橡膠樹(shù)白粉菌致病相關(guān)基因及Mapk途徑相關(guān)基因的克隆和定量分析

1、橡膠樹(shù)白粉菌致病相關(guān)基因及Mapk途徑相關(guān)基因的克隆和定量分析橡膠樹(shù)白粉菌 (Oidium heveae B A. Steinmann) 是橡膠樹(shù)白粉病的病原菌 , 具有專性寄生的特性 , 對(duì)天然橡膠的產(chǎn)量有極大的影響。橡膠白粉菌的相關(guān)研究 主要集中在病原菌和寄主細(xì)胞學(xué)觀察、病害預(yù)測(cè)防治方面 , 而關(guān)于分子方面的研 究, 致病性相關(guān)基因及其功能鮮有報(bào)道。為驗(yàn)證橡膠樹(shù)白粉菌致病過(guò)程中基因的表達(dá)差異和調(diào)控機(jī)制 , 本實(shí)驗(yàn)在橡膠 樹(shù)白粉菌HO-73菌株基因組和與橡膠品系7-33-97互作轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上,篩選到 致病和MAPKt號(hào)途徑相關(guān)基因，監(jiān)測(cè)其在橡膠樹(shù)白粉菌致病過(guò)程中的表達(dá)差異， 為進(jìn)一步驗(yàn)證其

2、具體功能提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1用HO-73菌株 接種寄主培養(yǎng) 12d 新鮮孢子接種在抽芽 7-10d 葉齡橡膠葉片上 , 分別培養(yǎng)至 1d、 3d、 30d, 提取 RNA。在橡膠白粉菌基因組測(cè)序(未發(fā)表)基礎(chǔ)上,通過(guò)GO4釋,選取其中11個(gè)和致 病性相關(guān)的基因(GO 0009405),進(jìn)行克隆、qRT-PCF擴(kuò)增，分析其在致病過(guò)程中 的表達(dá)差異 , 并與轉(zhuǎn)錄組相對(duì)應(yīng)。結(jié)果表明：在 1dpi (day past infection),初次侵染器官附著胞、吸器等發(fā)育完成 ,Oh-Imp 、 Oh-hypothetical protein-4 為 上調(diào)基因 , 其可能與侵染初期侵染器

3、官的生長(zhǎng)相關(guān)； 3dpi 菌絲體生長(zhǎng)時(shí)期 , 代謝 基因 Oh-PC2 Oh-Gprotein beta subunit/AC1、Oh-EKA生長(zhǎng)基因 Oh-AAA)eroxin, Oh-RNP和 Oh-Imp;假定蛋白 Oh-hypothetical protein-1,2,3, 為上調(diào)基因，這些 基因可能與菌絲生長(zhǎng)密切相關(guān)； 30dpi 產(chǎn)生新生分生孢子階段 ,代謝基因 Oh-PC2, 生長(zhǎng)基因Oh-RNP假定蛋白Oh-hypothetical protein-1,2,3為上調(diào)基因，這些 基因可能與分生孢子產(chǎn)生有關(guān)。2、利用橡膠白粉菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和小麥白粉菌 (Blumeria grami

4、nis) 的同源 序列進(jìn)行比對(duì),獲得25個(gè)MAPKS號(hào)途徑相關(guān)基因。并運(yùn)用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及聚類 分析,構(gòu)建橡膠樹(shù)白粉菌中的MAPI級(jí)聯(lián)途徑簡(jiǎn)圖，共發(fā)現(xiàn)了 1個(gè)MAPI基因、1個(gè) MAPK基因和3個(gè)MAPKK基因,為繼續(xù)探究植物病原真菌 MAP信號(hào)途徑基因的 功能奠定了基礎(chǔ)。橡膠白粉菌在 parafilm 表面培養(yǎng) 0-24hpi(hours post inoculation) 的侵 染發(fā)育可大致歸納為未萌發(fā) (0hpi) 、萌發(fā) (4hpi) 、附著胞形成 (6 、 8hpi) 和次生 附著胞(16、24hpi)等4個(gè)形態(tài)發(fā)育階段；在此基礎(chǔ)上檢測(cè)MAPK!號(hào)途徑相關(guān)的 基因在 parafilm

5、表面的表達(dá)差異情況。在 4hpi 芽管生成時(shí),全部基因?yàn)樯险{(diào) , 上調(diào)倍數(shù)較大的基因有 20892、18727、8311和4961,證明MAPI途徑的Fus3and Ksslpathway在芽管生成時(shí)發(fā)揮主要作用；8hpi附著胞形成時(shí)，全部基因也都為 上調(diào)基因 , 上調(diào)倍數(shù)明顯增大的為基因 1505、 4241、 4865、 5368、 18727、 20892, 證明MAPK號(hào)途徑中的MEK1 Bkk1、Bck1和Wis4在附看胞形成過(guò)程中起主要 作用； 16hpi 吸器形成時(shí),4961 為下調(diào)基因 ,剩余為上調(diào)基因 ,明顯上調(diào)的基因?yàn)?1505、4241、9052、20892,證明在吸器形

6、成時(shí),MAPK途徑中的 Hog1MAPKathway 起主要作用； 24hpi 菌絲生成時(shí) ,全部基因?yàn)樯险{(diào) ,明顯上調(diào)的基因?yàn)?4241、4961、 8311、18727、9052和20892,證明在此階段起主要作用的為 MAPI途徑中的 Hog1pathway。用MAP信號(hào)途徑特異性外源抑制劑一一U0126處理,促使白粉菌在非誘導(dǎo)瓊 脂表面萌發(fā)并形成附著胞。在1.0%瓊脂培養(yǎng)介質(zhì)中加入濃度為10卩mol/L-30卩 mol/L 濃度梯度的 U0126。結(jié)果表明，隨抑制劑U0126的濃度增加，抱子萌發(fā)率明顯下降，且與未加入抑制劑的對(duì)照有顯著差異(P<0.05)。24hpi時(shí),10卩mol/L最終萌發(fā)率為57%