據(jù)氨基酸序列組成分為三類（A，C和D）。通常它們的活性位點具有一個狹窄的縱形溝狀結(jié)構(gòu)，在溝的底部形成了一個空腔（氧陰離子袋），這種疏松的構(gòu)造容易彎曲，便于結(jié)合底物。由于-內(nèi)酰胺環(huán)上的羰基碳在結(jié)合內(nèi)酰胺酶活性部位的絲氨酸時發(fā)生了不可逆的反應(yīng)，結(jié)果使其成為開環(huán)物，進(jìn)而重建了-內(nèi)酰胺酶。這類酶對青霉素、頭孢菌素、單內(nèi)酰環(huán)類抗生素都有活性。第二，是一類不大多見的-內(nèi)酰胺酶，被稱為金屬類-內(nèi)酰胺酶，或B類-內(nèi)酰胺酶。它們的

5、特點是利用一個2價金屬離子，絕大多數(shù)為鋅離子，分別與組氨酸或半胱氨酸結(jié)合，或同時與二者結(jié)合，并與-內(nèi)酰胺類抗生素的羰基碳的酰胺鍵相互作用，使其不能發(fā)揮作用。這類酶主要對青霉素、頭孢菌素、碳青酶烯類抗生素發(fā)揮作用，但對單內(nèi)酰環(huán)類抗生素?zé)o效。4 -內(nèi)酰胺酶分類細(xì)菌產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要機(jī)制。-內(nèi)酰胺酶分為染色體介導(dǎo)酶和耐藥質(zhì)粒介導(dǎo)酶二大類，以其水解對象可分為青霉素酶、頭孢菌素酶、廣譜酶和超廣譜酶四種。染色體介導(dǎo)酶有K1型，P99型及D31型，染色體基因決定細(xì)菌對抗生素固有耐藥性。質(zhì)粒介導(dǎo)的-內(nèi)酰胺酶用等電聚焦法分型有TEM型(TEM-1，TEM-2)，OXA型(OXA-1

6、3)，PSE型(PSE-14)，SHV-1，HMS-1等標(biāo)準(zhǔn)酶，均為G-桿菌，主要為大腸桿菌、克雷伯氏桿菌、腸桿菌屬、綠膿桿菌等產(chǎn)生。 近代研究證明在院內(nèi)感染病人中產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)酶的耐藥菌，其產(chǎn)生耐藥性大多是在接觸抗生素后獲得的，并通過耐藥基因的轉(zhuǎn)移而播散，也可由基因表達(dá)而傳至下代。至今-內(nèi)酰胺酶的數(shù)量已超過200種。根據(jù)Bush Jacoby-Medeiros的最新分類法l，-內(nèi)酰胺酶按照各自的底物和抑制輪廓分為4組，根據(jù)各自的氨基酸序列分屬于A、B、C、D共4種分子類別(表1)。 表1 -內(nèi)酰胺酶分類-內(nèi)酰胺酶分類組別分子類型優(yōu)先選擇的底物被抑制情況代表酶克拉維酸EDTA1C頭孢菌素革蘭氏陰

7、性桿菌的AmpC,MIR-12aA青霉素革蘭氏陽性菌的青霉素酶2bA青霉素，頭孢菌素TEM-1，2，SHV-12beA青霉素，窄譜和廣譜頭孢菌素，單環(huán)類TEM-326，SHV-26，產(chǎn)酸克雷伯氏菌K12brA青霉素±TEM-30362cA青霉素，羧芐西林PSE-1，3，42dD青霉素，氯唑西林±OXA-111，PSE-22eA頭孢菌素普通變形菌頭孢菌素酶2fA青霉素，頭孢菌素，碳青霉烯類陰溝腸桿菌NMC-A，粘質(zhì)沙雷氏菌Sme-13B多數(shù)-內(nèi)酰胺類（包括碳青霉烯類）嗜麥芽黃單胞菌L1，脆弱擬桿菌CcrA4未知青霉素？洋蔥假單胞菌青霉素酶第l組是不被克拉維酸抑制的頭孢菌素酶，

8、分子量大于30kD，pI>7.0，分子類別C類。大部分由染色體介導(dǎo)，但近年來發(fā)現(xiàn)也可由質(zhì)粒介導(dǎo)25。第2組為可被克拉維酸抑制的內(nèi)酰胺酶，為數(shù)量最多的一組，一半以上由質(zhì)粒介導(dǎo)。根據(jù)對青霉素、頭孢菌素、肟類-內(nèi)酰胺、氯唑西林、羧芐西林和碳青霉烯類抗生索的水解活性分為2a、2b、2be、2c、2d、2e共6個亞組。最近發(fā)現(xiàn)的不能被克拉維酸抑制的TEM型酶和染色體介導(dǎo)的A類碳青霉烯酶分屬于2br和2f亞組。除2d的分子類別為D類外，其余各亞組分子類別均為A類。第3組酶的作用需要金屬離子如Zn2+的參與，故稱為金屬-內(nèi)酰胺酶。分子類別屬B類，不被克拉維酸抑制，但可被乙二胺四乙酸(EDTA)抑制。由

