細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)材料

1、實(shí)驗(yàn)一 熒光顯微鏡的原理和使用實(shí)驗(yàn)二 葉綠體的分離與熒光觀察實(shí)驗(yàn)三 線粒體的活體染色與觀察實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞膜的通透性實(shí)驗(yàn)五 DNA的細(xì)胞化學(xué)Feulgen反應(yīng)實(shí)驗(yàn)六 植物染色體標(biāo)本的制備和觀察實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)八 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)九 植物原生質(zhì)體的分離和活性鑒定實(shí)驗(yàn)十 環(huán)境因素誘變?nèi)旧w改組的觀察 實(shí)驗(yàn)一 熒光顯微鏡的原理和使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鉄晒怙@微鏡的構(gòu)造及其維護(hù)方法；掌握熒光顯微鏡的使用方法和使用中的注意事項(xiàng)。二、實(shí)驗(yàn)原理圖1 熒光顯微鏡熒光顯微鏡是選擇由高壓汞燈或類似光源發(fā)出一定波長的激發(fā)光，激發(fā)標(biāo)本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，觀察細(xì)胞某種特異成分的分布狀態(tài)的

2、顯微鏡。與普通光學(xué)顯微鏡一樣，熒光顯微鏡也有物鏡、目鏡、調(diào)焦裝置、光源、聚光器、載物臺(tái)、鏡身等組成部分。所不同的是，熒光顯微鏡增加了激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)，它投射到樣品上的是特定波長的激發(fā)光而不是普通的可見光。在激發(fā)光的作用下，樣品中的熒光物質(zhì)產(chǎn)生發(fā)射光（即熒光）。因此，熒光顯微鏡觀察到的是樣品中能產(chǎn)生熒光的部分所呈現(xiàn)的熒光映象，普通光學(xué)顯微鏡則是整個(gè)樣品的可見光透射和折射影像。某些物質(zhì)在定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光(如可見光)，這種光就稱為熒光。若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后直接

3、發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光（或直接熒光），如葉綠素的火紅色熒光和水質(zhì)素的黃色熒光等。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為次生熒光（或間接熒光），如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間，有必要時(shí)立即拍照。三、實(shí)驗(yàn)用品熒光顯微鏡、鑷子、載玻片、蓋玻片、解剖刀、0.01%吖啶橙染色液（acridine orange）、蒸餾水、水葫蘆葉片四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法（一）熒光顯微鏡的構(gòu)造1、基本裝置熒光顯微鏡的基本裝置是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件（如熒光光源 、激發(fā)濾片

4、、二向色鏡和阻斷濾片等）的基礎(chǔ)上組成的。熒光光源一般采用高壓汞燈（50-200W），它可發(fā)出各種波長的光，但每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長 ，所以需加用激發(fā)濾片（一般有紫外、紫色、藍(lán)色和綠色激發(fā)濾片），僅使一定波長的激發(fā)光透過照射到標(biāo)本上，而將其他光都吸收掉。每種物質(zhì)被激發(fā)光照射后，在極短時(shí)間內(nèi)發(fā)射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發(fā)光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷（或壓制）濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光進(jìn)入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。2、光路熒光顯微鏡就

5、其光路來分有兩種： 透射式熒光顯微鏡：激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。圖2 落射式光路 落射式熒光顯微鏡：這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)二向色鏡，它與光鈾呈45°角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，返回到二

6、向色鏡，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片二向色鏡阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。（二）熒光顯微鏡的使用1、使用方法：熒光顯微鏡使用時(shí)，一般先用普通的低壓光源觀察樣品，確定了觀察的部位后，再切換至激發(fā)光觀察熒光，如配有照相裝置還可進(jìn)行顯微攝影。 接通電源，按壓穩(wěn)壓器按鈕，使汞燈點(diǎn)亮；推上擋光板，濾片轉(zhuǎn)換撥桿調(diào)至“O”，打開底座白光光源；裝片放上載物臺(tái)，用低倍至高倍白光觀察，將需觀察的樣品置于光圈中央；關(guān)上底座光源，濾片轉(zhuǎn)換撥桿調(diào)至“B”，推開擋光板，觀察樣品發(fā)出的熒光。2、注

7、意事項(xiàng)： 最好在暗室中進(jìn)行檢驗(yàn)。汞燈接通電源后需要1015 min預(yù)熱，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。待光源發(fā)出強(qiáng)光并穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。 檢查時(shí)間以一次12 h為宜，如果超過90 min，高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受激發(fā)光照射35 min后，標(biāo)本熒光也明顯減弱，因此在使用激發(fā)光與可見光觀察之間轉(zhuǎn)換或暫停觀察時(shí)，可拉動(dòng)擋光板阻擋光線；標(biāo)本染色后立即觀察，時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。 高壓汞燈達(dá)到最大發(fā)光效率后，燈箱會(huì)發(fā)燙，操作需注意避免燙傷；燈箱上端為散熱口，一定不能放置物品。 汞燈的使用壽命一般只有100 h，使用得當(dāng)可達(dá)150 h，使用

