植物花粉和花藥培養(yǎng).PPT

1、1第五章第五章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng) 大大 家家 好好 ！植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)2第五章第五章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng) 本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容：l花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應(yīng)用花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應(yīng)用l花粉小孢子發(fā)育途徑花粉小孢子發(fā)育途徑l花粉和花藥培養(yǎng)方法花粉和花藥培養(yǎng)方法 l單倍體植株鑒定和染色體加倍單倍體植株鑒定和染色體加倍 第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)3第一節(jié)第一節(jié) 花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應(yīng)用花粉和花藥培養(yǎng)的概念和應(yīng)用l花粉和花藥培養(yǎng)的概念花粉和花藥培養(yǎng)的概念l花藥和花粉培養(yǎng)的歷史花藥和花粉培養(yǎng)的歷史l花粉和花藥培養(yǎng)的應(yīng)用花粉和花藥培養(yǎng)的應(yīng)用4花粉和花藥的

2、培養(yǎng)花粉和花藥的培養(yǎng)(pollen and anther culture) 是指在人工合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑是指在人工合成培養(yǎng)基上，改變花粉的發(fā)育途徑, 使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂使其不形成配子，而像體細(xì)胞一樣進(jìn)行分裂分化，分化，由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。由單個(gè)花粉粒發(fā)育成完整單倍體植株的技術(shù)。第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)單倍體植物單倍體植物( (haplobiont) )用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個(gè)完整的用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個(gè)完整的植株。植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)、花粉培養(yǎng)；胚珠或子房培養(yǎng)（未受精）一、概念一、概念5第第5章章 花藥和

3、花粉培養(yǎng)花藥和花粉培養(yǎng)6異同點(diǎn)異同點(diǎn)：l相同點(diǎn)相同點(diǎn)：二者培養(yǎng)的目的一樣，都是要誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體細(xì)二者培養(yǎng)的目的一樣，都是要誘導(dǎo)花粉細(xì)胞發(fā)育成單倍體細(xì)胞，最后發(fā)育成單倍體植株。胞，最后發(fā)育成單倍體植株。l不同點(diǎn)不同點(diǎn)：花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)，花藥是植物花的雄性器官，包括體細(xì)胞性質(zhì)的藥花藥是植物花的雄性器官，包括體細(xì)胞性質(zhì)的藥壁和藥隔組織，以及雄性性細(xì)胞的花粉粒壁和藥隔組織，以及雄性性細(xì)胞的花粉粒花粉培養(yǎng)屬細(xì)胞培養(yǎng)花粉培養(yǎng)屬細(xì)胞培養(yǎng): : 花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾；花粉培養(yǎng)沒有藥壁組織干擾； 可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可計(jì)數(shù)小孢子產(chǎn)胚率； 可觀察雄核發(fā)育的全過程；可觀察雄核發(fā)育

4、的全過程； 單倍體產(chǎn)量高。單倍體產(chǎn)量高。 但技術(shù)更復(fù)雜，比花藥培養(yǎng)難度大。但技術(shù)更復(fù)雜，比花藥培養(yǎng)難度大。7二、植物花藥二、植物花藥/ /花粉培養(yǎng)歷史花粉培養(yǎng)歷史lGuha和和Maheshwari （1964） 曼陀羅花藥培養(yǎng)曼陀羅花藥培養(yǎng)lNitsch 和和 Norreel (1973) 煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)）煙草花粉培養(yǎng)（游離小孢子培養(yǎng)） Chu（1973）小麥花粉培養(yǎng)）小麥花粉培養(yǎng)（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自（早期花藥培養(yǎng)主要依靠小孢子的自然胚胎發(fā)生產(chǎn)生單倍體，能自發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）發(fā)形成胚胎發(fā)生的基因頻率較低，效率極低）l80