9、于本類酶對青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和-內(nèi)酰胺酶抑制劑的廣泛耐藥性，是現(xiàn)代抗菌化療中尚未突破的一個難點，也是針對細(xì)菌耐藥機(jī)制研究開發(fā)新的有效抗菌藥的重點之一6。第4組包括少量青霉素酶，不被克拉維酸抑制，除1種酶外，均由染色體介導(dǎo)。本組分子類別未知。5 -內(nèi)酰胺酶基因的表達(dá)調(diào)控細(xì)菌-內(nèi)酰胺酶耐藥基因突變可引起廣泛耐藥，按突變位置不同可分為2類。第1類突變發(fā)生于結(jié)構(gòu)基因上，其結(jié)果是導(dǎo)致新酶的產(chǎn)生，如近年來發(fā)展迅速的由質(zhì)粒介導(dǎo)的TEM和SHV型超廣譜酶通過結(jié)構(gòu)基因上單點或多點突變衍生出大量的新型超廣譜酶，造成臨床治療的困難7，此類突變涉及到內(nèi)酰胺酶與-內(nèi)酰胺類抗生素之間相互作用的構(gòu)效關(guān)系。第2

10、類突變發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因以外的區(qū)域，多數(shù)為啟動基因或調(diào)節(jié)基因，后者的改變往往造成結(jié)構(gòu)基因的過度表達(dá)，使產(chǎn)酶量大增而導(dǎo)致耐藥8-9。目前一般認(rèn)為這種對產(chǎn)酶量的基因調(diào)控模式除以上啟動基因或調(diào)節(jié)基因的突變以外，還包括啟動基因的插入序列增強(qiáng)啟動能力10、多拷貝質(zhì)粒11和基因復(fù)制12，它們通過不同的方式引起-內(nèi)酰胺酶的大量產(chǎn)生。此類基因調(diào)控模式最具代表的酶為C類頭孢菌素酶AmpC。C類-內(nèi)酰胺酶具有很強(qiáng)的可誘導(dǎo)性，產(chǎn)酶株在不接觸-內(nèi)酰胺類抗生素時，只產(chǎn)生少量的酶；如有誘導(dǎo)作用的抗生素存在，可使酶產(chǎn)量顯著上升，因而這種酶又稱誘導(dǎo)酶10。分子生物學(xué)研究表明13，14，ampC是AmpC的結(jié)構(gòu)基因，在AmpC的合

11、成過程中主要有ampD、ampG和ampR 3種調(diào)控基因參與(圖3)。ampR與ampC相鄰地排列在染色體內(nèi)，并呈異向轉(zhuǎn)錄。ampR編碼產(chǎn)生1個3lkD的調(diào) 圖3 AmpC酶的產(chǎn)生和調(diào)控機(jī)制ampD與ampG位于操縱子部位，分別編碼產(chǎn)生AmpD和AmpG蛋白，當(dāng)抗生素作用于細(xì)菌細(xì)胞壁后，在轉(zhuǎn)糖酶的作用下肽聚糖長鏈的基本結(jié)構(gòu)N-乙酰葡萄糖胺-N-乙酰胞壁酸斷鍵，降解為N-乙酰葡萄糖醛-N-乙酰胞壁醛三肽(T)15，在具有透性酶活性的AmpG幫助下，T作為信號肽從周質(zhì)滲透人胞漿，進(jìn)入胞漿的T有兩條去路：第一，具有酰胺酶活性的AmpD蛋白可特異性地與T上的L-丙氨酸結(jié)合發(fā)生脫酰化反應(yīng)，最終使L丙氨酰