8、壽命與開關(guān)的次數(shù)成反比，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)打開電扇或空調(diào)散熱降溫。換新燈泡應(yīng)從開始使用就記錄時(shí)間。 關(guān)掉汞燈電源后，必須等待1520 min待汞燈自然冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時(shí)，將會(huì)造成嚴(yán)重后果?。ㄝp則燒斷保險(xiǎn)絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸）一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。（三）簡易熒光標(biāo)本制作與觀察1、裝片制作用鑷子撕取水葫蘆葉片表皮（帶綠色）置于載片上，滴加12滴蒸餾水或吖啶橙染液，加蓋片后置顯微鏡下觀察。 在普通光鏡下觀察。 在熒光顯微鏡下觀察自發(fā)熒光和次生熒光。2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）在普通光鏡下可以看到兩種細(xì)胞 保衛(wèi)細(xì)胞：為構(gòu)成氣孔的成對(duì)存

9、在的腎形細(xì)胞。 葉肉細(xì)胞：為排成柵狀的長方形和橢圓形細(xì)胞。 葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。 （2）在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強(qiáng)度要比游離葉綠體弱。氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)量要比葉肉細(xì)胞少。（3）用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出枯紅色熒光，細(xì)胞核可發(fā)出綠色熒光，氣孔仍為綠色。圖3 普通光鏡下的保衛(wèi)細(xì)胞和葉肉細(xì)胞 圖4 熒光顯微鏡觀察到的葉肉細(xì)胞五、思考題1、在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的自發(fā)熒光時(shí)，更換濾片系統(tǒng)，葉綠體的顏色是否有變化? 2、普通光鏡與熒光顯微鏡有何異同點(diǎn)? 實(shí)驗(yàn)二 葉綠體的分離與熒光觀察

10、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法。2、觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。二、實(shí)驗(yàn)原理葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，光合作用就是在葉綠體中進(jìn)行的。由于具有這一重要功能，所以它一直是細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對(duì)象。葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器，利用低速離心即可分離集中進(jìn)行各種研究。將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法，一個(gè)顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時(shí)間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速度不同。依

11、次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使非均一懸浮中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。差速離心是利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。例如用差速離心法分離已破碎的細(xì)胞各組份。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35

12、mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進(jìn)行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。分離過程最好在 05的條件下進(jìn)行，如果在室溫下，要迅速分離和觀察。三、實(shí)驗(yàn)用品普通離心機(jī)、攪拌機(jī)、粗天平、熒光顯微鏡、250 ml燒杯、50 ml燒杯、200ml量筒、滴管、10 ml刻度離心管、玻棒、紗布、載玻片、蓋玻片、新鮮韭菜、0.35mol/L氯化鈉、0.01%吖啶橙、蒸餾水四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法1、選取新鮮的韭菜葉，洗凈擦干后去除葉梗，稱30 g于150 ml0.35 mol/L NaCl 溶液中，裝入攪拌機(jī)。2、利用攪拌機(jī)2檔（10000r/min）勻漿30 s。 3、將勻漿用8層紗布過濾于250 m

13、l燒杯中。4、取濾液8ml 在1000r/min 下離心2min，棄去沉淀。5、將上清液在 3000r/min 下離心 5 min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體(混有部分細(xì)胞陔)。 6、將沉淀用15 ml的0.35mol/L NaCl 溶液懸浮。 7、取葉綠體懸液一滴于載片上，另取葉綠體懸液一滴滴在載片上，再滴加一滴 0.01%吖啶橙熒光染料，加蓋片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察。 在普通光鏡下觀察。 在熒光顯微鏡下觀察。 8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖5 葉綠體的自發(fā)熒光 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。 在選用B(blue)激發(fā)濾片，B雙色鏡

14、和O530(orange)阻斷濾片的條件下， 葉綠體發(fā)出火紅色熒光。 加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒色。五、思考題1、游離葉綠體和整體細(xì)胞內(nèi)的葉綠體，在熒光顯微鏡下，其顏色和強(qiáng)度有無差異？2、兩次離心第一次去掉沉淀，第二次去掉上清液，分別去掉的是什么物質(zhì)？3、葉綠體分離的實(shí)驗(yàn)原理是什么？在分離葉綠體時(shí)應(yīng)注意些什么問題？ 實(shí)驗(yàn)三 線粒體的活體染色與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、觀察動(dòng)、植物活細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布。2、學(xué)習(xí)一些細(xì)胞器的超活染色技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無害毒的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)

15、構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡?；钊炯夹g(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法的不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染與體外活染兩類。體內(nèi)活染是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。體外活染又稱超活染色，它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是染料的“電化學(xué)”特性起重要作用。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表現(xiàn)帶有陰離子，而被染的部

