研究生實驗課件2011年12月15日修改

1、植物總蛋白提取及檢測方法實驗一 植物蛋白提取三氯醋酸-丙酮沉淀法 取1-2克材料于液氮充分研磨，加入10mL預(yù)冷的含10%三氯乙酸（TCA）、0.07%-巰基乙醇（可用DTT代替）的丙酮，充分混合后-20下冰浴過夜，然后離心（4，40000×g，1h），棄上清。在沉淀中加入10mL預(yù)冷的含0.07%DTT的丙酮，充分混合，-20下放置1h，離心（4，40000×g，1h），重復(fù)該步驟2-3遍。沉淀冷凍干燥蛋白然后分裝放入-80備用。取取純化后的晶體蛋白4.0mg，加入400µl裂解液（1mg蛋白：100µl裂解液）振蕩器上振蕩溶解，然后13200rpm離

2、心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70µl，-80保存。按20L/mg的比例加入蛋白裂解液（9mol/L尿素，4%CHAPS，1%IPG緩沖液，1%DTT，35 mmol/ L Tris），30水浴1 h，并不時振蕩，12 000×g 下離心10min。上清液中加入4倍體積的預(yù)冷丙酮，于- 20下放置至少2 h，4 000 ×g 下離心10min，沉淀用水化緩沖液（8 mol/L尿素，2% CHAPS，20mmol/ L DTT，0. 5%IPG緩沖液）溶解，重復(fù)該步驟1 2 遍。樣品溶液存于-75 下或直接用于電泳。用Bradford法在波長595nm定量蛋白

3、。試劑：1、提取液：含10%TCA和0.07%-巰基乙醇的丙酮。2、裂解液：2.7g尿素0.2g CHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中（終體積為5ml），IPGbuffer100µl（35mmol/L tris100µl）使用前再加入1M的DTT 65µl/ml（約50mg，現(xiàn)用現(xiàn)加）。3、液氮。實驗二 紫外吸收法檢測提取蛋白的濃度一 實驗?zāi)康?通過蛋白提取方法熟悉掌握使用酶標儀、紫外可見分光光度計分析檢測（或掃描）提取蛋白的濃度二 實驗原理由于蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有紫外吸收的性質(zhì)，其最大吸收峰在280nm波長處。在此波長時，

4、蛋白質(zhì)溶液的吸光度（A280）與其含量成正比關(guān)系，可用作定量測定。由于核酸在280nm波長也有光吸收，對蛋白的測定有干擾，但核酸的最大吸收峰在260nm處?？赏瑫r測定280nm和260nm波長的光吸收，通過經(jīng)驗公式計算可消除其對蛋白質(zhì)測定的影響。酶標儀其核心是一個比色計或分光光度計，一般要求測試液的最終體積在250µl以下。其基本工作原理與結(jié)構(gòu)和紫外可見分光光度計幾乎完全相同。酶標儀是以微孔板為比色容器的比色計，入射光通過板孔底部進入比色液體，利用板的移動更換比色對象。紫外可見分光光度計測定樣品容量大。三 實驗方法、步驟取1mg BSA用1ml超純水溶解，測定BSA標準曲線及樣品蛋白

5、含量。取 7個10ml的離心管，首先在5個離心管中按次序加入0µl，5µl，10µl，15µl，20µl 的BSA溶解液，另2管中分別加入2 µl的待測樣品溶液，再在每管中加入相應(yīng)體積的純水（總體積為100µl），然后，各管中分別加入5ml的Bradford液，搖勻，置室溫5min后測定吸光值，在595nm下按由低到高的濃度順序測定各濃度BSA的OD值，再測樣品 OD值。以標準蛋白濃度為x軸，OD值為y軸作標準曲線。1234567BSA蛋白質(zhì)標準溶液（µl）0510152022H20（µl）1009590