5、年代后期到年代后期到90年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子年代期間，花培技術(shù)迅速發(fā)展。許多作物小孢子培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。培養(yǎng)已經(jīng)成功。十字花科、麥類、水稻、玉米等。l90年代，一些先前被認(rèn)為是不易進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)年代，一些先前被認(rèn)為是不易進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的基因型也相續(xù)成功成功Konzak (1999) 。8通過通過花藥花藥培養(yǎng)培養(yǎng)育成育成的甜的甜椒新椒新品種品種：?；ê；ㄈ?hào)三號(hào) 9三、花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用三、花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用1)1)誘導(dǎo)形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期誘導(dǎo)形成單倍體，快速獲得純系，縮短育種周期；第第5章章 花藥和花粉培養(yǎng)花藥

6、和花粉培養(yǎng)供體植株供體植株小孢子（小孢子（n）花培花培花粉植花粉植株（株（n）雄核發(fā)育雄核發(fā)育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍純合植株純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系一年內(nèi)獲得純系常規(guī)育種需常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。1、作物育種、作物育種10常規(guī)育種在雜交常規(guī)育種在雜交F5、F6代開始選擇；花藥代開始選擇；花藥培養(yǎng)在培養(yǎng)在F1或或F2代進(jìn)行培養(yǎng)，再人工加倍處代進(jìn)行培養(yǎng)，再人工加倍處理縮短育種周期理縮短育種周期3-5年年克服后代分離，大大縮短育種周期克服后代分離，大大縮短育種周期第二節(jié)第二節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用花藥和花粉培養(yǎng)的應(yīng)用11

7、花粉單倍體是純合配子體，從來源于配子體的花粉單倍體是純合配子體，從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而，而從常規(guī)雜交從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的代群體中，選擇某一基因型的概率為概率為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的規(guī)育種的2n倍。倍。2) 12例子例子： 二倍體供體植株基因型為二倍體供體植株基因型為AaBbAaBb，若要從后代中選擇基因?yàn)椋粢獜暮蟠羞x擇基因?yàn)锳AbbAAbb的純合單株的純合單株 常規(guī)方法常規(guī)方法： AAbbAAbb出現(xiàn)的概率為出現(xiàn)的概率為1/161/16，并且不能

8、將，并且不能將AAbbAAbb與與AabbAabb、aAbbaAbb區(qū)分開。區(qū)分開。 AB aB Ab abABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBB aABb aaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabB aAbb aabb13例子例子： 二倍體供體植株基因型為二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基，若要從后代中選擇基因?yàn)橐驗(yàn)锳Abb的純合單株的純合單株單倍體方法：單倍體方法： AAbb出現(xiàn)的概率為出現(xiàn)的概率為1/4。 單倍體單倍體 二倍體二倍體AB- - AABBaB- aaBBAb- AAbbab- - aabb供體親本供體親本AaBb花培

9、從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是從來源于配子體的植株中選擇某一種基因型的概率是(1/2)n，而從常規(guī)雜交，而從常規(guī)雜交F2代群體中，選擇某一基因型的概率代群體中，選擇某一基因型的概率為為(1/2)2n，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的，故單倍體育種的選擇效率為常規(guī)育種的2n倍。倍。143)植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代當(dāng)代及時(shí)獲及時(shí)獲得突變個(gè)體，染色體加倍后成為穩(wěn)定的純系。得突變個(gè)體，染色體加倍后成為穩(wěn)定的純系。15 可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時(shí)，形成二價(jià)體的數(shù)目和形狀

10、，能確物減數(shù)分裂時(shí)，形成二價(jià)體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。 2、物種進(jìn)化研究、物種進(jìn)化研究 16 單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個(gè)單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個(gè)基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。3、遺傳分析 174、構(gòu)建連鎖圖譜、構(gòu)建連鎖圖譜 雙單倍體雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建。地用于遺傳圖譜的構(gòu)建。18l能直接表達(dá)外源基因，不受顯隱性影