16、分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作為活體染色劑之用，應(yīng)選擇那些對(duì)細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，而且總是要配成稀淡的溶液來使用。一般足以堿性染料最為適用，可能因?yàn)樗哂腥芙庠陬愔|(zhì)(如卵磷脂、 膽固醇等)的特性，易于被細(xì)胞吸收。線粒體是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)重要細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行呼吸作用的場所。細(xì)胞的各項(xiàng)活動(dòng)所需要的能量，主要是通過線粒體呼吸作用來提供的。不同細(xì)胞中線粒體的形態(tài)和數(shù)目不同。線粒體的數(shù)目與細(xì)胞類型和細(xì)胞的生理狀態(tài)有關(guān)，線粒體多聚集在細(xì)胞生理功能旺盛的區(qū)域。詹納斯綠B（Janus green B）對(duì)線粒體具有專一性的染色，是毒性最小的堿性染料

17、。Janus green B 染色是由于線粒體中的細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)，呈藍(lán)綠色，而周圍的細(xì)胞質(zhì)被還原成無色的色基。三、實(shí)驗(yàn)用品洋蔥鱗莖、新鮮豬肝、普通光學(xué)顯微鏡、凹面載玻片、鑷子、剪刀、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、滴管、解剖刀1、Ringer溶液： 氯化鈉 8.5g （變溫動(dòng)物用 6.5g） 氯化鈣 0.12g 碳酸氫鈉 0.20g 氯化鉀 0.14g 磷酸氫二鈉 0.01g 葡萄糖 2.0g 加蒸餾水 至1000ml 2、1%1/5000 詹納斯綠B（Janus green B）溶液 稱取0.5g 詹納斯綠B溶于50 ml Ringer溶液中，稍加熱（3040）使之很

18、快溶解，用濾紙過濾，即成1%原液。臨用前，取1%原液，加入49 ml Ringer溶液混勻，即成1/5000工作液，裝入棕色瓶備用，以保持它的充分氧化能力。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法（一） 動(dòng)物細(xì)胞線粒體活體染色的觀察1、取樣染色：取豬肝邊緣較薄的肝組織一小塊，放入盛有Ringer液的培養(yǎng)皿內(nèi)，用吸管吸取Ringer液，反復(fù)浸泡沖洗肝臟，洗去血液。 圖6 肝細(xì)胞線粒體活體染色2、在干凈的凹面載玻片的凹穴中滴加 1/5000 詹納斯綠 B（Janus green B）溶液，再將肝組織塊移入染液，但不可將組織塊完全浸沒，要讓組織上面部分半裸露在外面，這樣細(xì)胞內(nèi)的線粒體酶系可充分得到氧化，易被染色。當(dāng)組織塊

19、邊緣被染成藍(lán)綠色即可（一般需染2030 min）。3、分離細(xì)胞：染色后，吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪將組織塊著色部分剪碎，使細(xì)胞或細(xì)胞群散出。圖7 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞線粒體4、裝片：用吸管吸取分離出的細(xì)胞懸液，滴一滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。在低倍鏡下選擇不重疊的肝細(xì)胞，在高倍鏡下觀察，可見具有l(wèi)2個(gè)核的肝細(xì)胞質(zhì)中，有許多被染成藍(lán)綠色的線粒體，呈顆粒狀或線條狀，在細(xì)胞核周圍分布特別多。（二）植物細(xì)胞線粒體的活體染色1、用吸管吸取 1/5000 詹納斯綠B 染液，滴一滴在干凈的載玻片上，然后用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊，置于染液中，染色 1015 min。2、吸去染液，加

20、一滴 Ringer液，注意使內(nèi)表皮展平，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察。在高倍鏡下，可見表皮細(xì)胞中央被一大液泡所占據(jù)，細(xì)胞核被擠至旁邊，線粒體染成藍(lán)綠色，呈顆粒狀或線條狀。五、思考題1、肝細(xì)胞線粒體活體染色實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)有哪些？2、線粒體為何在細(xì)胞核周圍分布較多？ 實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞膜的通透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解細(xì)胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的速度，分析影響細(xì)胞膜的滲透性的因素。2、了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。各種物質(zhì)出入細(xì)胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶劑，水分子可以按照物質(zhì)濃度梯度從滲透壓低的一側(cè)

21、通過細(xì)胞膜向滲透壓高的一側(cè)擴(kuò)散，這種現(xiàn)象就是滲透。滲透作用是細(xì)胞膜的主要功能之一。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi)，可使細(xì)胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細(xì)胞膜對(duì)各種溶質(zhì)的通透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會(huì)發(fā)生改變，也會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時(shí)間長短可作為測量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。滲透壓相等的兩種溶液稱為等滲溶液。滲透壓不同的兩種溶液，把滲透壓相對(duì)高的溶液叫做高滲溶液，把滲透壓相對(duì)低的溶液叫做低滲溶液。對(duì)同一類型的溶質(zhì)來說，濃溶液的滲透壓比較大，稀溶液的滲透壓比

