重組Ecoli生產(chǎn)類人膠原蛋白發(fā)酵調(diào)控策略與500L中試規(guī)模放大方法優(yōu)化

1、重組Ecoli生產(chǎn)類人膠原蛋白發(fā)酵調(diào)控策略與500L中試規(guī)模放大方法優(yōu)化西北大學(xué)博士學(xué)位論文重組E.coli生產(chǎn)類人膠原蛋白發(fā)酵調(diào)控策略與 500L中試規(guī)模放大方法優(yōu)化姓名：薛文嬌申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化工指導(dǎo)教師：范代娣20090610西北大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要本研究旨在建立一套完整的重組Escherichiacoli生產(chǎn)類人膠原蛋白(human, likecollagen. H LC)的中試規(guī)模生產(chǎn)工藝，并通過對(duì)各單元操作從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模到中 試規(guī)模的放大研究，為進(jìn)一步將該工藝放大到工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。重組Eco li的高密度培養(yǎng)是HLC生產(chǎn)過程的核心單元，其放大的成功與否直接關(guān)系到整個(gè)

2、工藝過程。 為了明確影響發(fā)酵過程的 關(guān)鍵因素，從而選擇合適的放大準(zhǔn)則和方法， 本文對(duì)發(fā)酵過程中二氧 化碳和乙酸的影響進(jìn)行了系統(tǒng)研究。盡管有大量文獻(xiàn)表明，二氧化碳對(duì)重組Eco li發(fā)酵有負(fù)面影 響，然而關(guān)于二氧化碳對(duì)重組Ecoli， 特別是重組蛋白表達(dá)方面 的定量研究卻未見報(bào)道。本研究采用二氧化碳脈沖法首次考察了重組 Eco li生長(zhǎng)不同階段二氧化碳濃度對(duì)重組蛋白生產(chǎn)的影響。研究結(jié)果表明，當(dāng)在分批培養(yǎng)階段施加濃度為2 0%(v/v)二氧化碳 脈沖時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制；而在補(bǔ)料階段引入該脈沖時(shí)，卻引 起了比生長(zhǎng)速率的小幅上升；二氧化碳對(duì)HLC表達(dá)的抑制只發(fā)生在 HLC的表達(dá)階段，即在蛋白表達(dá)誘

3、導(dǎo)階段引入濃度為2 0%(v/v)二氧化碳脈沖3小時(shí)，貝卩最終HLC濃度下降33.9%。盡管 二氧化碳脈沖的濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，其相應(yīng)的抑制或促進(jìn)作用 也越明顯，但當(dāng)二氧化碳脈沖濃度小于等于10%時(shí)， 對(duì)發(fā)酵過程卻 幾乎沒有影響。然后，針對(duì)重組Eco li發(fā)酵過程的關(guān)鍵問題一乙酸抑制作了 系統(tǒng)研究。研究結(jié)果表明，在分批培養(yǎng)階段乙酸對(duì)Eco li細(xì)胞有 明顯的抑制作用，但在補(bǔ)料培養(yǎng)階段，其影響卻并不明顯；而乙酸對(duì) HLC表達(dá)的抑制只發(fā)生在HLC的表達(dá)階段。 本文首次建立了這一 評(píng)價(jià)重組Eco li細(xì)胞生長(zhǎng)不同階段乙酸影響的方法。 而建立該法 的理論依據(jù)就是在葡萄糖饑餓階段，重組Eco li細(xì)

4、胞可以利用乙 酸。為此，本研究也首次討論了在細(xì)胞生長(zhǎng)不同階段，利用葡萄糖饑 餓以誘導(dǎo)乙酸吸收對(duì)發(fā)酵過程的影響。在發(fā)酵放大過程中，合適的種子擴(kuò)大培養(yǎng)過程的建立對(duì)于成功的 放大也至關(guān)重要。為了建立最優(yōu)的種子擴(kuò)大培養(yǎng)過程， 本研究考察了三級(jí)種子不同移種階段和不同種子培養(yǎng)基濃度對(duì)發(fā)酵過程的影響。結(jié)果表明：在對(duì)數(shù)期后期移種，HLC產(chǎn)率最咼；另外，當(dāng)種子培養(yǎng)基 葡萄糖濃度為2 0/L時(shí)，其后發(fā)酵過程所需的培養(yǎng)時(shí)間較短，HL C表達(dá)量較高，HLC平均產(chǎn)率最高，達(dá)到0 .5189/L/h。由乙酸的相關(guān)研究可知，乙酸對(duì)本表達(dá)體系具有較強(qiáng)的抑制作用， 因而本研究建立了以控制乙酸產(chǎn)生為根本目的的溶氧探測(cè)補(bǔ)料技術(shù)，

