細(xì)胞培養(yǎng)集錦(一個(gè)培養(yǎng)300多種細(xì)胞人的經(jīng)驗(yàn)總結(jié))

1、細(xì)胞培養(yǎng)集錦(一個(gè)培養(yǎng)300多種細(xì)胞人的經(jīng)驗(yàn)總結(jié))一、消化與吹打版上很多朋友討論細(xì)胞培養(yǎng)問題，見到很多很好的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，這里說一些我個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，因?yàn)橐恍┍容^特殊的原因，我自己培養(yǎng)接觸過近300種細(xì)胞，常用于做實(shí)驗(yàn)的，累積有百余種，可以說遇到過許多各式各樣古怪的細(xì)胞。這里挑細(xì)胞消化開始做我的第一篇專題，并不是因?yàn)榧?xì)胞消化最重要，而是近期看到大家頻繁討論這個(gè)話題，我就拋磚引玉，下面幾點(diǎn)拙見，可能與其它朋友總結(jié)的一些經(jīng)驗(yàn)有點(diǎn)出入，僅供大家參考。許多同學(xué)對細(xì)胞消化做了許多研究，得出了很多有價(jià)值的經(jīng)驗(yàn)，也見到很多人的困惑。其實(shí)細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就消化而言，不是太難，做得多了，善于總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，就能

2、把細(xì)胞越養(yǎng)越好。一般的程序步驟，細(xì)節(jié)操作，我這里就不講了，只講一些基本操作背后的知識，如果不對之處，歡迎指正，一起討論：1，其實(shí)絕大部分細(xì)胞消化的時(shí)候是只要用胰酶潤洗一遍即可，吸去胰酶后，殘留的那些無法計(jì)算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。2，什么算是消化好了呢？不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動(dòng)了，多半呈沙壯移動(dòng)，其實(shí)已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打

3、成完全分離細(xì)胞，這是沒有必要的。一般能移動(dòng)了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個(gè)時(shí)候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細(xì)胞就是完全成單個(gè)細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會(huì)聚集，這個(gè)是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)特性，無論死活的細(xì)胞都是如此，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個(gè)細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個(gè)幾個(gè)細(xì)胞聚集在一起。一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此，容易聚集，不要去嘗試過幾個(gè)小時(shí)就拿出來吹打成單細(xì)胞懸液（不要笑，這個(gè)是初養(yǎng)懸浮細(xì)胞的人常犯的錯(cuò)誤，以為懸浮培養(yǎng)就是

4、一個(gè)一個(gè)分開）。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，這個(gè)時(shí)候即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個(gè)細(xì)胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時(shí)間，或者象有的同學(xué)那樣吹打1h，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。3，另一個(gè)帖子里提到一個(gè)比較復(fù)雜的四步消化法，這個(gè)挺有意思，我也是第一次聽說，應(yīng)該是網(wǎng)友自己發(fā)展出來的方法，很有參考價(jià)值。但我估計(jì)這個(gè)方法可能對付少數(shù)非常怪異的細(xì)胞才需要這么復(fù)雜的程序。我目前養(yǎng)過的近300株細(xì)胞里面，還沒遇到這么怪異的。比如Caco2其實(shí)是很好消化的細(xì)胞，不需要胰酶孵育即可，只是有點(diǎn)成片分布。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個(gè)視細(xì)胞而定

5、。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至完全吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細(xì)胞的特性，是因?yàn)橘N壁過程中重新聚集了。這個(gè)時(shí)候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細(xì)胞之后會(huì)對你越來越不好。4，比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化），就以colon cancer為例，比如HCT15, LS411和KM12，這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足夠了，一般我加300ul。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過5min，即可見細(xì)胞成片移動(dòng)，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會(huì)有難消化

6、的時(shí)候，比如tsDC細(xì)胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動(dòng)。5，常規(guī)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），受消化影響不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）。但少數(shù)實(shí)驗(yàn)，比如病毒包裝，對細(xì)胞代數(shù)，對細(xì)胞狀態(tài)要求極高。這個(gè)時(shí)候，胰酶消化，就是潤洗，都會(huì)對細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會(huì)逐漸下降（當(dāng)然也有其它因素影響包裝效率）。這個(gè)時(shí)候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。6，EDTA的作用。許多人不用胰酶，只用EDT