6、85809898蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）00.050.10.150.2A595OD值實驗三 提取蛋白的脫鹽純化處理一 實驗?zāi)康牧私獾鞍踪|(zhì)純化的方法，熟悉掌握蛋白脫鹽處理的純化方法二 實驗原理分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分離、細分離三步。（一）前處理分離純化某種蛋白質(zhì)，首先要把蛋白質(zhì)從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。為此，動物材料應(yīng)先提出結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免手單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當?shù)姆椒?，將組織和細胞破碎。動物組織和細胞可用電動搗碎

7、機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ɑ蛴美w維素酶處理也能達到目的。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎后，選擇適當?shù)木彌_液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質(zhì)等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質(zhì)細胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當介質(zhì)提取。

8、（二）粗分級分離當?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得后，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般用分離用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進行濃縮。（三）細分級分離樣品經(jīng)粗分級分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電點聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。

9、結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶過程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數(shù)量上占有優(yōu)勢時才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結(jié)晶過程中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白，因此蛋白的結(jié)晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。（四）蛋白質(zhì)分離純化的方法1 根據(jù)分子大小不同的純化方法（1）透析和超過濾（2）密度梯度離心（3）凝膠過濾2 利用溶解度差別的純化方法（1）、等電點沉淀和pH控制（2）蛋白質(zhì)的鹽析和鹽溶（3）有機溶劑分級分離法（4）溫度對蛋白質(zhì)濃度的影響3 根據(jù)電荷不同的純化方法（1）電泳（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳（

10、3）毛細管電泳（4）等電聚焦（5）層析聚焦（6）離子交換層析4 利用選擇性吸附的純化方法（1）羥磷石灰層析（2）疏水作用層析5 利用配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法親和層析（affinity chromatography）a.凝集素親和層析b.免疫親和層析c.金屬螯合層析d.染料配體層析e.共價層析三 實驗步驟（具體操作結(jié)合儀器講）AKATA 制備型液相色譜蛋白分析儀純化蛋白步驟首先將提取蛋白溶液抽濾，超聲波（主要是去除溶液中的氣泡）；檢查AKATA純化系統(tǒng) Ph探頭，接Ph計，接脫鹽柱（也可系統(tǒng)平衡后接，看說明書柱子流速、柱壓）開機（儀器自檢），點開Unicorn ，選 default，ok

11、；clear all （即出現(xiàn)流程圖界面）；首先將20%乙醇換為超純水（緩沖液）；Mannul，點任意選項，出現(xiàn)操作對話框，平衡系統(tǒng)；Pump-flow=1.0，execute，（注意：必須先設(shè)定流速，使其形成通路；即有流速時再作其他操作）。此時觀察柱壓，柱壓切記0.3Mpa；如果柱壓高，則要更長時間洗。柱壓基本穩(wěn)定時，洗泵：pump-pumpwashpurifier-A1 ONB1 ON execute；這項儀器自動完成；完成后自動恢復(fù)為上一步的狀態(tài)；此時還應(yīng)該注意柱壓。注意中間有多次平衡狀態(tài)出現(xiàn)：一種狀態(tài)進入另一種狀態(tài)時，一般要平穩(wěn)3個柱體積；此時可以洗上樣環(huán)；待平衡時換液：pause，A

12、1-A液B1-B液，continue，然后達到平衡態(tài)；洗泵：pump-pumpwashpurifier-A1 ON B1 ON execute；此時A泵走A液，B泵走B液 此時可以安裝脫鹽柱；待穩(wěn)定下來準備上樣：將流速降下來，flow=0.5 ，先是load（默認）狀態(tài)下，將蛋白溶液用注射器打入上樣環(huán)（上樣環(huán)是1ml的，所以一般最多上樣1 ml，否則浪費）；然后為inject狀態(tài)，execute，待走出2.5 柱體積時重新改為load狀態(tài)，平衡幾個柱體積；如果中間需上樣多次，load，execute；pause；加樣后，continue；Inject，execute；同樣圖上顯示2 ml 時改

