基因編輯CRISPER CAS9演示教學(xué)

1、基因編輯CRISPER CAS9 基因編輯技術(shù)基因編輯技術(shù) CRISPR/Cas 的研究進(jìn)程 CRISPR/Cas 的結(jié)構(gòu)、分類及作用機(jī)制 CRISPR/Cas 在基因治療中的應(yīng)用 存在問(wèn)題和展望基因編輯技術(shù) RNA干擾：大片段雙鏈RNA小分子干擾RNA二聚體酶DicerRNA+沉默誘導(dǎo)復(fù)合體RISC配對(duì)影響翻譯基因編輯技術(shù) 鋅指核酸酶 （ZFNs ） 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs） 基于特制的 DNA-結(jié)合特異性的蛋白質(zhì)系統(tǒng)，通過(guò)束縛核酸內(nèi)切酶的催化區(qū)域，調(diào)節(jié) DNA 結(jié)合蛋白，引起特定位點(diǎn)的靶向雙鏈 DNA 斷鏈。 人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)ZFNsZFNsTALENsTALENs將識(shí)

2、別特異DNA序列的TALEN與內(nèi)切核酸酶FokI偶聯(lián),可構(gòu)建成剪切特異DNA序列的內(nèi)切酶TALENs基因編輯技術(shù) 規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR/Cas）：通過(guò)一小段與靶向 DNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)的RNAs 及其引導(dǎo) Cas 蛋白，引起 DNA 位點(diǎn)特異性靶向雙鏈 DNA 斷鏈，產(chǎn)生靶基因修飾。 人工內(nèi)切核酸酶技術(shù)第二部分研究進(jìn)程研究進(jìn)程CRISPR/Cas 的研究進(jìn)程19871987年20002000年20022002年日本Ishino在大腸桿菌堿性磷酸酶基因附近第一次發(fā)現(xiàn)CRISPR串聯(lián)重復(fù)序列。Mojica發(fā)現(xiàn)這種串聯(lián)重復(fù)序列在原核細(xì)胞中廣泛存在?？茖W(xué)家正式命名CRISPR和Ca

3、s基因。20052005年發(fā)現(xiàn) CRISPR中的間隔序列來(lái)源于外源基因，并推測(cè)其可能與細(xì)菌和古生菌的獲得性免疫相關(guān)。CRISPR/Cas 的研究進(jìn)程20072007年20082008年20092009年Barrangou首次實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRISPR系統(tǒng)的獲得性免疫作用。Brouns發(fā)現(xiàn)間隔序列可以轉(zhuǎn)錄形成 crRNAs ，具有指導(dǎo) Cas 蛋白靶向干擾的作用。Marraffini 發(fā)現(xiàn) CRISPR/Cas系統(tǒng)系統(tǒng)的作用靶點(diǎn)是DNA。Hale 發(fā) 現(xiàn) III 型 B 亞 型 的CRISPR-Cas系統(tǒng)還可以靶向性切割RNA。20112011年Deltcheva 發(fā)現(xiàn) II 型 CRISPR-Cas

4、系統(tǒng)中另一個(gè)重要組分tracrRNA，它與 crRNA 結(jié)合形成二元復(fù)合體，指導(dǎo) Cas9 蛋白的定點(diǎn)剪切。Sapranauskas證實(shí) II 型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以異源性地表達(dá)在其它物種。CRISPR/Cas 的研究進(jìn)程20122012年20132013年20142014年珍妮弗杜德娜和艾曼紐夏邦杰首次體外證實(shí) Cas9 蛋白可以與靶DNA 特定位點(diǎn)結(jié)合并行使剪切作用。獲2015年生命科學(xué)突破獎(jiǎng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)首次被成功應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因編輯。解析Cas9蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。20152015年全新基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cpf1。CRISPR/Cas 的研究進(jìn)程2016年1

5、2月CRISPR/Cas重大進(jìn)展梳理1.Nature：發(fā)現(xiàn)兩種新的CRISPR系統(tǒng)：CasX和CasY系統(tǒng)2.Cell：首次發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯的“關(guān)閉開(kāi)關(guān)”3.Cell：發(fā)現(xiàn)兩種新的抗CRISPR蛋白：AcrIIA2和AcrIIA4，能阻斷來(lái)自釀膿鏈球菌的Cas9酶活性4.Nat Genet：利用CRISPR鑒定出潛在的HIV治療靶標(biāo)5.Science：利用CRISPRi鑒定出細(xì)胞生長(zhǎng)所需的499個(gè)lncRNA6.Nat Methods：開(kāi)發(fā)出自我編輯的CRISPR條形碼7.Cell：將CRISPR和單細(xì)胞RNA測(cè)序結(jié)合在一起分析基因功能 第三部分 CRISPR/Cas CRI