11、響能直接表達(dá)外源基因，不受顯隱性影響5、用于遺傳轉(zhuǎn)化、用于遺傳轉(zhuǎn)化 19第二節(jié)第二節(jié) 花粉孢子體發(fā)育途徑花粉孢子體發(fā)育途徑l概念概念：花粉孢子體發(fā)育途徑（雄核發(fā)育途徑） 花粉是產(chǎn)生花粉植株的原始細(xì)胞，其第一次有絲分裂，在本質(zhì)上與合子的第一次孢子體分裂相似，把花粉形成植株的途徑稱為花粉孢子體發(fā)育途徑，也叫雄核發(fā)育途徑20一、花粉發(fā)育的階段一、花粉發(fā)育的階段花粉離體培養(yǎng)時(shí)，雄核發(fā)花粉離體培養(yǎng)時(shí)，雄核發(fā)育最適宜的時(shí)期一般是育最適宜的時(shí)期一般是第第一次有分裂或之前一次有分裂或之前。21二、雄核發(fā)育途徑二、雄核發(fā)育途徑1、A A途徑途徑 小孢子第一次有絲分裂為非均等分裂，形成營養(yǎng)小孢子第一次有絲分裂為非

12、均等分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞細(xì)胞和生殖細(xì)胞 （1 1）A-VA-V途徑途徑 由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體由營養(yǎng)細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （2 2）A-GA-G途徑途徑 由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體由生殖細(xì)胞重復(fù)分裂形成單倍體 （3 3）A-VGA-VG途徑（途徑（E E途徑）途徑） 由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)由營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞各自獨(dú)立分裂，共同形成單倍體立分裂，共同形成單倍體 （4 4）C C途徑途徑 營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞通過核融合，形成多倍體植株體植株2、B途徑 小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相小孢子第一次有絲分裂為均等分裂，形成大小相近的兩

13、個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞連續(xù)分裂形成單倍體植株，近的兩個(gè)細(xì)胞。然后由這兩細(xì)胞連續(xù)分裂形成單倍體植株，或者核融合形成多倍體植株或者核融合形成多倍體植株22231、雄核發(fā)育與P花粉的形成P-花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（花粉：具胚胎發(fā)生潛能的花粉。也稱小花粉（S-花粉）或不染花粉）或不染色花粉（色花粉（NS-花粉）花粉）2、雄核發(fā)育與饑餓處理饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動(dòng)雄核發(fā)育。饑餓處理改變了小孢子的配子體發(fā)育方向，啟動(dòng)雄核發(fā)育。三、雄核發(fā)育啟動(dòng)機(jī)理三、雄核發(fā)育啟動(dòng)機(jī)理241 1、胚狀體發(fā)育途徑、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開，形成花粉植株。小孢子經(jīng)

14、歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2 2、愈傷組織發(fā)育途徑、愈傷組織發(fā)育途徑 小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式四、花粉植株形態(tài)發(fā)生方式25胚狀體發(fā)育途徑胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)26通過胚狀體途徑再生形成小植株通過胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)27胚狀體發(fā)育途徑胚狀體發(fā)育途徑a) 球形胚 d) 魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)28愈傷組織發(fā)育途徑愈傷組織發(fā)育途徑部分

15、花藥產(chǎn)生愈傷組織部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)29愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)30第三節(jié)第三節(jié) 花粉和花藥培養(yǎng)方法花粉和花藥培養(yǎng)方法l一、花藥培養(yǎng)l二、花粉培養(yǎng)l三、白化苗現(xiàn)象l四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素31一、花藥培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)l1、取材、取材 鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。花蕾。l 2、消毒、消毒 70酒精擦洗花蕾表面，或酒精擦洗花蕾表面，或70酒精浸泡酒精浸泡30-60s后在后在1次氯酸鈉溶液中浸泡次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在或在0

16、.1的氯的氯化汞溶液中消毒化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗，無菌水沖洗3-5次次。l 3、培養(yǎng)、培養(yǎng) 固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，固體或液體培養(yǎng)基均可。先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株株。32二、花粉培養(yǎng)二、花粉培養(yǎng)l(一一)花粉的分離與純化花粉的分離與純化 l1、自然散落法、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法) 將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉將花藥接種