13、狀態(tài)為load；此時出現(xiàn)蛋白峰，在峰上時接收；平衡后，洗脫。準備接收純化出的蛋白，流速flow=1.0，gradient；100%B8 min；execucte;待B%20% 時，設(shè)定 pump-outletvalve-feed，executefrac峰收集，0.5 ml，execute；首先出現(xiàn)的是雜蛋白的峰，也可以接收。一般第二個峰是目的蛋白。不再接收時，F(xiàn)rac=0，execute；pump-outletvalve-wasteF1曲線直到平行，然后再走幾個柱體積；B液已達100%，停止走B液：gradient=0 （即0%B）；time=0 min ;這時走A液，沖洗整個體系；之后，pa

14、use，將A，B液換為20%乙醇continue，洗系統(tǒng)；洗泵，步驟同上；洗feed 系統(tǒng)；之后feed 改為 wasteF1；取下脫鹽柱；洗上樣環(huán)；此時也會有柱壓過高的問題，可能是20%乙醇內(nèi)有氣泡造成的。洗好后，end關(guān)閉所有窗口，關(guān)機。實驗結(jié)束后，必須將系統(tǒng)清洗后，才能關(guān)機。四 試劑 1 20%酒精 2 樣品：離心過濾，10000×g以上，15min3 PBS緩沖液實驗四 雙向電泳分離植物提取蛋白一 實驗?zāi)康恼莆针p向電泳分離蛋白技術(shù)，熟悉儀器的操作使用二 實驗原理雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE），第一向電泳等電聚焦是基于等電點

15、不同而將蛋白粗步分離，第二向SDS-PAGE是基于蛋白質(zhì)分子量不同，而將一向分離后的蛋白進一步分離。這樣就可以得到蛋白質(zhì)等電點和分子量的信息。雙向電泳后，進行凝膠染色，掃描圖像，利用ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件對2-DE圖譜分析、比較。三 實驗步驟（一）樣品制備1 提取蛋白的溶解取純化后的晶體蛋白4.0mg，加入400µl裂解液（1mg蛋白：100µl裂解液）振蕩器上振蕩溶解，然后13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清分裝，每管70µl，-80保存。2 Bradford法標準蛋白濃度建立測蛋白含量（見前）（二） 雙向電泳第一向-

16、IEF（雙向電泳中一律使用超純水）1 水化液的制備稱取2.0mg 的DTT，用700µl水化液儲液溶解后，加入8µl 0.05 的溴酚蘭，3.5µl（0.5v/v）IPG buffer（pH 3-10）振蕩混勻，13200rpm離心15min 除雜質(zhì)，取上清。在含300µg 蛋白（經(jīng)驗值）的樣品溶解液中加入水化液，至終體積為340µl，振蕩器上振蕩混合，13200rpm離心15min除雜質(zhì)，取上清。 IPG膠條所需水化液體積膠條長度（cm）每條需水化體積（µl）7125112001325018350244502 點樣，上膠 分兩次吸取

17、樣品，每次100µl，（11cm膠條，樣品制備液60µl，水化液140µl）按從正極到負極的順序加入點樣槽兩側(cè)，再用鑷子撥開Immobiline DryStrip gels（11cm，pH 3-10）膠條，從正極到負極將膠條壓入槽中，膠面接觸加入的樣品。注意：膠條使用前，要在室溫中平衡30分鐘；加樣時，正極要多加樣，以防氣泡的產(chǎn)生；壓膠時不能產(chǎn)生氣泡；酸性端對應(yīng)正極，堿性端對應(yīng)負極；樣品加好后，加覆蓋油108ml，兩個上樣槽必須與底線齊平。3 IPGphor聚焦系統(tǒng)跑膠程序的設(shè)定（跑膠溫度為20） 方式一： S1（30v，12hr，360vhs，step） 50v

18、，5h，250vh S2（500v，1hr，500vhs，step） 100v，5h，500vh S3（1000v，1hr，1000vhs，step） 2000v，0.5h，1000vh S4（8000v，0.5hr， 2250vhs，Grad） 8000v，0.5h，4000vh S5（8000v，5hr，40000vhs，step） 8000v，5h，40000vh共計44110vhs， 19.5小時，其中S1用于泡脹水化膠條，S2和S3用于去小離子，S4和S5用于聚焦。方式二：溫度20°C最大電流0.05 mA per IPG strip樣品體積350 l （180 mm 長