7、A，或者用trypsin/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，trypsin切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，就是這個(gè)道理。一般不要試圖延長消化時(shí)間（如果10min還消化不徹底的話），而應(yīng)該想其它辦法。7，PBS洗滌。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因?yàn)镾erum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學(xué)問可以講，對于一些難消化細(xì)胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因?yàn)檫@些離子也會(huì)抑制trypsin的活性。但對

8、于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細(xì)胞，不需要配制如此溶液?？偨Y(jié)下來，雖然這個(gè)帖子是關(guān)于消化的，但其實(shí)消化并不是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵所在（雖然很重要），關(guān)鍵所在是細(xì)胞來源，血清質(zhì)量和水源（自己配制溶液的話）。我看到版上許多人養(yǎng)細(xì)胞遇到各種各樣的問題，很多時(shí)候bottleneck沒有找到，雖然通過其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。因?yàn)槿藗兺⒁庾约旱牟僮?，總覺得自己沒有經(jīng)驗(yàn)，而忽視試劑，溶液尤其是細(xì)胞的質(zhì)量，后者其實(shí)才是許多細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常見的問題。 從最基礎(chǔ)的地方教起，一步一步詳細(xì)介紹細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，非常好的開門教程常用設(shè)備準(zhǔn)備室的設(shè)備：單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋

9、、儲(chǔ)品柜（放置未消毒物品）、儲(chǔ)品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計(jì)（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲(chǔ)品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實(shí)驗(yàn)記錄）。必須放在無菌間的設(shè)備：離心機(jī)（收集細(xì)胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機(jī)、4冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。無菌操作無菌室的滅菌：定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5過氧乙酸擦拭

10、。CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。實(shí)驗(yàn)人員的無菌準(zhǔn)備：肥皂洗手。穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋用75酒精棉球擦凈雙手。無菌操作的演示：凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精燈火焰操作。器皿使用前必須過火滅菌繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過火。各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢

11、液缸。吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：自來水刷洗，除去灰塵。烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5稀鹽酸中12小時(shí)以除去臟物、鉛、砷等物。刷洗、烘干：12小時(shí)后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時(shí)，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升

12、時(shí)，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，維持20-30分鐘。高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消：刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時(shí)后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲(chǔ)存及防止灰塵和再次被污染。高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)

13、隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時(shí)，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持20-30分鐘即可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）烘干備用：因?yàn)楦邏合竞笃髅髸?huì)被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時(shí)可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小時(shí),或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好

14、濾膜兩張，安裝濾膜時(shí)注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時(shí)應(yīng)該立即將螺旋旋緊。膠塞烘干后用2氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。膠帽，離心管帽烘干后只能在2氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時(shí)（切記時(shí)間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。膠頭可用75酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即

15、可。塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周時(shí)間洗除殘留的氧化乙烯。用20000100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時(shí)_這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC126H2O)2g，30鹽酸10m1，蒸餾水88m1。注意事項(xiàng)：嚴(yán)格執(zhí)

16、行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時(shí)，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時(shí)燒干，水不能過多因?yàn)槠鋵⑹箍諝饬鲿呈茏?，?huì)降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時(shí)爆炸。安裝濾膜時(shí)注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡：A.泡酸時(shí)要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時(shí)防止酸液濺到地面，會(huì)腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。具體步驟：一. 水的制備：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，

17、不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水二.PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：1.溶解定容：將藥品（NaCl：8.0g，KCl：0.2g，Na2HPO4H2O：1.56g，KH2PO4：0. 2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。2.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。三. 胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋

18、白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于

19、4內(nèi)過夜。2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20保存以備使用。四.青、鏈霉素溶液的配制于消毒1. 所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。2.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位1微克？五.RPMI1640的制備與消毒：1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并

20、加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。4.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4冰箱內(nèi)待用。5.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4時(shí)兩周有效）。六血清的滅火：細(xì)胞培養(yǎng)常

21、用的是小牛血清，新買來的血清要在56水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。七.HEPES溶液：HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N-a-hydroxythylpiperazine-N- ethanesulfanic acid ）。對細(xì)胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4保存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可

22、根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。八.谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4下放置1周可分解50，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中

23、谷氨酰胺的含量為14mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過濾除菌，分裝小瓶，-20保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。九.肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。十. 型膠原

24、酶：0.1型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)樾湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20保存。十一.明膠溶液：因?yàn)槊髂z難于過濾，所以配制0.1明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中， 4保存。其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml內(nèi)皮生長因子，注意事項(xiàng)：1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米和

25、0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：一. 傳代前準(zhǔn)備：1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2.用75酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4.點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消

