藻毒素復(fù)合污染對(duì)魚體的免疫毒性研究【開題報(bào)告】

1、畢業(yè)論文開題報(bào)告環(huán)境科學(xué)藻毒素復(fù)合污染對(duì)魚體的免疫毒性研究一、選題的背景和意義1. 選題背景湖泊富營(yíng)養(yǎng)化導(dǎo)致的藍(lán)藻水華已成為國內(nèi)外普遍關(guān)注的環(huán)境問題，它所帶來 的主耍危害z是產(chǎn)生的藻毒素對(duì)魚類的影響。在1發(fā)現(xiàn)的藻毒素屮，微囊藻毒 素(mcs)的分布廣、毒性大、危害嚴(yán)重，而備受關(guān)注。闡述了mcs對(duì)魚類的影 響。微囊藻毒索能干擾胚胎的發(fā)育，降低孵化率，增加畸形率，影響存活率，胚 胎孵化受微囊藻毒素影響還具有劑量依賴效丿野外室內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明尙類暴露于 微囊藻毒素后不僅可在肝臟中富集還可在肌肉、腸道等組織器官中快速積累；對(duì) 魚類進(jìn)行組織病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)mcs可導(dǎo)致肝臟、腎臟、心臟、腦、鮑等組織受損； mcs

2、在魚體中的解毒過程可能開始于由谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶催化的還原型谷胱甘 肽的結(jié)合反應(yīng)；mcs還可影響魚類的生長(zhǎng)、行為和血清生化指標(biāo)，此外，還具 有一定的免疫毒性。2. 選題意義通過比較兩種不同的mcs對(duì)魚的毒效應(yīng)及魚不同組織對(duì)mcs生化響應(yīng)的差 異，探討并歸納mcs的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和分了作用機(jī)制以及在食物鏈中傳遞過程中對(duì) 人類造成的潛在影響。為探討mcs的致再機(jī)理以及對(duì)人體的危害提供進(jìn)一步的 參考依據(jù)。二、研究目標(biāo)與主要內(nèi)容1. 研究目標(biāo)兩種典型微囊藻毒素mclr和mcrr體外低劑量復(fù)合條件下對(duì)尙體的免疫 毒性影響。2 主耍內(nèi)容(1) 藻毒素mclr單一作用下對(duì)魚體免疫細(xì)胞毒性；(2) 藻毒索mcrr單一

3、作用下對(duì)魚體免疫細(xì)胞毒性；(3) 不同濃度mclr和mcrr復(fù)合作用下對(duì)血體免疫細(xì)胞毒性；三、擬釆取的研究方法、研究手段及技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案等1.1研究對(duì)彖質(zhì)量為一斤左右的鯽魚若干，在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)一段時(shí)間之后，使得魚的一般性 狀都基木相同z后才作為被研究的對(duì)象。1.2實(shí)驗(yàn)方法取鯽魚體屮主要免疫器官腎臟和脾臟，剪碎之后，作為樣詁采集。25ml燒 杯裝一定量的pbs待用，用酒精棉將魚休消毒。從排泄口至胸鰭，然后沿胸鰭及 排泄口垂直剪至背部，將魚肚沿剪切線向外翻，觀察到內(nèi)臟里冇兩條暗紅色組織 即脾臟。小心用彎頭鐵了取出至pbs中，取完z后用鐵了彎頭處將內(nèi)臟拉至肚了 外面會(huì)在背部發(fā)現(xiàn)兩塊對(duì)稱的有薄膜包背

4、的組織，即腎臟。小心取用手術(shù)剪剪斷 連著的線，至此，殺仇取臟步驟完成。1. 3樣品的實(shí)驗(yàn)室制備(1) 用pbs漂洗至溶液基本透明，燒去多余的血及雜質(zhì)。(2) 用手術(shù)剪將取出物剪碎，剪5min以上，剪成勻漿狀。(3) 用100目不銹鋼網(wǎng)篩過濾至小燒杯中50ml,將25 ml潤(rùn)洗后一并倒入 至64 ml左右分離液。(4) 取16根無菌試管，分別加入4 ml淋巴細(xì)胞分離液，然后沿試管壁小 心慢慢加入4 ml細(xì)胞懸液(混勻)必須保證溶液的上下分層。加的時(shí)候耍越慢 越好。(5) 離心設(shè)定：4000r min'1,離心 20min。(6) 小心仔細(xì)吸收交界處呈乳白狀云霧層尙新試管屮，再次離心5mi

5、n,去 除上清液。(7) 取適量于nikon顯微鏡下計(jì)數(shù)，結(jié)果每小格二6個(gè)，細(xì)胞密度為 6x400x104.(8) 將細(xì)胞接種于24孔板，密度為1.8x106個(gè)/ ml /孔，14孔于27°c培 養(yǎng)箱屮培養(yǎng)待用。(iml)(9) 取 mccr 20mg/l,配置 1 u g/l, 10 u g/l, 50ug/l, 100ug/l, 500 u g/l, 1000 u g/l處理，誘導(dǎo)12小時(shí)，準(zhǔn)備2個(gè)平行樣。(10) 12小時(shí)后，小心將培養(yǎng)液離心(2000g10min)棄上清液。(為避免失敗，取/3屯泳，后備用)1.4 dma損傷實(shí)驗(yàn)研究方法取3.2.2中步驟6淋巴細(xì)胞(106ce

6、ll/ml)用受試毒素(3.1.2)處理12h后, 用愛思進(jìn)公司dna小量提取試劑盒提取淋巴細(xì)胞dna,運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳法: 制0.8%瓊脂糖凝膠，后按澳酚藍(lán)：dna1:1加樣，110v,電泳30min后eb染色, 觀察，分析毒素對(duì)dna損傷情況。1.5分析檢測(cè)方法1.5.1運(yùn)用細(xì)胞活性mtt檢測(cè)法，對(duì)毒素作用下淋巴細(xì)胞的存活率進(jìn)行檢 測(cè)。1.5.2運(yùn)用透射屯鏡觀察毒索作用下，魚體淋巴細(xì)胞的凋亡情況。1. 5. 3運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)藻毒素對(duì)淋巴細(xì)胞dna的損傷情況。四、參考文獻(xiàn)1 world health organization. algae and cyanobacteria i

7、n fresh water/ guidelines for safe recreatio nal water environmen ts,vol 1. coastal and freshwaters. geneva,switzerland,2003:136-15&2 dittmann e,neilan b a,borner t. insertional mutagenesis of a peptide synthetase gene that is responsible for hepatotoxin production in thecyanobacterium microcyst

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9、r treatment plants. toxicology andapplied pharmacology,2005,203：231-242.5 kenneth m,mackenthun,herman e f. a heavy mortality of fishes resulted from the decomposition of algae in the yahava rivecwilsconson.transactions of the american fisheries society,1945,75(1): 175-180.五、研究的整體方案與工作進(jìn)度安排(內(nèi)容、步驟、時(shí)間)1、2010. 1. 1-2011. 2. 20魚休免疫細(xì)胞休外分離實(shí)驗(yàn)完成樣品的分層采集工作，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)開展鮮樣的前處理及保存，分析測(cè)定 ph值和含水率等理化參數(shù)。2、2011.2.20-2011.3. 15細(xì)胞毒性測(cè)試實(shí)驗(yàn)兩種典型微囊藻毒素mclr和mcrr體外低劑量復(fù)合條件下對(duì)血體免疫毒性 影響。3、2011. 3. 15-2011. 3. 30 結(jié)論及