19、IPG strip）電壓 時間30 V10-12 hours（水化）200 V1 hour500 V1 hour500 -> 8000 V30 min8000 V3 hours（IPG 4-7）；2 hours （IPG 4-9， 3-10L， 3-10NL）共計20000vh，19h左右方式三：4 平衡使用前每10ml平衡緩沖液中加入100mg DTT （相當于平衡緩沖液I），根據(jù)下表加入適量平衡緩沖液I和溴酚藍溶液。取出IPG膠條分別放入玻璃管中（支持膜貼著管壁，每個玻璃管中放入一條IPG膠條），用Parafilm封口，在振蕩儀上振蕩15分鐘，倒掉平衡緩沖液 I。 每10ml平衡緩沖

20、液加入400mg碘乙酰胺 （相當于平衡緩沖液II）。根據(jù)下表加入適量平衡緩沖液II和溴酚藍溶液。用Parafilm封口，在振蕩儀上振蕩15分鐘，倒掉平衡緩沖液 II。IPG膠條平衡液用量膠條長度（cm）建議平衡液體積（ml）/條溴酚藍溶液（l）7 2.5-512.5-25 115-1025-50 13 5-1025-5018 105024 1570用鑷子夾出膠條，超純水沖洗后，在濾紙上吸干（膠面，即接觸樣品那一面不能接觸濾紙，如果為18cm的膠條要將兩頭剪去），再以超純水沖洗，濾紙吸干（再次沖洗過程也可省略），然后用鑷子夾住膠條以正極端（即酸性端）向下，負極端（即堿性端）向上，放入用來平衡的試

21、管中（鑷子所夾的是堿性端，酸性端留有溴酚藍作為標記），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注：平衡時要注意保持膠面始終向上，不能接觸平衡管壁。（三）雙向電泳第二向-SDS-PAGE 1 配膠根據(jù)第一向IEF電泳時IPG膠條的大小選擇第二向合適的垂直電泳槽。Ettan DALT II 為大規(guī)模、高通量、高重復(fù)性雙向電泳第二向SDS-PAGE專門設(shè)計的垂直電泳槽。 同時進行12塊26 x 20cm板膠電泳，適于長至24cm IPG膠條。其灌膠模具每次最多可灌制14塊膠。通常不需要濃縮膠。12.5%Gel，40ml丙烯酰胺16.7ml1.5M Tris-Cl pH8.810ml10%SDS（十二

22、烷基磺酸鈉）400lAPS220lTEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）11l加水至40ml凝膠濃度與其對應(yīng)的分離范圍膠濃度分離范圍（KD）5% 36-2007.5%24-20010% 14-20012.5% 14-10015% 14-60灌制垂直SDS膠的配方10%T，2.6%C12.5%T，2.6%C15%T，2.6%C丙烯酰胺單體貯存液 33.3ml 41.7ml50ml4×分離膠緩沖液25ml25ml25ml10%SDS1ml1ml1ml去離子水40.2ml31.8ml23.5mlTEMED*33l33 l33 l過硫酸銨*（10%）500 l500

23、l500 l最終體積100ml 100ml100ml*TEMED和過硫酸銨在灌膠前再加 2 灌膠將玻璃板洗凈后，室溫晾干，然后，將電泳槽平衡好，玻璃板夾好，再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏膠，倒入飽和的正丁醇（或乙醇）壓膠，凝膠后（這時會出現(xiàn)三條線），用注射器吸去正丁醇，超純水洗兩次，再用濾紙除水。 3 轉(zhuǎn)移用去離子水潤洗IPG膠條一秒鐘，將膠條的邊緣置于濾紙上幾分鐘，以去除多余的平衡緩沖液。將IPG膠條放在位于玻璃板之間的凝膠面上，使膠條支持膜貼著其中的一塊玻璃板，用一薄尺將IPG膠條輕輕地向下推，使整個IPG膠條下部邊緣與SDS板膠的上表面充分結(jié)合。確保在IPG膠條與板膠之間以及玻璃板與塑料