17、在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。自動(dòng)散落后，收集培養(yǎng)。l2、擠壓法、擠壓法 在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。331）磁攪拌法磁攪拌法 用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；2）超速旋切法超速旋切法 通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。l4、小孢子純化、小孢子純化 對(duì)上述方法獲得的小孢子混合對(duì)上述方法獲得的小孢子混合物進(jìn)行分級(jí)過篩、

18、梯度離心處理純化小孢子物進(jìn)行分級(jí)過篩、梯度離心處理純化小孢子3、機(jī)械游離、機(jī)械游離34梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）35(二二)花粉培養(yǎng)方式花粉培養(yǎng)方式l1、平板培養(yǎng)、平板培養(yǎng) 花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ǚ壑铆傊袒囵B(yǎng)基上培養(yǎng)。l2、液體培養(yǎng)、液體培養(yǎng) 花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣?；ǚ蹜腋≡谝后w培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。l3、雙層培養(yǎng)、雙層培養(yǎng) 花粉置固體花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，

19、凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。體培養(yǎng)基。 364、看護(hù)培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng) l 利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進(jìn)花粉小孢子發(fā)育。子發(fā)育。用一塊活躍生長的愈傷組織來看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，并使用一塊活躍生長的愈傷組織來看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，并使l其生長和增殖。這個(gè)愈傷組織塊稱為其生長和增殖。這個(gè)愈傷組織塊稱為看護(hù)愈傷組織看護(hù)愈傷組織371）在一個(gè)培養(yǎng)瓶中加入一定）在一個(gè)培養(yǎng)瓶中加入一定量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌量厚的固體培養(yǎng)基，滅菌后備用。后備用。2）在無菌條件下，將一小塊）在無菌條件下，將一小塊（1cm3）活躍生長的愈傷）活躍生長的愈傷組織接種到培養(yǎng)基上，再

20、組織接種到培養(yǎng)基上，再在愈傷組織塊上放一片在愈傷組織塊上放一片（1cm）已滅菌的濾紙，）已滅菌的濾紙，放置過夜。放置過夜。3）將分離的花粉接種到已經(jīng)）將分離的花粉接種到已經(jīng)充分吸收愈傷組織滲透液充分吸收愈傷組織滲透液的濾紙上。的濾紙上。4）單細(xì)胞分裂形成肉眼可見）單細(xì)胞分裂形成肉眼可見的小細(xì)胞團(tuán)后，即轉(zhuǎn)移到的小細(xì)胞團(tuán)后，即轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恒溫新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)，得到單細(xì)胞無性系。培養(yǎng)，得到單細(xì)胞無性系。2.38看護(hù)培養(yǎng)圖解39l5、微室培養(yǎng)、微室培養(yǎng) 利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)。利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進(jìn)行花粉培養(yǎng)。l6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)、條件培養(yǎng)基

21、培養(yǎng) 利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等培養(yǎng)基上培養(yǎng)。花藥條件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等。40微室培養(yǎng)圖示：微室培養(yǎng)圖示：1滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液周圍加石蠟油周圍加石蠟油旁邊各加石蠟油旁邊各加石蠟油蓋蓋玻片蓋蓋玻片蓋蓋玻片蓋蓋玻片平視圖平視圖凹穴載玻片凹穴載玻片置培養(yǎng)皿中置培養(yǎng)皿中2628 恒恒溫培養(yǎng)溫培養(yǎng)41花粉培養(yǎng)過程花粉培養(yǎng)過程取花蕾（鏡檢）取花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥取花藥消毒消毒分離花粉分離花粉第一節(jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)愈傷組

22、織發(fā)生愈傷組織發(fā)生42三、白化苗現(xiàn)象三、白化苗現(xiàn)象43（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理1 1、內(nèi)因、內(nèi)因供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時(shí)期。2 2、外因、外因預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)間等。3 3、機(jī)理、機(jī)理核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無性系變異也可能是原因之一。44（二）白化苗的控制（二）白化苗的控制 l通過對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行通過對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行調(diào)控。調(diào)控。45四、影響雄核發(fā)育和花粉花藥培養(yǎng)的因素四、影響雄核發(fā)育和花粉花

