影響體細(xì)胞胚胎文化的ChorisiaSpeciosa的因素

1、摘 要為使美麗異木棉快速且高品質(zhì)的繁殖，掌握影響美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞培養(yǎng) 的因素，進(jìn)行了美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，美麗異木 棉植物體細(xì)胞胚的培養(yǎng)，第4次繼代培養(yǎng)美nhf異木棉胚性愈傷組織產(chǎn)生率最高，為16%; 平板培養(yǎng)出現(xiàn)愈傷組織的概率為8.3%。關(guān)鍵詞美麗異木棉組織培養(yǎng)影響因素factors effecting somatic embryo cultures of chorisia speciosasong yiyangabstract： in order to mastering the effecting factors of somatic embryo

2、culturesof chorisia speciosa. to propagating rapid and high quality.，an experiment was implemented about somatic embryo cultures of chorisia speciosa. the test results show that the chorisia speciosa plant cultivation of somatic embryogenesis，fourth successive transfer culture beautiful vision kapok

3、 embryonic callus have the highest rate，16%; the plate culture appears the probability of callus was 8.3%.key word： chorisia speciosa tissue culture factors effecting1引言美hlm異木棉q chorisia speciosa）又稱南美木棉或美人樹，是木棉科好木棉展植物， 此植物高約10-15米，花期在冬季，約3個(gè)月，是優(yōu)良的觀賞喬木，樹干呈濃綠色， t部膨人，成樹如酒瓶狀，且具有圓錐狀皮刺，也常作為高級(jí)行道樹。春季種子即可 成熟。

4、在廣州，種子一般在10至12月份成熟，常采用隨采隨播的播種繁殖方式。發(fā) 芽率可高達(dá)90%,但時(shí)間推移，發(fā)芽率會(huì)降低。這種繁殖方式對(duì)季節(jié)時(shí)間的要求較高， 繁殖率較為不穩(wěn)定，同時(shí)容易產(chǎn)生性狀分離，不能保證植物的優(yōu)勢(shì)。迄今為止，國(guó)內(nèi)外有關(guān)美麗異木棉的研宂較少。世界權(quán)威的園藝書籍（hortusthird 和the new york botanical garden illustrated encyclopedia of horticulture均認(rèn)為美麗 異木棉樹種唯一的繁殖方式是種子繁殖m。李虬曾對(duì)木棉科植物引種及繁殖做了研究, 研究表明，美麗異木棉是上世紀(jì)70年代末、80年代初被引入我國(guó)，至199

5、6年我國(guó)僅 存有4株，分別存于華南植物園，廣州市園林科研所，海南尖峰嶺樹木園。但十多年， 我國(guó)的4株美麗異木棉均不能自然結(jié)實(shí)。人工自花授粉技術(shù)也不能使其結(jié)實(shí)1。由此 推斷，美麗異木棉在我國(guó)難以有性繁殖。隨著吋間流逝，技術(shù)進(jìn)步，環(huán)境氣候的改善，肖珍泉等人對(duì)美麗異木棉的種子繁 殖方式和栽培管理技術(shù)做了研究；研究表明，美麗異木棉在廣州地區(qū)可以自然結(jié)實(shí)， 結(jié)實(shí)期在每年的4一5月，但結(jié)實(shí)量不多，一棵胸徑30cm的美麗異木棉也只能結(jié)兒 個(gè)果，每一個(gè)果大概有80-120粒種子。稍微用力擠壓，成熟的果實(shí)便會(huì)開裂，如果 結(jié)實(shí)期未能對(duì)果實(shí)及時(shí)采摘，便會(huì)造成果實(shí)開裂，種子便隨綿毛飛走，且任何方式不 能有效的改善種子

6、的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)2。美麗異木棉在我國(guó)的繁殖問題仍舊是我國(guó)美麗異木棉方向需要重點(diǎn)解決的問題之 一。愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)的培養(yǎng)周期較短，能大量快速的培養(yǎng)結(jié)構(gòu)完整且性狀較為 單一的植物體。愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)在細(xì)胞水平上進(jìn)行遺傳操作為高等植物品種改 良提供了可靠的依據(jù)和有效途徑。此次實(shí)驗(yàn)通過美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)的 方法對(duì)美麗異木棉進(jìn)行培養(yǎng)研究，以期找出美麗異木棉快速且穩(wěn)定繁殖的方法。2材料與方法2.1植物材料供試材料：來自肇慶地區(qū)的美麗異木棉，取成年樹上的嫩枝進(jìn)行離體培養(yǎng)所產(chǎn)生 的愈傷組織作為實(shí)驗(yàn)材料。2.2 方法2.2.1取材取肇慶地區(qū)美麗異木棉離體培養(yǎng)所產(chǎn)生的愈傷組織進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。