24、支持膜間無氣泡產(chǎn)生，上面覆蓋預(yù)熱的0.5%瓊脂糖溶液2ml，使瓊脂糖在5分鐘內(nèi)凝固封膠?？蛇x操作：加入分子量標準蛋白。平衡第二次時，在沸水中煮Marker（與等體積的1%瓊脂糖溶液混合），剪兩個同樣大小的濾紙片，長度與一向膠條的寬度等同，然后吸取煮好的Marker，轉(zhuǎn)入SDS-PAGE膠面上，保持緊密貼合。4 跑膠電泳槽中裝滿電泳緩沖液，并打開溫控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)溫度為15。 設(shè)定恒定電壓或電流，Phase1：1W，1h、Phase2：10W，5h，跑電泳，共計6h。當溴酚藍染料遷移到膠的底部邊緣即可結(jié)束電泳。跑好的膠轉(zhuǎn)移到染色盒里固定，準備染色。SE600系統(tǒng)電泳參數(shù)，Constant curre

25、nt，15PhaseCurrentDuration110mA per gel15 min220mA per gelApproximately 5 hEttan Dalt II系統(tǒng)電泳參數(shù)，Constant power，20Phase CurrentDuration15w per gel45 min220w per gelApproximately 6 h共5-6個小時5 銀染（兩根膠條所用劑量）（銀染特別注意用超純水）（1） 固定30min 無水乙醇200ml乙酸50ml，用超純水定容至500ml。（2） 敏化30min 無水乙醇 150ml Na2S2O35H2O 1.5688g （無水：1

26、g） 無水乙酸鈉 34g （3H2O：56.4g） 戊二醛 0.65ml （現(xiàn)用現(xiàn)加） 先用水溶解Na2S2O35H2O和乙酸鈉，再加乙醇，最后定容至500ml。（3） 洗滌 5min × 3次。（4） 銀染 20min AgNO3 1.25g 用超純水定容至500ml。（5） 洗滌 1min × 2次（6） 顯影 無水Na2CO3 12.5g 用超純水定容至500ml 37甲醛 0.2ml，現(xiàn)用現(xiàn)加。（7） 終止 10min EDTA-Na22H2O 7.3g 用超純水定容至500ml。（8） 洗滌 5min × 3次。注：整個雙向電泳實驗中全部使用超純水，盡量

27、減少離子的影響。（四）掃描電泳圖譜，用ImageMaster 2D Platinum 6.0軟件分析提取蛋白點結(jié)合儀器講解（五）實驗相關(guān)試劑配制1 Bradford 工作液考馬斯亮藍G-250 10mg，溶于95%的乙醇5ml，加85%的磷酸10ml，蒸餾水加至20ml，過濾后置4保存，可用6個月。臨用前，用純水作10倍稀釋。2 裂解液（見前）3.水化液儲液（不含有IPG buffer，DTT，2.5ml）Final concentration AmountUrea（FW 60.06）8M1.2gCHAPS 2%（w/v）0.05g Bromophenol blue 0.002%（w/v）5l

28、Double distilled H2O To 2.5ml分裝貯存于-20。DTT和IPG buffer在用之前加入：每2.5ml 水化液加7mg DTT。如果膠內(nèi)上樣，則樣品液在用之前加入到2.5ml的水化液中。如果需要，尿素的濃度可以調(diào)高到9或者9.8M。4 溴酚藍儲液Final concentrationAmountBromophenol blue 1%100mgTris-base 50mM60mgDouble distilled H2O To 10ml5 平衡緩沖液（SDS equlibration buffer）（50mM Tris-cl pH8.8，6M Urea，30% glyc

29、erol，2% SDS，bromophenol blue，20ml）Final concentrationAmount1.5M Tris-cl，pH8.8（see solution F）50mM1mlUrea（Fw 60.06）6M7.21gGlycerol（87% v/v）30%（v/v）6.9ml（6.1ml，（99%）SDS（Fw 288.38）2%（w/v）0.4gBromophenol blue0.002%（w/v）4l 1% solutionDouble distilled H2OTo 20ml貯存于-20，這是一個貯存液，用之前在加DTT或者碘乙酰胺6 丙烯酰胺單體貯存液（30%