23、藥培養(yǎng)的因素l（一）基因型（一）基因型 植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。植物基因型是影響雄核發(fā)育的最重要的因素之一。同一物種中的不同基因型對(duì)小孢子離體誘導(dǎo)反應(yīng)差異同一物種中的不同基因型對(duì)小孢子離體誘導(dǎo)反應(yīng)差異較大。較大。 如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠(yuǎn)低于糯稻。如在水稻中，秈稻花粉培養(yǎng)力遠(yuǎn)低于糯稻。46小孢子發(fā)育時(shí)期小孢子發(fā)育時(shí)期對(duì)誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。對(duì)誘導(dǎo)雄核發(fā)育非常重要。（三）花粉發(fā)育時(shí)期（三）花粉發(fā)育時(shí)期適宜時(shí)期適宜時(shí)期：單核期：單核期,尤其是單核中、晚期尤其是單核中、晚期(單核靠邊期單核靠邊期)47蕓苔屬植物Brassica napus不同基因型的小孢子產(chǎn)胚率比較Topas

24、 10,000-200,000 1-20Westar 1000-10,000 0.1-1Delta 100-10,000 0.01-1Bounty 10-100 0.001-0.01基因型胚狀體數(shù)量/106小孢子 成苗率（%）481 1、植株生長條件、植株生長條件 光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般光溫等因素均能影響花藥培養(yǎng)力。一般 處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。處于適宜生長條件（如溫室中）較好。但物種間存在差異。2 2、植株生長時(shí)期、植株生長時(shí)期 一般是開花始期優(yōu)于開花末期。一般是開花始期優(yōu)于開花末期。3 3、P P花粉的頻率花粉的頻率 不同溫度、日照時(shí)數(shù)、氮饑餓及生長

25、物不同溫度、日照時(shí)數(shù)、氮饑餓及生長物質(zhì)處理提高質(zhì)處理提高P花粉的數(shù)量花粉的數(shù)量 （二）供體植株生長條件和生理狀態(tài)（二）供體植株生長條件和生理狀態(tài) 49l隨著細(xì)胞體積迅速增大，細(xì)胞核由中央位置推隨著細(xì)胞體積迅速增大，細(xì)胞核由中央位置推向一邊，即單核靠邊期。向一邊，即單核靠邊期。雄配子體的發(fā)育雄配子體的發(fā)育 營養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞精子精子50四分體四分體: 醋酸洋紅染色醋酸洋紅染色四分體四分體: Alexanders 染色染色單核期單核期雙核期雙核期成熟花粉粒成熟花粉粒處于不同發(fā)育時(shí)期的煙草小孢子處于不同發(fā)育時(shí)期的煙草小孢子51單核晚期單核晚期液泡液泡第一次有絲分裂后期第一次有絲分裂后期

26、雙核早期雙核早期雙核中期雙核中期生殖核生殖核生殖核生殖核營養(yǎng)核營養(yǎng)核52一般而言，單核期（第一次一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)最有絲分裂前）對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。敏感，為最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件形成雙核后，在合適的條件，主要由營養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生，主要由營養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生胚狀體。胚狀體。 53不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期發(fā)育時(shí)期發(fā)育時(shí)期物種物種減數(shù)分裂期減數(shù)分裂期草莓、番茄草莓、番茄四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄單核早中期單核早中期石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期單核晚