26、毒。6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。二.胰蛋白酶消化；1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37。2. 顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。三、吹打分散細(xì)胞：1

27、.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。四.分裝稀釋細(xì)胞：1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計(jì)數(shù)。注意密度過小會(huì)影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。最后要做好標(biāo)記。五.繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)

28、。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25時(shí)為一個(gè)，占50為，占75時(shí)為。傳代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：1.嚴(yán)格的無菌操作2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA（0.02乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5酚紅4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。注意

29、EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫壁。細(xì)胞的復(fù)蘇細(xì)胞復(fù)蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196液氮中的細(xì)胞快速融化至37，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。具體操作一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.將水浴鍋預(yù)熱至372.用75酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。二取出凍存管：1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號。2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對管外的編號。三迅速解凍：1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷

30、的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。四.平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min 離心3min五.制備細(xì)胞懸液：1.吸棄上清液。2.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液。六.細(xì)胞計(jì)數(shù)：細(xì)胞濃度以5×105/ml為宜。七.培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37和5CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(shí)（或者24-48小時(shí)）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。初學(xué)者易犯錯(cuò)誤：1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37。2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化

31、時(shí)間延長。3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞丟失。4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：一.準(zhǔn)備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞，按照傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長成單層后以被使用。二.細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法是用0.25的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細(xì)胞懸液。三.細(xì)胞計(jì)數(shù)：1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。2.制備計(jì)

32、數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺盼藍(lán)染液（0.4）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大鉻（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml （ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4) 

33、15;2×104說明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）0.1mm3 而 1ml1000mm3四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)

34、時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線上時(shí)，則只計(jì)上線，不計(jì)下線，只計(jì)右線，不計(jì)左線。5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計(jì)數(shù)。五.初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：1. 計(jì)數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。3. 滴入懸液時(shí)的量太多，至使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。六.本實(shí)驗(yàn)特殊試劑的配制：4臺盼藍(lán)母液：稱取4克臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100毫升，用濾紙過濾，4保存。使用液：使用時(shí)，用PBS稀釋母液至0.4即可。細(xì)胞的凍存1.先將凍存管放入4冰箱，約40min。2.接著置于-20冰箱，約30-60min。3.置于-80超低溫冰箱中放

35、置過夜。4.置于液氮罐中長期保存。5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。注意事項(xiàng)：1.使用DMSO前，不需要進(jìn)行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會(huì)破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。2.不宜將凍存細(xì)胞放置在0-60這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。3.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。細(xì)胞培養(yǎng)三不要養(yǎng)細(xì)胞是醫(yī)學(xué)研究生的基本功。我養(yǎng)過骨髓MSC、心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞、AD293腺病毒包裝細(xì)胞、PA317逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞。養(yǎng)得最多的是MSC。有三個(gè)小經(jīng)驗(yàn)和大家

36、分享一下：1. 不要燒瓶口。大多數(shù)人都喜歡在酒精燈的火焰上關(guān)瓶子，覺得這樣可以避免污染。不知道大家是不是有培養(yǎng)基怎么越用越發(fā)紫的困惑？知道為什么嗎？燒瓶口燒的。培養(yǎng)基一般都是用碳酸/碳酸氫跟作緩沖體系。瓶口在火焰上的時(shí)候，熾熱的空氣進(jìn)入瓶內(nèi)。塞緊塞子放入冰箱后，空氣變冷，壓力驟降，培養(yǎng)基中的碳酸就會(huì)轉(zhuǎn)化成二氧化碳，釋放出來。培養(yǎng)基中的碳酸少了，當(dāng)然會(huì)變堿。如果不燒瓶口的話，你會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變堿的速度會(huì)大大減慢。（當(dāng)然多多少少還是會(huì)有一點(diǎn)越用越堿，因?yàn)槭覝剡€是比冰箱內(nèi)的溫度高）其實(shí)燒瓶口防止污染純粹是心理安慰。不妨試一下把手指在火上晃幾下，你會(huì)發(fā)現(xiàn)根本就不會(huì)燒疼。如果有細(xì)菌的話，這么晃兩下也燒不死