6、SPR/Cas結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 、分類、分類及作用機(jī)制及作用機(jī)制 CRISPR/Cas 的結(jié)構(gòu) CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列，實(shí)際上就是一種基因編輯器，是細(xì)菌用以保護(hù)自身對(duì)抗病毒的一個(gè)系統(tǒng)，也是一種對(duì)付攻擊者的基因武器。CRISPR/Cas 的結(jié)構(gòu) Cas 基因主要編碼核酸酶和 DNA 解旋酶等切割修飾核酸的相關(guān)的 Cas 蛋白。前導(dǎo)序列保守的重復(fù)序列區(qū)長(zhǎng)度為2148bp含有回文序列，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。間隔區(qū)由俘獲的外源DNA組成，類似免疫記憶。富含AT長(zhǎng)度為30050

7、0bpCRISPR/Cas 的分類間隔區(qū)俘獲外援DNACRISPR/Cas 的分類CRISPR/Cas9 的作用機(jī)制PAM：（protospacer adjacent motif）間隔相鄰基序，該序列由NGG3個(gè)堿基組成，位于 DNA 結(jié)合區(qū)域上游并且緊鄰結(jié)合區(qū)域處。幫助 crRNA 識(shí)別和獲取靶位點(diǎn)片段; 在干擾過(guò)程中幫助該核糖核蛋白復(fù)合物區(qū)分自身的 DNA 和外援入侵的DNA。CRISPR/Cas9 的作用機(jī)制PAM：（protospacer adjacent motif）間隔相鄰基序，該序列由NGG3個(gè)堿基組成，位于 DNA 結(jié)合區(qū)域上游并且緊鄰結(jié)合區(qū)域處。CRISPR/Cas9 的作用

8、機(jī)制tracrRNA ：(反式激活CRISPR RNA) 與CRISPR重復(fù)序列互補(bǔ)的一段25 bp 的核酸序列pre-crRNA：整合后的間隔序列首先被轉(zhuǎn)錄為CRISPR前體RNAcrRNA：pre-crRNA在RNase作用下進(jìn)一步加工形成 成熟的CRISPR源性小RNACRISPR/Cas9 的作用機(jī)制 將crRNA 與部分 tracrRNA融合成一條約 100 bp 的單鏈向?qū)ф? single guide RNA，sgRNA) ，使其同時(shí)具有crRNA 和 tracrRNA 的特性，并且在隨后的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，sgRNA同樣可以引導(dǎo) Cas9 切割目標(biāo) DNA。由于靶位點(diǎn)與 g RNA

9、特異互補(bǔ)的區(qū)域最多只有 20 nt 長(zhǎng)度因此，在設(shè)計(jì)g RNA 結(jié)合區(qū)域時(shí)也只能在 20 bp 的長(zhǎng)度內(nèi)。 sgRNACRISPR/Cas9 的作用機(jī)制Cas9 核酸酶中存在一種晶體結(jié)構(gòu)識(shí)別瓣葉 （REC）：核酸酶瓣葉 （NUC）HNHRuv C PAM 區(qū)域（5-GG-N18-NGG-3）RuvC：Cas9氨基末端，剪切crRNA非互補(bǔ)鏈。HNH：Cas9蛋白質(zhì)中部，剪切crRNA的互補(bǔ)DNA鏈。識(shí)別并結(jié)合 g RNA 和目標(biāo) DNA 的復(fù)合體。CRISPR/Cas 的作用機(jī)制將CRISPR/Cas系統(tǒng)用于其它非細(xì)菌細(xì)胞需要滿足兩個(gè)條件：Cas酶，用于切斷靶標(biāo)DNA，比如目的基因中的DNA片