22、較小。因此，在發(fā)生滲透作用時(shí)，水會(huì)從低滲溶液（即稀溶液）進(jìn)入高滲溶液（即濃溶液），直至兩溶液的滲透壓達(dá)到平衡為止。給傷病員進(jìn)行大量補(bǔ)液時(shí)，常用與血漿等滲的0.154mol/L NaCl溶液（生理鹽水），而不能用0.256 mol/L NaCl的高滲溶液或0.068 mol/L NaCl的低滲溶液。圖8紅細(xì)胞在不同濃度NaCl溶液中的形態(tài)示意圖影響細(xì)胞膜的通透性的主要因素是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)自身的理化性質(zhì)，脂溶性大、分子量小、不帶電荷或非極性的分子比脂溶性小、分子量大、帶有電荷或極性的分子更容易穿膜。一般認(rèn)為，在簡單擴(kuò)散的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中，涉及物質(zhì)溶解在膜脂中，再從膜脂的一側(cè)擴(kuò)散到另一側(cè)，最后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)水相

23、中。所以，其通透性主要取決于分子大小和分子極性。本實(shí)驗(yàn)選用紅細(xì)胞作為細(xì)胞膜透性的實(shí)驗(yàn)材料，將其放入不同的介質(zhì)溶液中，觀察紅細(xì)胞的變化。由于細(xì)胞對(duì)各種溶質(zhì)的滲透性不同，有的溶質(zhì)可滲入， 有的溶質(zhì)不可以滲入，滲入的紅細(xì)胞溶質(zhì)可提高紅細(xì)胞的滲透壓，促使水分進(jìn)入細(xì)胞，引起溶血。由于溶質(zhì)分子的大小、極性不同，溶質(zhì)滲入速度不同，因此溶血時(shí)間也不同。分子的極性、大小對(duì)物質(zhì)透過細(xì)胞的速度有影響。當(dāng)溶質(zhì)不能自由透過細(xì)胞膜時(shí)，溶液的滲透壓成為影響水分進(jìn)出細(xì)胞的因素。當(dāng)溶液滲透壓小于細(xì)胞滲透壓時(shí)，則水分進(jìn)入細(xì)胞，使細(xì)胞膨脹甚至溶血；反之，細(xì)胞失水。三、實(shí)驗(yàn)用品新鮮雞血（加抗凝劑）、50ml燒杯、試管、試管架、刻度吸

24、管、秒表、載玻片、蓋玻片、普通光學(xué)顯微鏡、記號(hào)筆、0.85%NaCl、0.15mol/L NaCl、0.065mol/L NaCl、0.035mol/L NaCl、0.005mol/L NaCl、0.8mol/L甲醇、0.8mol/L乙醇、0.8mol/L乙二醇、0.8mol/L丙醇、0.8mol/L丙二醇、0.8mol/L丙三醇四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法 1、血細(xì)胞懸液的制備取1份雞血，加入10份的0.85%的NaCl（生理鹽水），即為稀釋的動(dòng)物紅細(xì)胞懸液（不透明的紅色液體）。2、低滲溶血觀察取試管1支，加入5mL蒸餾水，然后再加入0.5 ml紅細(xì)胞懸液，晃動(dòng)試管使之混勻，注意觀察溶液的顏色變化，溶

25、液由不透明的紅色變?yōu)槌吻澹f明紅細(xì)胞發(fā)生破裂，造成所有紅細(xì)胞溶血，使光線容易通過（可以通過試管壁看清書上的字為標(biāo)準(zhǔn)）。記錄溶血時(shí)間，顯微鏡下觀察溶血前后紅細(xì)胞的形態(tài)。3、血紅細(xì)胞的滲透性實(shí)驗(yàn) A組:0.15mol/L NaCl、0.065mol/L NaCl、0.035mol/L NaCl、0.005mol/L NaClB組:0.8mol/L甲醇、0.8mol/L乙醇、0.8mol/L乙二醇、0.8mol/L丙醇、0.8mol/L丙二醇、0.8mol/L丙三醇將試管編號(hào)，分別取A組試劑各5ml，加雞血0.5ml，立即混勻，觀察溶血與否，記錄溶血時(shí)間，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)過程二次。制片進(jìn)行顯微鏡觀察。再