7、2.2.2組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的配方：（1 ）ms+1 mg/ml6-ba+0.3mg/mlnaa+0.1 mg/mltdz+3%蔗糖+0.8%瓊脂（ph5.8）（2）ms+lmg/ml6-ba+0.3mg/mlnaa+0.1nig/mltdz+3%蔗糖（ph5.8）美麗異木棉愈傷組織的繼代： 取一瓶木棉愈傷組織，擰開蓋子前在酒精燈上烤瓶蓋30s左右，打開蓋子，烘 烤瓶口 30s.取一瓶培養(yǎng)基，用同樣方法處理。 取一塊木棉愈傷組織迅速夾到新的培養(yǎng)基屮。此步驟需在靠近火焰處完成，但 要注意防止愈傷被高溫燙死。 將愈傷組織放到培養(yǎng)基（配方）上后便可以封蓋，消毒步驟同。 20d后觀察繼代。美麗異木棉細(xì)胞懸

8、浮培養(yǎng)： 用鑷子夾取在固體培養(yǎng)基上繼代產(chǎn)生的胚性愈傷組織，接種在培養(yǎng)基（配方（2）, 將搖床轉(zhuǎn)速為120r/min,溫度為26°c，黑暗培養(yǎng)。 用移液槍吸取lml的懸浮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入至新鮮培養(yǎng)基（配方）中，每隔4d繼代 一次，放入搖床，進(jìn)行培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)3代后逐漸形成穩(wěn)定的細(xì)胞系美麗異木棉t板培養(yǎng)： 將己滅菌溫?zé)岬呐囵B(yǎng)基（配方）倒在培養(yǎng)皿屮 用移液槍吸取lml的木棉愈傷懸浮培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)基表面，密封，培養(yǎng) 定期進(jìn)行觀察。3結(jié)果與分析3.1美麗異木棉植物愈傷組織的轉(zhuǎn)接用配方的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，初期20天后出現(xiàn)胚性愈傷組織（多為分散性較 好、較為疏松的愈傷組織，顏色多為嫩黃嫩綠，如圖1）。在

9、此次試驗(yàn)期間共進(jìn)行了 10次美麗異木棉的轉(zhuǎn)接，胚性愈傷組織發(fā)生率出現(xiàn)差異。圖i胚性愈傷組織3.1.2繼代次數(shù)對(duì)美麗異木棉愈傷組織的影響表1美麗異木棉繼代次數(shù)情況表繼代次數(shù)（次）胚性出現(xiàn)胚愈傷接種數(shù)成活數(shù)性愈傷成活率組織（瓶）（瓶）組織數(shù)（）發(fā)生（瓶）率（%）19040244.44524023257.58325101401041061601651510166.7106201628012.5720161806.25820161806.25920171855.81020100()<誰鏈20123456789繼代次數(shù)（次）圖2繼代次數(shù)對(duì)成活率的影響從圖2可以看出，成活率雖然第3次繼代出現(xiàn)了最低值

10、，但隨著繼代次數(shù)的增 加，總體仍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。愈傷組織的擴(kuò)繁，是繼續(xù)植物體細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)，所以 隨著繼代次數(shù)的增加，成活率逐漸增加，但后期趨于穩(wěn)定。20()<胡靶5sb?e銅史、岧123456789繼代次數(shù)（次）圖3繼代次數(shù)對(duì)胚性愈傷組織發(fā)生的影響從圖3可以看出，雖然隨著繼代次數(shù)的增加胚性愈傷組織的發(fā)生率出現(xiàn)了波動(dòng)。但總而言之，隨著繼代次數(shù)的増加，胚性愈傷組織的發(fā)生率是先增加后降低的。 胚性愈傷組織發(fā)生率最高為16%，最低為5%,胚性愈傷組織發(fā)生率在第4次達(dá)到 了最大值。由此可見胚性愈傷組織發(fā)生率較低，在此次實(shí)驗(yàn)中，胚性愈傷組織發(fā)生 率最高是第四次的繼代。3.2美麗異木棉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)用配