5、該技術(shù)具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，可在不中文摘要同的環(huán)境中迅速得到發(fā)酵過程的最佳補(bǔ)料方案。 采用溶氧探測(cè)補(bǔ) 料技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模獲得的最終細(xì)胞干重和HLC濃度分別為6 9.19/L和13. g,/L，該值與以前根據(jù)比生長(zhǎng)速率優(yōu)化 的結(jié)果基本一致。而放大到中試規(guī)模時(shí)，盡管乙酸濃度和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模 基本相同，優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)機(jī)后獲得的HLC表達(dá)水平也基本相同，但最終細(xì)胞干重和HLC濃度有一定程度下降， 分別為51.79/L和9.69/L。直接放大后HLC產(chǎn)量下降的原因之一可能是不同規(guī)模發(fā)酵罐 氧傳遞能力不同所致。針對(duì)該問題，通過測(cè)定不同規(guī)模發(fā)酵罐的體積 氧傳遞系數(shù)，并建立了體積氧傳遞系數(shù)對(duì)操作參數(shù)(通氣量、攪拌速 度

6、和裝液量)的關(guān)聯(lián)方程，使得不同規(guī)模的發(fā)酵罐在氧的傳遞方面具 有可比性。實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模發(fā)酵罐kLa值對(duì)操作參數(shù)的經(jīng)驗(yàn)關(guān)聯(lián)式為：(kLa) L=0.0111Qn3185NL5131VL 以中試規(guī)模發(fā)酵罐kLa值對(duì)操作參數(shù)的經(jīng)驗(yàn)關(guān)聯(lián)式為：（kLa）P=0.2690Q0.2983N1.2727V Ln枷最后，根據(jù)體積氧傳遞系數(shù)的關(guān)聯(lián)方程，分別以kLa和p決k La為放大基準(zhǔn)進(jìn)行放大。由于本發(fā)酵體系對(duì)二氧化碳較不敏感， 中 試規(guī)模（5 0 0 L）中加壓操作得到了成功應(yīng)用。即以pkLa為 放大基準(zhǔn)進(jìn)行放大規(guī)模的不誘導(dǎo)的分批. 補(bǔ)料培養(yǎng)，最終獲得的細(xì)胞 干重為7 7.9 9 /L，略低于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模培養(yǎng)獲得的

7、細(xì)胞干重（8 0.39/L），也低于以kLa為放大基準(zhǔn)獲得的中試規(guī)模培養(yǎng)的 最終細(xì)胞干重（9 0.oect,）。但以pkLa為基準(zhǔn)放大，初 始裝液量（285L）遠(yuǎn)高于以kLa為基準(zhǔn)放大時(shí)的初始裝液量 （1 0 5L）;誘導(dǎo)培養(yǎng)后，最終細(xì)胞干重達(dá)到6 8.4 9 /L，最終H LC濃度為13.09/L，基本同實(shí)驗(yàn)室規(guī)模。此外，本文還建立了 HLC中試純化工藝， 并對(duì)其中影響蛋白收 率和蛋白純度的主要工藝單元：高壓勻漿、沉淀、超濾及離子交換層 析進(jìn)行了放大研究。結(jié)果表明，高壓勻漿不用改變?nèi)魏尾僮鲄?shù)可直 接放大；超濾過程僅改變和膜面積相關(guān)參數(shù)也可得到滿意的放大結(jié)果； 對(duì)于沉淀單元，由于攪拌釜裝置變

