CP與植物和昆蟲互作的研究學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1CP與植物和昆蟲互作的研究與植物和昆蟲互作的研究u 研究背景研究背景u 研究內(nèi)容研究內(nèi)容u 研究方法研究方法u 特色及創(chuàng)新處特色及創(chuàng)新處u 研究計劃及預(yù)期成果研究計劃及預(yù)期成果第1頁/共22頁RSVRSV引起的病癥引起的病癥病癥：水稻條紋病毒(Rice stripe virus, RSV)是水稻條紋葉枯病的致病原，該病毒靠灰飛虱傳播。癥狀：感病水稻發(fā)病初期葉片沿葉脈呈現(xiàn)斷續(xù)的黃綠色或黃白色短條斑，以后常連成褪綠大片。早期發(fā)病植株枯死，發(fā)病遲的只在劍葉或葉鞘上有褪色斑，但抽穗不良或穗畸形不實，病株分蘗一般減少。第2頁/共22頁 水稻條紋葉枯病最早于1897年在日本發(fā)現(xiàn),在我國自1963年

2、在蘇南地區(qū)始發(fā)后,已經(jīng)擴散到18個省市,特別是自2001年來在江蘇和河南連續(xù)暴發(fā),造成了水稻生產(chǎn)上的巨大損失。因此如何防止病害發(fā)生和控制病害流行成為研究者迫切希望解決的問題。RSVRSV的危害的危害第3頁/共22頁RSVRSV基因組結(jié)構(gòu)和功能基因組結(jié)構(gòu)和功能RNA1RdRpRNA2RNA3NS2NSvc2NS3CPRNA4SPMPRdRp: RNARdRp: RNA聚合酶聚合酶NSvc2: NSvc2: 推測為糖蛋白推測為糖蛋白NS3NS3：RNARNA沉默抑制子沉默抑制子CPCP： 外殼蛋白外殼蛋白SPSP： 癥狀相關(guān)蛋白癥狀相關(guān)蛋白MP: MP: 移動蛋白移動蛋白3506 nts2472

3、nts2137 nts8970 nts第4頁/共22頁RSV RSV 研究情況研究情況 初步研究的方面初步研究的方面基因組序列、某些基因功能轉(zhuǎn)基因的抗病毒植物 還需研究的方面還需研究的方面基因功能病毒的致病機理病毒的傳播機制第5頁/共22頁深入研究難點深入研究難點 RSV RSV的侵染性克隆難以建的侵染性克隆難以建立立 灰飛虱細胞系還未建立灰飛虱細胞系還未建立第6頁/共22頁立項依據(jù)及研究意義立項依據(jù)及研究意義 RSVRSV與宿主互作研究的重要性與宿主互作研究的重要性 研究的創(chuàng)新性研究的創(chuàng)新性 結(jié)合實驗條件結(jié)合實驗條件第7頁/共22頁研究內(nèi)容研究內(nèi)容 CP與水稻的互作 構(gòu)建水稻構(gòu)建水稻cDNA

4、cDNA文庫文庫 篩選篩選cDNAcDNA文庫中與文庫中與CPCP互作的蛋白互作的蛋白 蛋白功能分析蛋白功能分析 cDNA 文庫：生物某發(fā)育時期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段集合。測序、序列比對，分析基因功能。方法：酵母雙雜交系統(tǒng)第8頁/共22頁 NSvc2蛋白是否為病毒傳播必需 CP、NSvc2蛋白是否存在相互作用 NSvc2蛋白是否具有膜融合功能酵母雙雜交系統(tǒng)驗證蛋白間的互作利用桿狀病毒表達系統(tǒng)使目的蛋白展示在細胞膜上，然后研究膜融合功能 CP、NSvc2蛋白與昆蟲細胞的互作第9頁/共22頁u 水稻cDNA 文庫構(gòu)建研究方法研究方法總RNAmRNA的分離AAAATT TTm

5、RNAcDNAcDNA第一鏈合成AAAATT TTcDNA第二鏈合成AAAA5AAAATT TT加接頭，連接載體構(gòu)建cDNA文庫Oligo(dT)Oligo(dT)纖維纖維柱分離柱分離逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RNaseHDNA polymeraseDNA ligase重組載體感重組載體感染宿主菌染宿主菌第10頁/共22頁u 酵母雙雜交系統(tǒng)第11頁/共22頁BDXCOOHGal4NH2+cDNA libraryCOOHcDNAADGal4NH2 共轉(zhuǎn)化ADGal4?BDXPromoterLacZ ReporterPromoterLacZ ReporterBDX?AD酵母雙雜交系統(tǒng)原理第12頁/共22頁酵母雙

6、雜交基本過程第13頁/共22頁蛋白細胞膜表面表達載體構(gòu)建NSvc2蛋白前端連接gp64的信號肽序列，后端連接VSV G蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域， 這樣NSvc2蛋白表達后便成功展現(xiàn)在了昆蟲細胞膜上 gp64 spcp/NSvc2VSV G tm目的蛋白信號肽跨膜域第14頁/共22頁桿狀病毒表達系統(tǒng)表達蛋白第15頁/共22頁第16頁/共22頁細胞膜融合功能的研究 目的蛋白在細胞膜表面的表達檢測抗體標記TRITC， TRITC是一種熒光素，用激光共聚焦顯微鏡觀察則細胞的表面出現(xiàn)橙紅色熒光。 目的蛋白膜融合功能檢測細胞低pH條件下誘導(dǎo)，然后觀察細胞融合 的。pH shift time 0+4h+7h第17頁

7、/共22頁本研究創(chuàng)新點本研究創(chuàng)新點RSVRSV與宿主相互作用的研究還未有報道與宿主相互作用的研究還未有報道 首開了首開了RSVRSV侵染介體昆蟲機理的研究侵染介體昆蟲機理的研究利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，使目的蛋白利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，使目的蛋白呈現(xiàn)在膜上，便于研究蛋白的膜融合功能呈現(xiàn)在膜上，便于研究蛋白的膜融合功能第18頁/共22頁年度研究計劃年度研究計劃u ：RSV CP與水稻的互作u ：互作蛋白的功能分析u ：RSV侵染昆蟲細胞機制研究第19頁/共22頁預(yù)期研究成果預(yù)期研究成果構(gòu)建水稻構(gòu)建水稻cDNAcDNA文庫文庫探明探明RSV CPRSV CP功能及在病毒致病過程中所起作用功能及在病毒致病過程中所起作用RSV NSvc2RSV NS