10、段；導(dǎo)向RNA（gRNA）的RNA分子，這種分子能通過(guò)互補(bǔ)結(jié)合靶標(biāo)。CRISPR/Cas9 的作用機(jī)制CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫機(jī)制的3 個(gè)階段新的間隔序列的獲??；CRISPR/ Cas 系統(tǒng)的表達(dá)，包 括 轉(zhuǎn) 錄 和 轉(zhuǎn) 錄 后 的 加 工； CRISPR/ Cas 系 統(tǒng) 對(duì) 外 源 基 因 的 干 擾。易錯(cuò)配的非同源性末端連接高保真性的同源重組修復(fù) 先從同源DNA母鏈上將相應(yīng)核苷酸序列片段移至子鏈缺口處，再用新合成的序列補(bǔ)上母鏈空缺。CRISPR/Cas9 對(duì) DNA 損傷的修復(fù) 為了避免DNA或染色體斷裂的滯留，強(qiáng)行將兩個(gè)DNA斷端彼此連接在一起的一種特殊的DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制。第四

11、部分在基因治療中的應(yīng)用在基因治療中的應(yīng)用CRISPR/Cas 在基因治療中的應(yīng)用 對(duì)于功能缺失型突變引起的基因遺傳病，可利用CRISPR/Cas9 將功能基因片段插入，改正引起疾病的突變體; 對(duì)于顯性基因遺傳病，可利用 CRISPR/Cas9引起 NHEJ 使顯性致病基因切除; 對(duì)于基因重復(fù)復(fù)制所引起的疾病，CRISPR/Cas9用多個(gè) sgRNA 同時(shí)引起多個(gè) DSB 切除重復(fù)區(qū)域。 CRISPR/Cas9 也可直接用于體細(xì)胞定向基因編輯，將細(xì)胞在體外進(jìn)行定向編輯，再融入患者體內(nèi)，定向修飾基因。CRISPR/Cas9 在 HIV-1 病毒治療中的應(yīng)用 HIV-1基因的表達(dá)由長(zhǎng)末端重復(fù)序列(L

12、TR) 啟動(dòng)子和增強(qiáng)子活性調(diào)控。構(gòu)建敲除LTR 的 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)破壞 HIV-1 基因組中長(zhǎng)末端重復(fù)序列( LTR) 啟動(dòng)子，從而大大地降低了 HIV-1 在感染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。利用CRISPR鑒定出潛在的HIV治療靶標(biāo) 利用CRISPR對(duì)源自HIV敏感性的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的一種細(xì)胞系進(jìn)行篩選，研究人員描述了如何利用CRISPR 篩選HIV感染但不是細(xì)胞存活所必需的人基因的方法鑒定出5個(gè)基因。當(dāng)讓它們失活時(shí)，會(huì)讓細(xì)胞免受HIV感染，同時(shí)不會(huì)影響細(xì)胞存活。 除了CD4和CCR5之外，這種篩選方法鑒定出編碼兩種酶的基因-TPST2和SLC35B2：它們對(duì)CCR5進(jìn)行修飾以便HIV結(jié)合

13、。 另一個(gè)被鑒定出的基因是ALCAM，它參與細(xì)胞間粘附。當(dāng)CD4陽(yáng)性T細(xì)胞接觸低水平HIV病毒時(shí)，ALCAM缺失與顯著地抵抗HIV感染相關(guān)聯(lián)。CRISPR/Cas9 與 iPS 技術(shù)共同用于基因治療 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 3B( DNA-Methyltransferase 3B，DNMT3B) 基因突變引起免疫缺陷，著絲粒不穩(wěn)定，面部異常綜合征( ICF) 。 Cas9 載體定向打靶 DNMT3B 基因的 sgRNA 載體 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 (iPS) 細(xì)胞 成功破壞 DNMT3B 等位基因的 iPS 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9移除細(xì)胞中的HAT酶增加胰島素產(chǎn)生 組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）

14、在調(diào)節(jié)基因TXNIP中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在高血糖水平情形下，TXNIP導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并且降低胰島素產(chǎn)生。 研究人員對(duì)來(lái)自2型糖尿病患者和來(lái)自健康人的產(chǎn)生胰島素的胰島進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病細(xì)胞中的HAT基因活性比健康細(xì)胞高出2倍。 利用CRISPR/Cas9，瑞典隆德大學(xué)糖尿病中心的研究人員移除遺傳密碼中控制來(lái)自大鼠的產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞中的HAT酶功能的序列。這導(dǎo)致TXNIP基因活性下降，因而降低細(xì)胞死亡和增加胰島素產(chǎn)生。第五部分存在問(wèn)題和展望存在問(wèn)題和展望CRISPR/Cas 脫靶效應(yīng)及改進(jìn)方法 脫靶效應(yīng)是由于 Cas9 蛋白可容忍 sgRNA 和靶向DNA在 5端的錯(cuò)配。Cas9進(jìn)入細(xì)胞