8、化，在中試規(guī)模重新優(yōu)化了沉淀時(shí) 間：即沉淀7 0mi n后純化效果最好； 保持線速度恒定進(jìn)行層析單 元的放大也獲得了較好結(jié)果。中試規(guī)模純化工藝得到HLC的純度為 9 5.4%，收率為65.4%，與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化結(jié)果相比（HL C純度與收率分別為9 6.4%,71.7%）僅略有下降。關(guān)鍵詞重組大腸桿菌，類人膠原蛋白，二氧化碳脈沖，乙酸，氧傳遞，中試放大ii西北大學(xué)博士學(xué)位論文英文摘要髓獫 aimofthisinvestigationWil lstodevelopaprocessforproduct ionofonhumanlikecollagen (HLC) byr ecombinantlaya

9、Escherichiacolipilot sc ale. Inaddition, thestudywouldso undbasisforscalinguptoproduc tionscalefurther, throughscale upinvestigationsforunitoperat ionsoftheprocess.Highcelldensitycultureofrec ombinantEcoliisthekeyunitforH LCproductionanditsscaleupper formancewoulddeterminethewhol eprocessefficiency.

10、 Tofindthekechosethescaleupcriteriafactorsinfluencingthefermentatio nprocessandthusandacetateOilandmethodprope d5theeffectsofcarbondioxideCarbondioxideplaysaHLCprodu ctionwasstudiedfirstly. majorro leinbothaerobicandanaerobicfe rmentations.However,culturefewliteraturesfocusedon氌eeffectsofcarbontarge

11、tproteindioxi 如 onrecomb inant 互coliandproduction. Inthis paper, asystematicstudywasiniti allycarriedoutwiththemethodtoinvestigatetheinflu enceofcarbondioxideC02oncarbondioxidepulsecult ivationsystemofinjecfionthere combinant 置coli. mpulse 蠲ectionex perimentsshowedthat:l_) a20%C02pulseintroducedinth

12、ebatchcultivationphasesinhib itedcellgrowthobviouslywhilet hatintroducedinthefedbatchcu ltivationphasesstimulatedcell growthinhibitoryeffectofC02onslightly; and2) HLCexpressionoccurre donlyintheexpressionphase, wher etheby33。 9%underafinalHLCconcentrationdecreased3h20%C02puls e.Meanwhile,thehigherth

13、eC02concentrationan d/orthelongerthedurationofthe C02pulses, thestrongerthestimul atoryorinhibitoryeffects. Howev er,theC02concentrationbelowhadlittleinfluenceonorequaltol0%theHLCproduction.Then, asystematicstudywascardedouttodeterminetheeffectsofa cetateonthehighcelldensitycul tureofrecombinantEcol

14、icontain ingHLCmRNA. Inthisstudy, theeffe ctsofacetateassimilationthrou gha 番ucoseastarvationperiodatdifferen tcellgrowthphaseswereinitiall yinvestigatedinfedbatchcultu reofrecombinantEcoli。 Theresult sshowedthatonacetateassimilationwasobs ervedwithoutnegativeeffectsstarvationperiodtheprocessd uring

15、aglucoseintroducedatalld efinedcellgrowthphasesexceptf orthepostinductionphase。 Inadd ition, anewmethodforevaluatingt heeffectsofacetateWasdevelopm entbasedontheabovefindings:theacetateconcentrationwascontro lledbyaddingacetateintocultur e西北大學(xué)博士學(xué)位論文Finally, thescale upfermentat ionsbasedOilkLaandpkL

16、awereca rriedoutrespectively, according tothecorrelationsforkLacalcul ation. Becausetherecombinantsys temwaslesssensitivitytotheC02, pressurizedculturewassuccessf ulfortheHLCproduction. Thatis, f orthenon.inducedcultivation thefinalonthepilot scalebas edontheconstantpkLascaleupc riteria,onDCWandwas7

17、7. 9g/L, whichWassimila rtolowerthanthethat(80.3g/L)ob tainedthelabscaleoncultivati onvalue(90.0g/L)obtainedinthep ilot scalebasedtheconstantkLascaleupcriteria. However, theinitialmediumvolu mefortheformer ( 2 8 5 L) wasmuchhig herthanthelatter(105L) . Thefina 1DCWandHLCconcentrationwere6 8.4g/Landl

18、3. Og/Lrepectively,wh ichweresimilartothoseobtained onthelabscale, fortheinducedcu ltivationonthepilot scale.onTheprocess majorforHLCpurificationunit sthepilotscalewasalsodevelop edinthisrecoveryandstudy. Theop erationinfluencingHLCpuritywe rehomogenization, precipitation, ultrafiltrationandCM52chro