12、-D-谷氨酰-消旋二氨基庚二酸三肽(I)從T游離出來，I又可作為原料參與胞壁質(zhì)的合成16；第二，AmpR蛋白在沒有誘導(dǎo)劑存在時，是AmpC合成的抑制子；但在信號肽T的誘導(dǎo)下，則起激活子作用，激活ampC轉(zhuǎn)錄，合成AmpC酶10。由此可見，ampG、ampD和ampR 3種調(diào)節(jié)基因在AmpC合成的基因調(diào)控中各自發(fā)揮了不同的作用。ampD編碼產(chǎn)生的AmpD蛋白維持T與I在數(shù)量上的平衡，即控制著ampC轉(zhuǎn)錄信號的強(qiáng)弱；當(dāng)ampD基因突變，產(chǎn)生有缺陷的AmpD蛋白，大量的T激活A(yù)mpR，從而引起ampC過度表達(dá)，使產(chǎn)酶量大增引起耐藥,見表2。表2 ampG、ampD和ampR 3種調(diào)節(jié)基因及其編碼的蛋

13、白質(zhì)的作用調(diào)控基因編碼蛋白蛋白作用ampDAmpD該蛋白具有酰胺酶活性，可特異性地與T上的L-丙氨酸結(jié)合發(fā)生脫酰化反應(yīng)，最終使L丙氨酰-D-谷氨酰-消旋二氨基庚二酸三肽(I)從T游離出來，I又可作為原料參與胞壁質(zhì)的合成。維持T與I在數(shù)量上的平衡，即控制著ampC轉(zhuǎn)錄信號的強(qiáng)弱ampGAmpG該蛋白具有透性酶活性，可使T作為信號肽從周質(zhì)滲透人胞漿ampRAmpRAmpR蛋白在沒有誘導(dǎo)劑存在時，是AmpC合成的抑制子；但在信號肽T的誘導(dǎo)下，則起激活子作用，激活ampC轉(zhuǎn)錄，合成AmpC酶這種因ampD基因突變導(dǎo)致的-內(nèi)酰胺酶大量產(chǎn)生被稱為去阻遏突變17，此種耐藥機(jī)制多見于陰溝腸桿菌，在臨床分離的大

14、腸埃希氏菌中這種突變機(jī)率高達(dá)10-410-6，從而造成對第三代頭孢菌素的嚴(yán)重耐藥18。ampG基因的缺失或突變可造成T進(jìn)入胞漿的困難，使T失去誘導(dǎo)產(chǎn)酶的作用，從而降低-內(nèi)酰胺酶的誘導(dǎo)量。如果ampR基因突變，產(chǎn)生有缺陷的AmpR蛋白，則這種缺陷蛋白本身就喪失了調(diào)控ampC基因轉(zhuǎn)錄的能力，因此,不論其它調(diào)節(jié)基因是否正常，也不管誘導(dǎo)劑是否存在，都不能對AmpR蛋白發(fā)生影響6。某些大腸埃希氏菌和宋氏志賀氏菌僅有ampD和ampG，缺乏ampR，但卻有極高的產(chǎn)酶力，此種現(xiàn)象在臨床分離的大腸埃希氏菌中達(dá)18，對此，研究者認(rèn)為可能是細(xì)菌通過基因的水平轉(zhuǎn)化獲得1個有效啟動子從而激活酶的合成。如上所述，C類酶

15、的基因突變一般發(fā)生在調(diào)節(jié)基因上，通過對產(chǎn)酶量的調(diào)控引起細(xì)菌耐藥。另外，也有報道表明突變可發(fā)生于結(jié)構(gòu)基因上，但一般認(rèn)為后者編碼產(chǎn)生的-內(nèi)酰胺酶盡管在pI等性質(zhì)上有變化，但其水解抗生素的動力學(xué)性質(zhì)不變，因此，這種突變對于耐藥性而言無實際臨床意義19。最近有報道產(chǎn)自陰溝腸桿菌GCl的AmpC酶其結(jié)構(gòu)中有一類似于TEM型酶的環(huán)結(jié)構(gòu)(此結(jié)構(gòu)為TFM酶突變好發(fā)區(qū))，此酶水解頭孢呋辛的速率是其原型酶P99的100倍20。盡管A類酶的突變更多地發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因上（表3），但近年來本類酶在調(diào)節(jié)基因上的突變也越來越頻繁地被發(fā)現(xiàn)，提示各類-內(nèi)酰胺酶的基因調(diào)控方式趨于多樣化和復(fù)雜化。 表3 各類酶基因突變易發(fā)生的位點酶