11、方的培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，約4天繼代一次，每一周期繼代2次，此次試驗(yàn) 共進(jìn)行了3個(gè)周期。在此過程中每一周期第一代與第三代木棉細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的差異， 第一代培養(yǎng)液顯得較為清澈，培養(yǎng)液中還存在細(xì)小的美麗異木棉胚性愈傷組織顆粒， 第三代培養(yǎng)液顯得較為渾濁且不再看見胚性愈傷組織顆粒，如圖4:圖4美麗異木棉體細(xì)胞第一代（左）與第三代（右）對(duì)比3.3美麗異木棉平板培養(yǎng)用配方的培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，在此實(shí)驗(yàn)過程中，共進(jìn)行了 3個(gè)周期，每 一周期倒4個(gè)平板，有1個(gè)平板在倒平板后第三周出現(xiàn)了星點(diǎn)愈傷組織，如圖5; 剩余11個(gè)既沒有出現(xiàn)菌落，也不曾長(zhǎng)出愈傷組織，如圖6。圖5第三周出現(xiàn)了星點(diǎn)愈傷組織圖6未曾出現(xiàn)任何結(jié)果

12、表2各種結(jié)果出現(xiàn)的概率占平板培養(yǎng)的行分?jǐn)?shù)（）培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)愈傷組織數(shù)帶丨個(gè)8.3培養(yǎng)肌內(nèi)未出現(xiàn)結(jié)果的數(shù)呈11個(gè)91.7由表2可以看出，培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)愈傷組織的數(shù)量為8.3%,培養(yǎng)皿內(nèi)未出現(xiàn)結(jié)果的數(shù)量為91.7%。所以由此可見木棉的美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)成活較 低。4、討論美麗異木棉愈傷組織在 ms+lmg/ml6-ba+o.3mg/mlnaa+o.lmg/mltdz+3% 蔗糖 +0.8%瓊脂培養(yǎng)基中20天后觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織變成了黃色顆粒狀松脆、透明的小球體, 這樣的愈傷組織是胚性愈傷組織。胚性愈傷組織對(duì)于體細(xì)胞胚胎的發(fā)生具有重要的意 義。胚性愈傷組織具有親本的遺傳特征，分裂活性強(qiáng)，有利于

13、在分化培養(yǎng)基上再生完 整的植株。要使懸浮培養(yǎng)快速、有效的進(jìn)行，不能缺少合理的轉(zhuǎn)速、適宜的溫度。由于植物 細(xì)胞液泡di細(xì)胞體積的95%。植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要由纖維素組成，這些使得植物細(xì) 胞對(duì)剪切力的敏感性要高于微生物，一般轉(zhuǎn)速控制在90120r/min培養(yǎng)物物在搖床 中受力較為均勻生長(zhǎng)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。暗處理有利于誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生。在此實(shí)驗(yàn)中，美麗異木棉胚性愈傷組織在第六次繼代時(shí)胚性愈傷組織的發(fā)生率達(dá) 到最高，說明在第四次繼代對(duì)美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)最好。平板培養(yǎng)出現(xiàn) 愈傷組織的概率為8.3%。終上所述，木實(shí)驗(yàn)認(rèn)為第六次繼代對(duì)美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)的效果最 好，產(chǎn)生率最高，達(dá)到16%

14、。平板培養(yǎng)愈傷組織出現(xiàn)率較低，為8.3%。此結(jié)果表明了 繼代對(duì)美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)的影響為美麗異木棉的快速且穩(wěn)定繁殖提供 了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于此次實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，約為一年，經(jīng)過了四季，季節(jié)對(duì)愈傷組織成活率也具冇 一定影響，但此次實(shí)驗(yàn)，未曾對(duì)此加以研究，是木次實(shí)驗(yàn)的欠缺之一。由于實(shí)驗(yàn)周期 較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)后期樣本數(shù)量較少，可能存在誤差。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)美麗異木棉愈傷組織體 細(xì)胞胚培養(yǎng)以及美麗異木棉愈傷組織體細(xì)胞胚培養(yǎng)的影響因素進(jìn)行了初步研究，相關(guān)研究還有待進(jìn)一步開展。參考文獻(xiàn)i 李虬，陳惠明.木棉科植物引種及繁殖研究j.廣東園林，1996(04)2尚珍泉，劉湘源，費(fèi)盛強(qiáng)，等.美麗異木棉的種子繁殖與栽培

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