19、mat ography. Thescale upinvestigati onshowedlargerscalefortheareathat, l) theoperationparam eterscouldbedirectlytransferr edtothemembranehomogenization; 2)theproportionallyforoperationp arametersrelatedtothewere, incr easedwasscaling UPtheultrafil trationprocess; 3) theprecipitat iontimeoptimizedtha

20、nthatonthepilot scaleand theoptimizedprecipitationw. as7 Omin, whichislittlehigherthelab scale; 4) CM52chromatographysca ling upbasedononconstantlinea rvelocitywassuccessful. Thepuri tyandrecoveryofHLCreached95. 4%, 65.4%,repectively,whichweredec reasedslightlycomparedtothose (theputityandrecoverywe

21、re96. 4%, 71.7%,respectively)obtainedont helab scale.KeywordsRecombinantEcoli, human likec ollagen,CO2pulse,acetate,oxyge ntransfer,scaleupV英文摘要mediaand/oremployedaglucose starvationandthustheeffectsof acetateatdifferentcellongrowthphaseweredetermine d. Experimentalresultsshowthato bviousacetateinhi

22、bitioncellgrowthoccurredinthephas esofbatchculturewhileitsinhib itoryeffectonHLCexpressionocc urredonlyintheexpressionphase.Thedevelopmentofasuitablein oculumisimportanttotheferment ationprocess. Tooptimizetheinoc ulumpreparationprocess, thethir dinoculumtransferstageandmedi umweredetermined.TheWasr

23、esultsshowedthatHLCprod uctivityWashighestwhentheHlir datlatelyexponentiMinoculumtr ansferredstage; inaddition, when theglucoseconcentrationWas20g/L, thefol lowingfermentationtimeWasshor testandthefinalHLCconcentrati0. 518washighest, andthustheHLCaverageproductivitywashighes t(achievedg/L/h) .aAceta

24、tehadSOastrongnegativeinfluenceo ntheHLCproductionaccordingtot hiswork,tocontrolfeed backacetatecontrolledmethodthat theprobingfeedingstrategyWasd evelopedWastheproduction. Theme thodonemployedtomaintaindissolv edoxygenconcentrationatthesam elevelfinalbothlaboratoryscaleand pilotscalefermentations.

25、TheonD CWof69. lg/LandHLCconcentration ofl3.1g/Lwereobtainedresultsarethelaboratoryfina lscale.andthe51. 7g/Lsimilartothatoptimize dinthepreviousof9. 6g/Lwereobta inedstudy. TheonDCWofandHLCconc entrationthepilot scaleuponop timizationofinductiontiming.Thereasonforthedecreaseinth eHLCproductiononthe

26、pilotscale maybethelowervolumetricmasstransferoxyge ntransferrateforthepilot ? scale coefficientkLakLaonfermentor. Therefore, the differentscalefermentorswasde terminedandthecorrelationsbet weentherateandoperationparame ters(aeration,stirreroxygentransferandinitialmed iumvolume)werecouldbedevelope d

27、.Andthusthecapacitiesfordiffe rentfermentorscompared. ThecorrelationsforkLaonthelab scalefermentoriS,(kLa)L=0.OlllQ0.3185Nl'5"lVL n4舳3AndthecorrelationsforkLaonthepilot scalefermentoris, (kLa)P=0.2690Q0.29S3N他 72 7VLm404西北大學(xué)學(xué)位論文知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明書本人完全了解西北大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定。 學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版。 本人允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)西北大學(xué)可以將本學(xué)位論文的 全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索， 可以采用影印、縮印或掃 描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研 究所等機(jī)構(gòu)將本學(xué)位論文收錄到中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫或其它 相關(guān)數(shù)據(jù)庫。保密論文待解密后適用本聲明。學(xué)位論文作者簽名：簦璽蝰學(xué)位論文作者簽名：藿立酶1指導(dǎo)教 師簽名：1墨叢翌翌1竺笪：墅：型指導(dǎo)教師簽名：）礦礦7）年多月，礦日口/尹年多月，口日西北大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工 作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中