27、期荔枝、茄子、青椒、小麥荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期單核早期至晚期煙草煙草單核早期至雙核期單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍(lán)梨、水稻、甘藍(lán)四分孢子期至雙核四分孢子期至雙核期期玉米玉米54l對(duì)不同發(fā)育階段的花藥對(duì)不同發(fā)育階段的花藥進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)試進(jìn)行培養(yǎng)測(cè)試l確定最佳小孢子發(fā)育時(shí)確定最佳小孢子發(fā)育時(shí)期的形態(tài)特征期的形態(tài)特征l注意形態(tài)特征會(huì)因品種、注意形態(tài)特征會(huì)因品種、發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的發(fā)育狀態(tài)、環(huán)境條件的變化而發(fā)生變化變化而發(fā)生變化處于不同發(fā)育階段的煙草花芽處于不同發(fā)育階段的煙草花芽 花粉發(fā)育時(shí)期的確定花粉發(fā)育時(shí)期的確定55單核期的確定單核期的確定：l 根據(jù)細(xì)胞觀察推測(cè)，雙核期的花粉中開始根據(jù)

28、細(xì)胞觀察推測(cè)，雙核期的花粉中開始積累淀粉，不能使花粉發(fā)育成植株。通常采用積累淀粉，不能使花粉發(fā)育成植株。通常采用醋酸洋紅或碘化鉀染色，再壓片鏡檢，以確定醋酸洋紅或碘化鉀染色，再壓片鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時(shí)期?；ǚ鄣陌l(fā)育時(shí)期。l 但是接種前不可能把所有的花粉都進(jìn)行一但是接種前不可能把所有的花粉都進(jìn)行一次發(fā)育時(shí)期的鏡檢，通常是按照花蕾長度大小次發(fā)育時(shí)期的鏡檢，通常是按照花蕾長度大小與花粉發(fā)育年齡的相關(guān)性，實(shí)際操作中取一定與花粉發(fā)育年齡的相關(guān)性，實(shí)際操作中取一定大小的花蕾進(jìn)行的大小的花蕾進(jìn)行的。56A.A.通過顯微鏡下觀察確定小孢子發(fā)育時(shí)期通過顯微鏡下觀察確定小孢子發(fā)育時(shí)期 醋酸洋紅染色DAPI 染

29、色57B.B.通過花蕾外部特征確定小孢子發(fā)育時(shí)期通過花蕾外部特征確定小孢子發(fā)育時(shí)期 花蕾的外部形態(tài)特征與小孢子的發(fā)育時(shí)期有一定花蕾的外部形態(tài)特征與小孢子的發(fā)育時(shí)期有一定的相關(guān)性，花蕾萼裂基部與花冠頂部之差可以作為判的相關(guān)性，花蕾萼裂基部與花冠頂部之差可以作為判斷小孢子發(fā)育時(shí)期的基本指標(biāo)。斷小孢子發(fā)育時(shí)期的基本指標(biāo)。 58預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件 預(yù)處理目的：預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小

30、孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。量增加。 預(yù)處理方法預(yù)處理方法：主要是對(duì)花藥進(jìn)行適度的逆境處理，包括：主要是對(duì)花藥進(jìn)行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。 （四）預(yù)處理（四）預(yù)處理591 1、高低溫處理、高低溫處理 低溫冷藏低溫冷藏是最常用的方法是最常用的方法 從健壯無病植株采集花蕾，將花蕾用濕紗布包裹放入塑料袋中，置冰箱冷藏。低溫處理可阻止小孢子正常分化，使停留于單核狀態(tài)的花粉顯著增多，有利于誘導(dǎo)分化愈傷組織和胚狀體。例子例子: : 十字花科未經(jīng)低溫預(yù)處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為

31、十字花科未經(jīng)低溫預(yù)處理的花蕾，每花藥產(chǎn)胚數(shù)為4.394.39個(gè)，個(gè)，6-6-99處理處理1 1天，產(chǎn)胚數(shù)提高到天，產(chǎn)胚數(shù)提高到61.461.4個(gè)，預(yù)處理個(gè)，預(yù)處理4 4天后，胚狀體產(chǎn)量降為天后，胚狀體產(chǎn)量降為10.4710.47個(gè)。個(gè)。預(yù)處理方法：預(yù)處理方法：60 高溫處理（熱擊處理）：高溫處理（熱擊處理）： 指花藥接種后，先在較高溫度下（指花藥接種后，先在較高溫度下（30-3530-35）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移）培養(yǎng)數(shù)天，然后再移至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。至正常溫度下繼續(xù)培養(yǎng)。 例子例子: :如煙草，如煙草，3232高溫；小麥，高溫；小麥，3333高溫預(yù)處理顯著地提高了小高溫預(yù)處理顯著地提高了小孢子