37、多少。要想燒死全部細(xì)菌，除非把瓶口和塞子燒紅。我在國內(nèi)從來就不燒瓶口。來美國以后發(fā)現(xiàn)這里更徹底，超凈臺內(nèi)根本就不點(diǎn)酒精燈。2. 不要頻繁看細(xì)胞。對于初學(xué)者而言，養(yǎng)細(xì)胞就像養(yǎng)孩子一樣，有空就要去看看。細(xì)胞越是養(yǎng)不好，就越是經(jīng)常去看。實(shí)際上看細(xì)胞對細(xì)胞的生長沒有任何好處，特別是對原代細(xì)胞或是免疫磁珠分選后，密度特別低的細(xì)胞。培養(yǎng)基中的生長因子是非常有限的。細(xì)胞好不容易自分泌一點(diǎn)兒促生長的因子在其周圍，形成有利于生長的局部環(huán)境。你跑去看細(xì)胞，培養(yǎng)瓶這么一晃，把因子都給晃散了。經(jīng)?？梢钥吹叫率忠惶斓酵矶荚诳醇?xì)胞，細(xì)胞老是長不好。老手細(xì)胞一扔好幾天不管，細(xì)胞瘋長。3. 不要怕消化。在傳代的時(shí)候，初學(xué)者往

38、往生怕細(xì)胞消化過度，早早地終止消化。細(xì)胞沒下來就使勁吹燈，吹得滿瓶子都是氣泡。在我看來，用力吹打?qū)?xì)胞的損傷比消化更大。我?guī)熜衷谧鲅芷交≡臅r(shí)候，37度消化過夜，細(xì)胞也沒事。我一般是等細(xì)胞完全變圓后才中止消化。細(xì)胞輕輕一晃就能下來。還有，動(dòng)作要輕柔，盡量不要產(chǎn)生氣泡。氣泡在破裂時(shí)的機(jī)械應(yīng)力相當(dāng)大，對細(xì)胞的傷害也是很大的。 原代培養(yǎng)技術(shù)一、組織塊直接培養(yǎng)法1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm3 左右的小塊，再用Hank's液洗三次。3、將組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，并貼附于瓶底面。4、輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，瓶底朝上，向瓶內(nèi)

39、注入適量的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶放置在37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。5、放置待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37繼續(xù)培養(yǎng)。二、消化培養(yǎng)法1、取材，用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。2、用手術(shù)剪將組織剪切成1mm3 左右的小塊，再用Hank's液洗三次。3、視組織塊量加入酶液，37中消化2040分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。4、加入35ml培養(yǎng)液以終止酶消化作用（或加入相關(guān)酶抑制劑）。5、靜置510分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。6、1000rpm，離心10分鐘，棄上清液。7、加入Ha

40、nk's液5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。8、加入培養(yǎng)液12ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。9、將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，37下培養(yǎng)。三、 器官培養(yǎng)1、將不銹網(wǎng)做成支架形狀，調(diào)整其高度至培養(yǎng)皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5m孔徑濾膜。2、將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中，使液面剛剛接觸到濾膜，但不要使其浮起。3、將要培養(yǎng)器官組織放在濾膜上，一般厚度不要超過200m，水平面積不超過10mm2 。4、將上述準(zhǔn)備好的培養(yǎng)物放入CO2 培養(yǎng)箱，并加注氧氣調(diào)整氧分壓，最好到90%。5、培養(yǎng)過程中要注意觀察培養(yǎng)液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上。6、上述可進(jìn)行器官培養(yǎng)1-3周，每2-3天換液一

41、次，并根據(jù)情況做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和檢測。胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)：從技巧走向科技實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞是個(gè)不小的壯舉，培養(yǎng)的講究，易溶細(xì)胞勞動(dòng)密集型，在一定程度上與其說是精密科學(xué)不如說是技巧。然而，現(xiàn)在，威斯康星大學(xué)麥迪遜分校（the University of Wisconsin-Madison）一研究小組報(bào)告，研制了一個(gè)完全確定的培養(yǎng)體系，為細(xì)胞治療提供更均一更安全產(chǎn)品The journal Nature Methods Nov.14上報(bào)道，該小組由Laura Kiessling領(lǐng)導(dǎo)，一位威斯康星大學(xué)麥迪遜分校化學(xué)教授，介紹了一種廉價(jià)的、能（適應(yīng)）所有細(xì)胞的（培養(yǎng)）系統(tǒng)，從而免受培養(yǎng)（操作過程中）的不確