26、分別取B組試劑各5ml，加雞血0.5 ml，方法同上。由于有的醇溶血時(shí)間較快，并且溶血時(shí)間較接近，所以2支試管一組重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)過程。五、思考題1、血紅細(xì)胞的滲透性實(shí)驗(yàn)中，是否存在物質(zhì)跨膜的主動(dòng)運(yùn)輸現(xiàn)象？為什么？2、常用的抗凝劑的種類和作用機(jī)理是什么？3、已知四種等滲鹽溶液分別為0.17 mol/L醋酸銨、0.17 mol/L硝酸鈉、0.17mol/L氯化銨、0.12 mol/L草酸銨，試劑瓶上的標(biāo)簽被蓋住了。如果用它們進(jìn)行血紅細(xì)胞的滲透性實(shí)驗(yàn)，你能否根據(jù)該實(shí)驗(yàn)結(jié)果確切判斷出每一瓶中所裝的是哪一種試劑？為什么？ 實(shí)驗(yàn)五 DNA的細(xì)胞化學(xué)Feulgen反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私?Feulgen反應(yīng)的原理

27、，掌握有關(guān)的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA是由許多單核苷酸聚合成的多核苷酸，每個(gè)單核苷酸又由磷酸、脫氧核糖和堿基構(gòu)成。DNA經(jīng) 1 mol/L 鹽酸水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的雙鍵打開，使脫氧核糖的第一碳原子上形成游離的醛基，這些醛基與Schiff試劑反應(yīng)。Schiff試劑是由堿性品紅和偏重亞硫酸鈉相作用，形成無色的品紅液，當(dāng)無色品紅與醛基結(jié)合即形成紫紅色的化合物。因此凡有DNA的地方，都能顯示紫紅色。紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個(gè)發(fā)色基團(tuán)，所以具有顏色。材料不經(jīng)過水解或預(yù)先用熱的三氯醋酸或DNA酶處理，得到的反應(yīng)是陰性的，從而證明了Feulgen反應(yīng)的專一性。圖

28、9 Feulgen反應(yīng)三、實(shí)驗(yàn)用品普通光學(xué)顯微鏡、恒溫水浴箱、溫度計(jì)、試管、燒杯、載玻片、蓋玻片、吸水紙、洋蔥鱗莖1、Schiff試劑稱取 0.5 g堿性品紅加入到 100 ml煮沸的蒸餾水中（用三角燒瓶） ，時(shí)時(shí)振蕩，繼續(xù)煮 5 min（勿使之沸騰） ，使之充分溶解。然后冷卻至 50 時(shí)用濾紙過濾，濾液中加入 10 ml1mol/L HCl HCl，冷卻至 25 時(shí)，加入 0.5 g Na2S2O5（偏重亞硫酸鈉或鉀） ，充分振蕩后，塞緊瓶塞，在室溫暗處靜置至少 24 小時(shí)（有時(shí)需 23 天） ，使其顏色退至淡黃色，然后加入 0.5 g活性炭，用力振蕩 1min，最后用粗濾紙過濾于棕色瓶中，

29、封嚴(yán)瓶塞，外包黑紙。濾液應(yīng)為無色也無沉淀，貯于 4 冰箱中備用。如有白色沉淀，就不能再使用，如顏色變紅，可加入少許偏重亞硫酸鈉或鉀，使之再轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色時(shí)，仍可再用。2、亞硫酸水溶液取200ml自來水，加10ml10%偏重亞硫酸鈉（或偏重亞硫酸鉀）水溶液和 10ml1mol/L HCl，混勻。此溶液在使用前配制，否則會(huì)因SO2的逸出而失效。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法1、酸解：將洋蔥鱗莖內(nèi)表皮放在60 1mol/L HCl中解離10 min。2、染色：用蒸餾水洗幾次，Schiff試劑遮光染色30 min。3、制片：回收Schiff試劑，用新鮮配制的亞硫酸水洗3次，每次1 min，洗完后水洗5 min，在載玻

30、片上鋪平表皮，蓋上蓋玻片。4、觀察：顯微鏡觀察，細(xì)胞核或染色體被染成紅色，細(xì)胞其余部分無色透明。 圖10 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮Feulgen反應(yīng) 圖11Feulgen反應(yīng)對(duì)照結(jié)果對(duì)照片：方法一先將材料放在5 %三氯醋酸中90 水浴15 min，主要把DNA抽提掉，然后按步驟1-4制片觀察。方法二材料不經(jīng)1mol/L HCl水解，直接放在Schiff試劑中染色，然后按步驟3-4制片觀察。五、思考題1、Feulgen反應(yīng)中最關(guān)鍵的步驟是什么？為什么？2、用Schiff試劑對(duì)DNA進(jìn)行染色與染料吸附的方法相比有什么優(yōu)勢？3、為什么Feulgen染色法不對(duì)RNA染色？ 實(shí)驗(yàn)六 植物染色體標(biāo)本的制備和觀察一、