32、胚胎發(fā)生能力（孢子胚胎發(fā)生能力（TouraevTouraev，19961996）612 2、化學(xué)物質(zhì)處理、化學(xué)物質(zhì)處理l包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進(jìn)行處理。甘露醇僅能包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等進(jìn)行處理。甘露醇僅能維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，維持滲透壓，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子營養(yǎng)饑餓，從而使小孢子去分化從而使小孢子去分化。 3 3、其它、其它l包括包括射線、離心、磁場等射線、離心、磁場等。 62（五）培養(yǎng)基（五）培養(yǎng)基 1.1.基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基 主要為主要為N6和和MS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。MS和和H培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：適合雙子葉植物花藥

33、培養(yǎng)；適合雙子葉植物花藥培養(yǎng)；B5培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；適合豆科和十字花科花藥培養(yǎng)；N6培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。適合禾谷類作物的花藥培養(yǎng)。Nitsch培養(yǎng)基培養(yǎng)基:適合蕓薹屬和曼陀羅屬。適合蕓薹屬和曼陀羅屬。高濃度的高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽鐵鹽對(duì)花粉胚狀體發(fā)育很重要?；钚蕴看龠M(jìn)胚狀體發(fā)育對(duì)花粉胚狀體發(fā)育很重要?；钚蕴看龠M(jìn)胚狀體發(fā)育。 63包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。u不同作物所需最適的碳源種類及濃度的所差異。不同作物所需最適的碳源種

34、類及濃度的所差異。在辣椒花藥培養(yǎng)中以6%的蔗糖濃度對(duì)胚狀體的誘導(dǎo)率為最高。u一般認(rèn)為一般認(rèn)為單子葉植物單子葉植物比雙子葉植物需糖的濃度要高。比雙子葉植物需糖的濃度要高。u玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。玉米中蔗糖效果最好；而麥類作物中，麥芽糖似乎為最好的碳源。u較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織； 較低 濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗。2.2.碳源碳源643 3、激素、激素 細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成； 生長素可誘導(dǎo)愈傷組織形成。 細(xì)胞分裂素與生長素比值高時(shí)可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗4 4、氨基酸、氨基酸5 5、活性碳、活性碳6 6、pHpH 65（六）培養(yǎng)條件（六）培養(yǎng)條件

35、 1 1、溫度、溫度 物種間有差異，物種間有差異，培養(yǎng)溫度在培養(yǎng)溫度在2528左右左右2 2、光照、光照 光暗交替培養(yǎng)，每天光暗交替培養(yǎng)，每天1218h的光照，光照強(qiáng)度的光照，光照強(qiáng)度200010000lx。3 3、植板密度、植板密度 植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。植板密度與花培效率有很大的相關(guān)性。5103到到2104ml密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對(duì)低密密度均能有效培養(yǎng)。一般來說，足夠數(shù)量的、但相對(duì)低密度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細(xì)胞分裂的空度的小孢子濃度有利于小孢子競爭營養(yǎng)、氧氣、細(xì)胞分裂的空間，從則有利于胚狀體發(fā)生。間，從則有利于胚狀體發(fā)生。66花藥組織

36、的存在對(duì)小孢子的胚性分裂具有明顯的促進(jìn)作用?；ㄋ幗M織的存在對(duì)小孢子的胚性分裂具有明顯的促進(jìn)作用。但花藥壁損傷會(huì)釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。但花藥壁損傷會(huì)釋放有毒物質(zhì)影響小雄核的發(fā)育。（七）花藥壁因素（七）花藥壁因素67第四節(jié)第四節(jié) 單倍體植株鑒定和染色體加倍單倍體植株鑒定和染色體加倍一、倍性鑒定一、倍性鑒定二、染色體加倍二、染色體加倍68一、倍性鑒定一、倍性鑒定 （為什么要進(jìn)行倍性鑒定？）（為什么要進(jìn)行倍性鑒定？）1 1、染色體直接計(jì)數(shù)法、染色體直接計(jì)數(shù)法 通常取根尖、莖尖等分生組織區(qū)進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。2 2、間接鑒定、間接鑒定（1）掃描細(xì)胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀） 主要測(cè)定葉片