42、定性工作（或因素的影響）?！斑@是一項(xiàng)很簡單的技術(shù)，任何人都能使用” Kiessling說。目前，人類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的大多是用于研究，然而，隨著時(shí)間推移培養(yǎng)系統(tǒng)會(huì)改進(jìn)，科學(xué)家們?nèi)杂檬笤醇?xì)胞及蛋白的支持干細(xì)胞生長的“表面”培養(yǎng)人類細(xì)胞，誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞。如此會(huì)增加病原體，如病毒，如果培養(yǎng)的干細(xì)胞用于人體治療，這是一個(gè)嚴(yán)肅的問題（涉及生物安全）。新的培養(yǎng)系統(tǒng)利用一種人工合成的化學(xué)方法制成蛋白片段及多肽基質(zhì)，對干細(xì)胞有親和作用。結(jié)合界定的培養(yǎng)基，由威斯康星團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)系統(tǒng)可以讓細(xì)胞處在未分化狀態(tài)保持3個(gè)月或更長。根據(jù)新的報(bào)告，該系統(tǒng)也適用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，成人細(xì)胞經(jīng)過遺傳學(xué)重編類似于胚胎干細(xì)胞。Kie

43、ssling表示，在該系統(tǒng)，細(xì)胞經(jīng)常被檢測是否分化為所需的細(xì)胞類型，在一定時(shí)間內(nèi)與市售有效的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對比看是否達(dá)到一致。Kiessling表示，首個(gè)人類胚胎干細(xì)胞臨床試驗(yàn)在進(jìn)行中，正在啟動(dòng)人類患者更多試驗(yàn)，相信在安全性問題上是至高至上的。Kiessling解釋，目前通常使用的培養(yǎng)系統(tǒng)是不確定性，并沒有真正知道細(xì)胞是否接觸，且無均一性，代與代之間是否存在變異。而我們研發(fā)的系統(tǒng)是確定的并且是廉價(jià)的。Kiessling的研究小組的工作得到了美國國立衛(wèi)生研究院和威斯康星材料科學(xué)與工程研究中心大學(xué)的支持。細(xì)胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染?；瘜W(xué)污染化學(xué)污染是一些對細(xì)胞有毒性的或?qū)?xì)胞產(chǎn)生刺

44、激的化學(xué)物質(zhì)。這些污染一般來自于沒有洗凈的器皿、不純的化學(xué)試劑和質(zhì)量較差的蒸餾水等?；瘜W(xué)污染中比較引人注意的是細(xì)菌內(nèi)毒素。它是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞死亡后解體釋放出的疏水性的細(xì)胞壁組成物質(zhì)，對塑料等疏水性強(qiáng)的物質(zhì)有很強(qiáng)的吸附能力。細(xì)菌內(nèi)毒素可刺激部分細(xì)胞產(chǎn)生一些激素或細(xì)胞因子，對細(xì)胞生長和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。細(xì)菌內(nèi)毒素是臨床上的最主要的熱原（即注射到動(dòng)物體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)熱），所以通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的疫苗、細(xì)胞因子等用在臨床上的藥品的生產(chǎn)過程中更是要避免細(xì)菌內(nèi)毒素的污染。生物污染生物污染包括比較容易發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、霉菌和酵母的污染，和較難發(fā)現(xiàn)的病毒、支原體和其他細(xì)胞的污染。細(xì)菌、霉菌和酵母到處存在，它們能在

45、合適的環(huán)境中非?？焖俚纳L。這些污染比較容易觀察到，它們往往會(huì)使其污染的培養(yǎng)液產(chǎn)生可見的變化，或者通過顯微鏡觀察就可以看見。由于病毒有種屬特異性，所以病毒污染的概率比較小。但是病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，因?yàn)椴《绢w粒特別微小，一般的實(shí)驗(yàn)室都沒能力檢查細(xì)胞培養(yǎng)中污染的病毒。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞內(nèi)，對整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)不是致死的，所以它可能會(huì)使研究人員長期得到受病毒影響的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1956 年 Robinson 及其同事首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染。90年代初美國的一個(gè)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在該國的細(xì)胞培養(yǎng)中，至少有15%被支原體污染。由于支原體沒有細(xì)胞壁，在細(xì)胞培養(yǎng)液中幾乎是透明的，同時(shí)對常用于細(xì)胞培養(yǎng)中的抗生素

46、不敏感，不引起 pH 變化，不使培養(yǎng)液渾濁，所以支原體污染不容易被發(fā)現(xiàn)，但是其存在會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。細(xì)胞的交叉污染在細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生的嚴(yán)重程度大大超過人們的想象：1981 年對ATCC細(xì)胞株的調(diào)查顯示：超過 60 標(biāo)記為其他細(xì)胞株的細(xì)胞居然是 HeLa 細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)節(jié)問題1. 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺，以70