31、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握常規(guī)壓片法制備植物染色體標(biāo)本的基本原理和方法2、觀察有絲分裂過程中染色體的形態(tài)特征和動(dòng)態(tài)變化二、實(shí)驗(yàn)原理植物染色體標(biāo)本的制備，常用分生組織，如根尖、莖尖和嫩葉做材料。Belling(1921)提出植物染色體壓片技術(shù)后，壓片已成為植物染色體研究中最廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)，其程序包括取材、預(yù)處理、固定、解離、染色和壓片等步驟，是以人工外加機(jī)械壓力使染色體分散。該方法操作快速簡便、省材省時(shí)，但是由于植物細(xì)胞有堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞壁，染色體很難像動(dòng)物染色體那樣平整地貼在載玻片上，染色體很難分散開，染色體容易變形和斷裂。三、實(shí)驗(yàn)用品普通顯微鏡、剪刀、鑷子、刀片、培養(yǎng)皿、濾紙、吸水紙、載玻片、蓋玻片、恒

32、溫水浴鍋、燒杯、洋蔥（2n=16）或蠶豆種子（2n=12）、甲醇、冰醋酸、秋水仙素（或?qū)Χ缺剑?、無水乙醇、1mol/LHCl。改良苯酚品紅染色液的配制：母液A：稱取3g堿性品紅，溶于100ml 70%乙醇中（此液可于4冰箱中長期保存）。母液B：取A液10ml，加入90ml 5%苯酚水溶液（兩周內(nèi)使用）。取B液45ml，加入6ml冰醋酸和6ml 37%甲醛。此為苯酚品紅染色液。取苯酚品紅染色液10ml，加入90ml45%的醋酸和1.8g山梨醇。放置兩周后，染色效果較好。此液稱為改良苯酚品紅染色液。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法1、材料培養(yǎng)：把洋蔥置于盛有清水的小燒杯口上，使生根部位與水接觸，2528條件下

33、培養(yǎng)，根長11.5cm時(shí)，于上午9時(shí)11時(shí)把根尖約0.5cm剪下備用。把干燥的蠶豆種子置水中浸種1天，種子吸水膨脹后轉(zhuǎn)到鋪有幾層吸水紙的培養(yǎng)皿或瓷盤中，上蓋雙層濕紗布并加少許水，2528條件下培養(yǎng)，待根長約11.5cm時(shí)，于上午911時(shí)或下午36時(shí)剪下根尖備用。2、預(yù)處理：將剪下的根尖置對(duì)二氯苯飽和水溶液，或0.1%秋水仙素溶液中，浸泡處理4小時(shí)。3、固定：用水洗凈處理過的根尖，經(jīng)甲醇-冰醋酸（31）固定612小時(shí)， 再經(jīng) 95%、85%乙醇各半小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇中，4保存?zhèn)溆谩?、解離：取出根尖，用蒸餾水洗凈，放入1mol/LHCl中60解離810min，再用蒸餾水洗2次，每次35mi

34、n。5、染色：把處理好的根尖放在載玻片上，切取乳白色的分生區(qū)，用鑷子輕輕搗碎，滴上一滴改良苯酚品紅染液，染色 510min后，蓋上蓋玻片。 6、壓片：在蓋玻片上面鋪上吸水紙，固定好蓋玻片，用拇指垂直壓片，再用鉛筆橡皮頭輕敲擊，使材料壓成均勻的薄層，細(xì)胞和染色體分散。圖12 洋蔥根尖染色體裝片 7、鏡檢：先用中倍鏡觀察壓片中細(xì)胞分散狀況和中期分裂相的多少，再檢查分裂中期細(xì)胞中的染色體是否完全分開，然后轉(zhuǎn)用高倍鏡尋找分散開的中期染色體，要求數(shù)出相應(yīng)的染色體數(shù)?？梢钥吹?，染色質(zhì)和染色體被染成紫紅色。如若染色體分散不好而難以分辨和計(jì)數(shù)，可取下片子，平放桌面上，用手指隔著吸水紙?jiān)谏w玻片上稍施壓力再觀察。

35、如果操作細(xì)心，用力適度，便可很容易得到染色體分散良好的壓片標(biāo)本。五、思考題1、固定液的作用是什么？在使用固定液時(shí)應(yīng)注意什么？2、預(yù)處理中秋水仙素的作用是什么？ 實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞計(jì)數(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)、掌握細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞計(jì)數(shù)法是細(xì)胞培養(yǎng)的一項(xiàng)基本技術(shù)。它是了解細(xì)胞生長狀態(tài)，繪制生長曲線等的重要手段。在動(dòng)物細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng)、細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇等眾多技術(shù)中需要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；植物細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)也需要測定細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞計(jì)數(shù)就是從需要計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸液中取一定量的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并通過計(jì)數(shù)得知原始細(xì)胞懸液中的細(xì)胞密度以及細(xì)胞總數(shù)。在細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，若細(xì)胞濃度太高，可進(jìn)行必要的稀釋。常用的