37、單個(gè)細(xì)胞中DNA的含量確定細(xì)胞的倍性，材料的使用量可少到1cm2。（2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法 葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。（3）植株形態(tài)學(xué)鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。69（4 4）雜交鑒定法）雜交鑒定法自交或測(cè)交鑒定，看后代分離情況確定二倍體植株是來自小孢子還是體細(xì)胞。（5 5）分子標(biāo)記鑒定）分子標(biāo)記鑒定 包括生化標(biāo)記（如同工酶標(biāo)記）和分子標(biāo)記（如RFLP、RAPD、AFLP等）70二、染色體加倍二、染色體加倍 （為什么要進(jìn)行加倍？）（為什么要進(jìn)行加倍？）1.自然加倍自然加倍: 花粉細(xì)胞核有絲分裂或核

38、融合可自然加倍，其優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)出花粉細(xì)胞核有絲分裂或核融合可自然加倍，其優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)出現(xiàn)畸形，缺點(diǎn)是隨機(jī)性強(qiáng)，難以掌握和利用現(xiàn)畸形，缺點(diǎn)是隨機(jī)性強(qiáng)，難以掌握和利用。2.人工加倍：人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含用秋水仙素溶液浸苗、處理愈傷組織和用含0.4%0.4%秋水仙素秋水仙素的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實(shí)的二倍體植株。的羊毛脂涂抹單倍體植株的頂芽、腋芽，可得到能結(jié)實(shí)的二倍體植株。3.愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，可得到二倍體植株。愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)，可得到二倍體植株。 將單倍體植株（孢子體）的莖段、葉柄、根莖切下，置適宜的培養(yǎng)將單倍體植株（孢子體）的莖段、葉柄、根莖

39、切下，置適宜的培養(yǎng)基上使之發(fā)生愈傷組織，反復(fù)繼代后再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，基上使之發(fā)生愈傷組織，反復(fù)繼代后再將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，即可獲得較多二倍體植株。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會(huì)有一定即可獲得較多二倍體植株。由于單倍體愈傷組織在培養(yǎng)過程中會(huì)有一定高頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植高頻率的核內(nèi)有絲分裂，從而形成二倍體細(xì)胞，分化出純合的二倍體植株。株。71第一節(jié)第一節(jié) 花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)花藥和花粉培養(yǎng)技術(shù)l單倍體植物天然發(fā)生的途徑：單倍體植物天然發(fā)生的途徑：孤雌生孤雌生殖殖孤雄生孤雄生殖殖無配子生無配子生殖殖也稱單性生殖，即卵不經(jīng)過受精也能發(fā)育成

40、正常的新個(gè)體 配子體可以不經(jīng)過配子的結(jié)合，而直接產(chǎn)生孢子體的，這種現(xiàn)象叫做無配子生殖 72花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：花藥和花粉培養(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子的花藥，或離心收集胚性小孢子培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體培養(yǎng)（充足的營養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)萌發(fā)”形成小植株。形成小植株。選擇合適的供體植株（選擇合適的供體植株（F1？）？）倍性鑒定或染色體加倍73花藥培養(yǎng)脫毒花藥培養(yǎng)脫毒l1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；l花藥采取時(shí)期花藥采取時(shí)期單核期：花蕾單核期：花蕾4-64-6mmmm，花藥，花藥1 1mmmml花藥誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基花藥誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖蔗糖3030g+g+瓊脂瓊脂7 7g/Lg/Ll增殖分化培養(yǎng)基增殖分