47、% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。2. 無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3. 小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。4. 工作人員應(yīng)注意自身之

48、安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應(yīng)避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。5. 定期檢測下列項(xiàng)目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。 5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750

49、)，定期更換水槽的水?；A(chǔ)篇-實(shí)驗(yàn)用品1. 種類 1.1. 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。 1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask，plates, dishes, roller bottle 等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料離心管: 15 ml, 50 ml，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene (PP) 為不透明材質(zhì)，polystyren

50、e (PS) 為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000ml2. 清洗 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.10.05 N HCl 浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。3. 滅菌 3.1. 實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121, 15 lb, 20 分鐘，置于oven

51、 中烘干。 3.2. 實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170, 4 小時(shí)。 3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride 溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 , 15 lb, 20 分鐘處理。基礎(chǔ)篇-培養(yǎng)基1. 液體培養(yǎng)基貯存于4 冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37 水槽中溫?zé)帷?. 液體培養(yǎng)基(加血清) 存放期為六個(gè)月，期間glutamine 可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)： 3.1. 細(xì)胞培養(yǎng)基通常須添加10 % 血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH 為7.

52、2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對細(xì)胞生長可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變。3.2. 材料： 純水(milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要) ，粉末培養(yǎng)基 ，NaHCO3  ，電磁攪拌器 無菌血清瓶 ，0.1 或0.2 mm無菌過濾膜 ，pH 計(jì)，真空泵，CO2 氣體3.3. 步驟： 3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml mill

53、i-Q 水中，攪拌使其溶解。 3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。 3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合?；旌笕芤褐畃H 應(yīng)為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時(shí)，pH 會(huì)升高0.1-0.2。 3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時(shí)分裝至無菌容器中，標(biāo)示培養(yǎng)基種類、日期、瓶號等，貯存于4。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾) 3.3.

54、5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗(yàn)與污染測試。附-配制培養(yǎng)基之生長測試材料： MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004) 6-well TC plate (or 35 mm TC dish) methanol glacial acetic acid 10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)步驟： 1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell，接種MDCK 細(xì)胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個(gè)well 接種1 × 102 活細(xì)胞，同時(shí)作對照組實(shí)驗(yàn)。 2. 接種57 天后，在100 倍

55、倒立顯微鏡作觀察細(xì)胞群落之生長，待細(xì)胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時(shí)即可。 3. 去除培養(yǎng)基，加入1 ml Carnoys 固定液(甲醇：冰醋酸 3:1)，室溫下靜置10 min。 4. 去除固定液，水洗二次。 5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色2-3 min。 6. 去除染液，水洗二次。 7. 以肉眼計(jì)數(shù)群落數(shù)，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細(xì)胞生長不佳，則丟棄之。基礎(chǔ)篇-抗生素1. 細(xì)胞庫之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素 1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。 1.2. 培養(yǎng)自其它實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)之細(xì)胞株，制作token f

56、reeze 前培養(yǎng)基須添加抗生素，待token freeze 通過污染測試后，大量培養(yǎng)時(shí)則不加抗生素。2. 寄送活細(xì)胞時(shí)，須將培養(yǎng)液充滿整個(gè)flask 時(shí)，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。3. 若要檢測mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因gentamicin 會(huì)抑制mycoplasma 生長。4. 去除細(xì)菌污染之抗生素混合配方: penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitraci

57、n 2.5 units/ml，注意混合使用后藥物毒性會(huì)增強(qiáng)。5. 抗生素使用種類與濃度：抗生素工作濃度儲(chǔ)存溫度殺滅細(xì)菌penicillin(青霉素)100 units/ml-20G(+) bacteriastreptomycin(鏈霉素)100 ug/ml-20 G(+) and G(-) bacteriaamphotericin B(潮霉素B)2.5 ug/ml-20yeast and moldsfungizone2.5ug/ml-20yeast and moldsChlotetracycline(金霉素)50 ug/ml-20G(+) and G(-) bacteriagentamicin(慶大霉素)50 ug/ml-20G(+) and G(-) bacterianystatin(制霉菌素)50 ug/ml-20yeast and moldsamphotericin B(潮霉素B)2.5 ug/ml-20yeast and molds基礎(chǔ)篇-血清1. 血清必須貯存于20 -70，若存放于4，請勿超過一個(gè)月。如果一次無法用完一 瓶，可將404