36、細(xì)胞計(jì)數(shù)有電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法和細(xì)胞板計(jì)數(shù)法，但電子計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)法在許多實(shí)驗(yàn)室尚未完全推廣，細(xì)胞板計(jì)數(shù)法仍是普通實(shí)驗(yàn)室目前常用的方法。三、實(shí)驗(yàn)用品雞血紅細(xì)胞懸液、0.17mol/L NaCl溶液、細(xì)吸管、乙醇、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、計(jì)數(shù)器、普通顯微鏡四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法1、制備雞血紅細(xì)胞懸液：取50ml小燒杯1只，以1份雞血加10份的0.17mol/L NaCl溶液稀釋，形成一種不透明的紅色液體，此為雞血紅細(xì)胞懸液。2、準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：用乙醇清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。3、加樣：先將特制的蓋玻片放在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，使兩側(cè)均現(xiàn)帶色牛頓環(huán)。用細(xì)吸管取少量待測細(xì)胞懸液，沿蓋玻片邊緩緩滴入，讓其自由滲入，

37、待整個(gè)蓋玻片下均充滿細(xì)胞懸液為宜。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中。4、計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格（每個(gè)大方格又分16個(gè)小方格）中的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，只計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。（如細(xì)胞團(tuán)10%，說明分散不充分；若細(xì)胞數(shù)200個(gè)/10mm2或500個(gè)/10mm2時(shí)，說明稀釋不當(dāng)，需重制備細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)）在一個(gè)方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計(jì)上線細(xì)胞不計(jì)下線細(xì)胞，計(jì)左線細(xì)胞不計(jì)右線細(xì)胞，計(jì)數(shù)誤差不能超過±5%。 圖14 細(xì)胞計(jì)數(shù)原則及順序（計(jì)數(shù)黑點(diǎn)，不計(jì)數(shù)白點(diǎn)） 5、計(jì)算：將計(jì)數(shù)結(jié)果代入下式，得出細(xì)胞密度： 細(xì)胞數(shù)/ml懸液=

38、（4大方格細(xì)胞數(shù)之和/4）×104五、思考題1、計(jì)算細(xì)胞密度所用的公式是如何推導(dǎo)出來的？試?yán)糜?jì)數(shù)板上給出的數(shù)據(jù)進(jìn)行推導(dǎo)。2、為什么細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，細(xì)胞懸液逸出凹槽外或有氣泡時(shí)要重做？ 實(shí)驗(yàn)八 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握用光學(xué)顯微鏡觀察植物細(xì)胞骨架的原理和方法，觀察光學(xué)顯微鏡下植物細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞骨架（cytoskeleton）是由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持，細(xì)胞的生長、運(yùn)動(dòng)、分裂、分化，物質(zhì)運(yùn)輸，能量轉(zhuǎn)換，信息傳遞，基因表達(dá)的起到重要作用。目前觀察細(xì)胞骨架的手段主要有電鏡、

39、間接免疫熒光技術(shù)、酶標(biāo)和組織化學(xué)等。微絲是球形肌動(dòng)蛋白單體構(gòu)成的纖維結(jié)構(gòu)，單根微絲直徑7nm，在光學(xué)顯微鏡下看不到該細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)觀察的是植物細(xì)胞中由微絲平行排列形成的微絲束。常用的觀察微絲的方法主要是考馬斯亮藍(lán)R-250染色法。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX-100處理細(xì)胞時(shí)，可將細(xì)胞質(zhì)膜中和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)被溶解抽提，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存，經(jīng)用戊二醛固定，考馬斯亮藍(lán)R250染色后，可在光學(xué)顯微鏡下觀察到由微絲組成的微絲束為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，這就是細(xì)胞骨架。三、實(shí)驗(yàn)用品洋蔥鱗莖、普通光學(xué)顯微鏡、50ml燒杯、載玻片、蓋玻片、刀片、小剪刀、吸水紙、擦鏡紙、鑷子、滴管1

40、、6mmol/L（pH6.8）磷酸緩沖液（用NaHCO3調(diào)pH）：Na2HPO4.12H2O 1.18g；KH2PO4 0.45g溶解于蒸餾水中至1000ml。2、M-緩沖液：用1mol/L HCl調(diào)pH至7.2。M緩沖液的配方試劑所需濃度相對(duì)分子質(zhì)量每升加量備注咪唑50mmol/L68.083.40g KCl50mmol/L74.553.73g MgCl2.6H2O0.5mmol/L203.300.10g EGTA（乙二醇四乙酸）1mmol/L380.400.38g EDTA.2H2O0.1mmol/L372.240.04g 巰基乙醇1mmol/L78.1370ld=1.114g/ml，14

41、.3mol/L*甘油（可不加）4.0mol/L92.09294.8mld=12.5g/ml，13.57mol/L3、1%TritonX-100：用M-緩沖液配制。4、3%戊二醛；用6mmol/L磷酸鹽緩沖液配制。5、0.2%考馬斯亮藍(lán)R250，其溶劑為：甲醇 46.5ml、冰醋酸 7ml、蒸餾水 46.5ml。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法1、取材：撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞（約1cm2大小）置于裝有6mmol/L磷酸鹽緩沖液的燒杯中，使其下沉。2、抽提：吸去磷酸鹽緩沖液，用1% TritonX-100處理2030min.。3、沖洗：吸去TritonX-100，用M緩沖液洗3次，每次10min。4、固定：3%