30、，Monomer stock solution，100ml）Final concentrationAmountAcrylamide（Fw 71.08）30%30.0gBis-acrylamide（N,N'-methylenebisacrylamide）（Fw 154.17）0.8%0.8gDouble distilled H2OTo 100ml0.45µm的濾紙過濾后儲存于4避光保存?zhèn)溆谩? 4×分離膠緩沖液（1.5M Tris-HCl， pH8.8，100ml）Final concentrationAmountTris-base（Fw 121.1）1.5M18.2

31、Double distilled H2O80mlHCl（Fw 36.46）Adjust to pH8.8Double distilled H2OTo 100ml用0.45微米的濾紙過濾，4可保存兩周。 8 10% SDS溶液（10ml）Final concentrationAmountSDS（Fw 288.38）10%（v/v）1.0gDouble distilled H2OTo 10 ml用0.45微米的濾紙過濾，室溫保存9 10%（w/v）過硫酸銨溶液（1ml）0.1g過硫酸銨溶于1ml去離子水中。此溶液需使用前新鮮配制。新鮮的過硫酸銨會發(fā)出“咔嚓”聲音。如果沒有聲音，則需要換新的藥品。1

32、0 電溶緩沖液（SDS electophoresis buffer，25mM Tris，192 mM glycine，0.1%SDS，5 liters) Final concentrationAmountTris base（Fw 121.1）25 mM15.1gGlycine （Fw 75.07）192mM72.1gSDS（Fw 288.38）0.1%（w/v）5.0gDouble distilled H2OTo 5000ml超純水定容5000ml，室溫保存。11 0.5瓊脂糖封膠液（Agrose sealing solution，10ml）Final concentrationAmountS

33、DS electophoresis buffer10mlAgrose （NA or M）0.5%50mgBromophenol blue0.002%（w/v）20l加熱溶解，不要超過60。附：雙向電泳簡易實驗步驟：（一）第一向等電聚焦1. 從冰箱中取-20冷凍保存的水化上樣緩沖液（不含DTT、IPG buffer）一小管（1ml/管），置室溫溶解。2. 在小管中加入0.01g DTT、 IPG buffer，各2.5ml，充分混勻。3. 從小管中取出400ml水化上樣緩沖液，加入100ml樣品，充分混勻。4. 從冰箱中取-20冷凍保存的IPG預(yù)制膠條（11cm pH 3-10），室溫中放置10

34、分鐘。5. 沿著聚焦盤或水化盤中槽的邊緣至左而右線性加入樣品。在槽兩端各1cm左右不要加樣，中間的樣品液一定要連貫。注意：不要產(chǎn)生氣泡。否則影響到膠條中蛋白質(zhì)的分布。6. 當所有的蛋白質(zhì)樣品都已經(jīng)加入到聚焦盤或水化盤中后，用鑷子輕輕的去除預(yù)制IPG膠條上的保護層。7. 分清膠條的正負極，輕輕地將IPG膠條膠面朝下置于聚焦盤或水化盤中樣品溶液上，使得膠條的正極對應(yīng)于聚焦盤的正極。確保膠條與電極緊密接觸。不要使樣品溶液弄到膠條背面的塑料支撐膜上，因為這些溶液不會被膠條吸收。同樣還要注意不使膠條下面的溶液產(chǎn)生氣泡。如果已經(jīng)產(chǎn)生氣泡，用鑷子輕輕地提起膠條的一端，上下移動膠條，直到氣泡被趕到膠條以外。8. 在每根膠條上覆蓋2-3ml礦物油，防止膠條水化過程中液體的蒸發(fā)。需緩慢的加入礦物油，沿著膠條，使礦物油一滴一滴慢慢加在塑料支撐膜上。9. 對好正、負極，蓋上蓋子。設(shè)置等電聚焦程序。10.聚焦結(jié)束的膠條。立即進行平衡、第二向SDS-PAGE電泳，否則將膠條置于樣品水化盤中，-20冰箱保存。（二）第二向SDS-PAGE電泳1.配制10%的丙烯酰胺