16、的分子類型該類酶的基因突變易發(fā)生的位點AA類酶的突變更多地發(fā)生在結(jié)構(gòu)基因上，但近年來本類酶在調(diào)節(jié)基因上的突變也越來越頻繁地被發(fā)現(xiàn)BB類金屬-內(nèi)酰胺酶也可通過啟動基因上的多點突變產(chǎn)生耐藥，但本類酶更多的是通過啟動子區(qū)上的插入序列(IS)為轉(zhuǎn)錄開始提供強(qiáng)啟動信號，從而造成-內(nèi)酰胺酶的高效表達(dá)CC類酶的基因突變一般發(fā)生在調(diào)節(jié)基因上，通過對產(chǎn)酶量的調(diào)控起細(xì)菌耐藥Fournier21,22對產(chǎn)酸克雷伯氏菌突變株的研究表明突變株對氨曲南的MIC較原型株大100倍，產(chǎn)酶量增加75倍；DNA測序分析未見結(jié)構(gòu)基因有擴(kuò)增和重排發(fā)生，而在基因轉(zhuǎn)錄起始點上游10位的pribnow盒有點突變發(fā)生，由此作者認(rèn)為啟動基因的

17、點突變導(dǎo)致結(jié)構(gòu)基因的過渡表達(dá)，引起菌株大量產(chǎn)酶。另外，許多產(chǎn)染色體介導(dǎo)的A類酶的菌株中發(fā)現(xiàn)有類似于前述C類酶中的AmpR調(diào)節(jié)蛋白，如InliR、NmcR和SmcR，它們都由位于-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)基因上游的調(diào)節(jié)基因編碼產(chǎn)生，即imiR編碼產(chǎn)生ImiR，nmcR編碼產(chǎn)生NmcR，smeR編碼產(chǎn)生SmeR。但三者的結(jié)構(gòu)基因與調(diào)節(jié)基因在相對位置上有所不同，其中nmcA與nn·cR為部分重疊基因，這被認(rèn)為是一種較為經(jīng)濟(jì)的排列有限基因組的方式，也有較高的表達(dá)效率，可防止過多的無效表達(dá)。如前所述，AmpR在誘導(dǎo)劑存在時為正調(diào)控(激活子)，無誘導(dǎo)劑時為負(fù)調(diào)控(抑制子)；而NmcR和SmeR不管有無誘導(dǎo)劑

18、存在都為正調(diào)控方式，但調(diào)節(jié)基因編碼NmcR和SmeR的水平則依賴于誘導(dǎo)劑的存在，這一點與AmpR相同，不過，ImiR、NmcR和SmeR這些凋節(jié)蛋白都缺乏類似于SXXK、KTG、SDN的結(jié)構(gòu)域單元，因此認(rèn)為它們并不與-內(nèi)酰胺相互作用。smcR相對較低的表達(dá)水平可能是由于調(diào)控基因中缺乏SD序列，即核糖體結(jié)合位點(RBs)，而后者對翻譯水平可產(chǎn)生較大影響。B類金屬-內(nèi)酰胺酶也可通過啟動基因上的多點突變產(chǎn)生耐藥，但本類酶更多的是通過啟動子區(qū)上的插入序列(IS)為轉(zhuǎn)錄開始提供強(qiáng)啟動信號，從而造成-內(nèi)酰胺酶的高效表達(dá)。令人驚奇的是，在含有金屬-內(nèi)酰胺酶基因的脆弱擬桿菌中，超過80的菌株在啟動子區(qū)上都有不

19、同的插入序列。目前已被明確的插入序列有IS942、IS1186和IS435l，其中l(wèi)S942和IS1186有高效表達(dá)金屬-內(nèi)酰胺酶的能力，而IS4351只具有中效表達(dá)能力；此類插入序列極少存在于不含金屬-內(nèi)酰胺酶基因的脆弱擬桿菌中。6 結(jié)束語耐藥性是一個與特殊抗生素有密切關(guān)系的問題，而且是一個不可避免的問題，也不可能畢其功于一役，所以控制細(xì)菌耐藥性的策略不應(yīng)該是以限制使用抗生素為首，而是要對抗生素合理應(yīng)用?？刂撇呗越ㄗh：（1）采取適當(dāng)?shù)姆椒▉砜刂凭甑膫鞑ァ＃?）確定身體的某個部位或體液中的細(xì)菌是定制的還是真正被感染的。對定值細(xì)菌不需治療，對感染細(xì)菌才需要使用抗生素。（3）下策才是限制使用抗生

20、素（主要是限制使用：頭孢他啶，環(huán)丙沙星，萬古霉素和亞胺配能等高潛在耐藥性的抗生素）。 在合理利用抗生素的同時，我們也要加快對細(xì)菌耐藥的研究和新藥物的開發(fā)，未雨綢繆，為更多人和動物謀福利。參考文獻(xiàn)1 Bush KJacoby GAMedeiros AAA functional classification for -1actamases and its correlation with mo1ecular structureJAntimicrob Agents Chemother,1995，39：12112 Gonzalez LM，Perez-Dlaz JCAyala Jet alGene se

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