15、后，有可能在非目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行酶切，從而導(dǎo)致脫靶。降低 Cas9 和sgRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)濃度減少sgRNA 5端的互補(bǔ)序列，與沒(méi)有減短的 sgRNA 打靶活性相同，但大大降低了脫靶位點(diǎn)引起的突變效應(yīng)，同時(shí)提高了 sgRNA DNA 錯(cuò)配的敏感性，從而降低突變效應(yīng)。改造 Cas9 蛋白結(jié)構(gòu)。Cas9 突變體 Cas9n 切口酶切割產(chǎn)生的單鏈缺口會(huì)被高保真性的堿基切除修復(fù)途徑( base-excision repair，BER) 修復(fù)，不會(huì)在基因DNA 上造成突變。通過(guò)兩個(gè) Cas9n 產(chǎn)生兩個(gè)單鏈 DNA斷裂( single-strand break，SSB) 或在不同 DNA 鏈上產(chǎn)生缺口以造

16、成雙鏈 DNA 斷裂的策略，可有效避免脫靶突變。CRISPR/Cas 脫靶效應(yīng)及改進(jìn)方法脫氨基反應(yīng)形成去嘧啶位點(diǎn)（AP位點(diǎn)）糖苷水解酶能特異性切除受損核苷酸的N-糖苷鍵AP核酸內(nèi)切酶切開(kāi)受損核苷酸的糖苷-磷酸鍵，并移去包括AP位點(diǎn)核苷酸在內(nèi)的小片段DNACRISPR/Cas 的安全隱患 借助病毒載體把編碼Cas9的DNA帶入細(xì)胞。在Cas9完成切割任務(wù)之后細(xì)胞仍會(huì)繼續(xù)生產(chǎn)這種蛋白，機(jī)體可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)。 基因編輯的細(xì)胞會(huì)死亡，患者需要進(jìn)行多次治療。 基因?qū)牒途庉嬐緩蕉紩?huì)受病毒載體可攜帶DNA量的限制。目前必須使用兩種不同的病毒載體將CRISPR組件導(dǎo)入到細(xì)胞中，這比使用單個(gè)載體效率更低

17、。CRISPR/Cpf12015 年 9 月，張鋒等又找到了一種新型的 CRISPR系統(tǒng)CRISPR/Cpf1，與Cas9相比，Cpf1有以下三大優(yōu)勢(shì)：Cpf1剪切DNA只需要一個(gè)小RNA分子，Cpf1酶比標(biāo)準(zhǔn)的SpCas9要小，更容易進(jìn)入組織和細(xì)胞。Cpf1剪切后形成兩個(gè)不同長(zhǎng)度的鏈，粘性末端讓DNA插入更可控。Cpf1剪切時(shí)離識(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)，在編輯位置的選擇上有了更多的選項(xiàng)。CRISPR/Cpf1 CRISPR/Cpf1系統(tǒng)能夠克服Cas9靶向多個(gè)基因位點(diǎn)的限制。研究表明，Cpf1加工自身CRISPR RNA (crRNA)的能力可用于簡(jiǎn)化多重基因組編輯。使用單個(gè)定制的CRISPR陣列（array），研究人員實(shí)現(xiàn)了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中同時(shí)編輯多達(dá)4個(gè)基因，在小鼠大腦中同時(shí)編輯3個(gè)基因?；蚓庉嬌婕暗膫惱韱?wèn)題 Cas9 蛋白識(shí)別的 PAM 序列 ( 5 AGG 3) 在人類基因組中平均每 8 個(gè)堿基就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)。 2015 年3月，我國(guó)中山大學(xué)的研究小組利用CRISPR / Cas9 基因編輯技術(shù)對(duì)人類胚胎中導(dǎo)致 型地中海貧血癥的基因進(jìn)行修飾。 他們針對(duì)致病基因設(shè)計(jì)和生成了 3 個(gè) gRNA，并將其與 CRISPR /Cas9 基因一起重組進(jìn)表達(dá)載體中，然后注入收集到的 86 個(gè)三原核胚胎，結(jié)果獲得 71 個(gè)存活胚胎，