42、戊二醛固定30min。5、沖洗：6mmol/L磷酸鹽緩沖液洗3次，每次10min。6、染色：0.2%考馬斯亮藍(lán)R-250染色20min。7、制片：用蒸餾水洗1-2次，將標(biāo)本置于載玻片上，加蓋片。8、觀察：光鏡下可見表皮細(xì)胞的輪廓，細(xì)胞內(nèi)存在著染成藍(lán)色、粗細(xì)不等的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即為構(gòu)成細(xì)胞骨架的微絲束。圖15 洋蔥表皮細(xì)胞骨架五、思考題1、戊二醛、考馬斯亮蘭R250、TritonX-100是什么？在本實(shí)驗(yàn)中各起什么作用？ 2、什么是細(xì)胞骨架？它有何主要功能？ 3、列舉你所知道的動(dòng)、植物細(xì)胞中由微絲組成的結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)九 植物原生質(zhì)體的分離和活性鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)植物細(xì)胞原生質(zhì)體分離純化的方法

43、。2、了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。二、實(shí)驗(yàn)原理植物原生質(zhì)體是去除了細(xì)胞壁的裸露的細(xì)胞。在適宜的培養(yǎng)條件下，分離的原生質(zhì)體，又可重新合成新的細(xì)胞壁，經(jīng)過細(xì)胞分裂并再生成完整的植株。原生質(zhì)體可從培養(yǎng)的單細(xì)胞、愈傷組織和植物器官（葉、下胚軸等）獲得。原生質(zhì)體的分離通常采用酶解法，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶配制而成的溶液能降解細(xì)胞壁成分，使原生質(zhì)體釋放出來。原生質(zhì)體培養(yǎng)的條件和對(duì)營養(yǎng)的要求與組織、細(xì)胞培養(yǎng)相似。但原生質(zhì)體由于是除去了細(xì)胞壁，其內(nèi)部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜，所以培養(yǎng)基中要有一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑來保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定

44、，以使原生質(zhì)體在分離前細(xì)胞處于質(zhì)壁分離狀態(tài)，分離之后不致膨脹破裂。常用的滲透壓穩(wěn)定劑包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等。酶液中還應(yīng)含一定量的鈣離子，來穩(wěn)定原生質(zhì)膜。培養(yǎng)基中添加的生長素、細(xì)胞分裂素也是必須的。測定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯（FDA）染色是常用的一種方法，F(xiàn)DA本身無熒光，無極性，可透過完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后，由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原生質(zhì)膜，因此有活力的細(xì)胞能產(chǎn)生熒光，無活力的原生質(zhì)體不能分解FDA，無熒光產(chǎn)生。高等植物原生質(zhì)體除了用于細(xì)胞融合的研究以外，還能通過它們裸露的質(zhì)膜攝入外源DNA、細(xì)胞器、細(xì)菌或病毒顆粒。原生質(zhì)

45、體的這些特性與植物細(xì)胞的全能性結(jié)合在一起，已經(jīng)在遺傳工程和體細(xì)胞遺傳學(xué)中開辟了一個(gè)理論和應(yīng)用研究的嶄新領(lǐng)域。三、實(shí)驗(yàn)用品超凈工作臺(tái)、低速離心機(jī)、倒置顯微鏡、高壓滅菌鍋、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、帶蓋離心管、細(xì)菌過濾器、200目鎳絲網(wǎng)、解剖刀、鑷子、刻度吸管、培養(yǎng)皿、燒杯、綠豆、70%乙醇、0.1%升汞溶液（加入少許吐溫80）、20%蔗糖。1、0.1%2-N-嗎啡啉乙磺酸鈉（MES）或三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液：內(nèi)含20%蔗糖，pH6.0。2、酶解液：用0.1%MES或Tris配制1%(WV)纖維素酶，1% (WV)果膠酶，0.7molL甘露醇，10mmol/L CaCl2.2H2O，0.7mmol/L

46、 KH2PO4，pH 6.87.0。3、13% CPW洗滌液：用0.1%MES或Tris配制27.2mg/L KH2PO4，101.0mg/L KNO3，1480.0mg/L CaCl2.2H2O，246.0mg/L MgSO4，0.16mg/L KI，0.025mg/L CuSO4.5H2O，13%(W/V)甘露醇，pH 6.0。4、0.02%二乙基熒光素(FDA)：5mg FDA溶于1ml丙酮中，避光4下貯存，使用時(shí)取0.22ml FDA貯存液加入5ml 0.65mol/L甘露醇中，使用時(shí)使最終濃度為0.01%。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法1、綠豆種子用70 %乙醇消毒，自來水流水浸泡4 h左右，于濕濾紙上萌發(fā)。25 黑暗