分子診斷技術(shù)在結(jié)核病診治中的應(yīng)用

1、整理整理ppt分子診斷技術(shù)在結(jié)核病診分子診斷技術(shù)在結(jié)核病診治中的應(yīng)用治中的應(yīng)用整理整理ppt全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核病流行狀況WHO report，2013整理整理ppt全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核感染人數(shù)全球結(jié)核感染人數(shù)2004年后處于下降趨勢年后處于下降趨勢HIV患者并發(fā)結(jié)核病數(shù)量處于平穩(wěn)階段患者并發(fā)結(jié)核病數(shù)量處于平穩(wěn)階段中國結(jié)核感染人數(shù)全球排名第二中國結(jié)核感染人數(shù)全球排名第二WHO report，2013整理整理ppt全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核病流行狀況WHO report，2013整理整理ppt全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核死亡人數(shù)處于下降趨勢全球結(jié)核死

2、亡人數(shù)處于下降趨勢斯威士蘭結(jié)核病感染率最高斯威士蘭結(jié)核病感染率最高WHO report，2013整理整理ppt全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核病流行狀況Globally, an estimated 3.6% of new cases and 20.2% of previously treated cases have MDR-TBThere were an estimated 450,000 new cases of MDR-TB worldwide in 2012On average, an estimated 9.6% of MDR-TB cases have XDR-TBWHO report，

3、2013整理整理ppt全球結(jié)核病流行狀況全球結(jié)核病流行狀況 2012年全球新發(fā)結(jié)核病例為年全球新發(fā)結(jié)核病例為860萬人，萬人，中國占總數(shù)的中國占總數(shù)的12%在在860萬新病例中約萬新病例中約110萬人（萬人（13%）為為HIV陽性，這些病例的陽性，這些病例的75%在非洲在非洲 每年約有每年約有130萬人死于結(jié)核病，我國萬人死于結(jié)核病，我國為為25萬萬 結(jié)核病每結(jié)核病每24秒鐘就殺死秒鐘就殺死1人人 預(yù)計(jì)未來預(yù)計(jì)未來20年還將有年還將有3600萬人死于結(jié)萬人死于結(jié)核病。核病。 全球每年有全球每年有45萬新發(fā)萬新發(fā)MDR-TB，大約，大約4.3萬為萬為 XDR-TB流流 行行現(xiàn)現(xiàn) 狀狀感染人數(shù)多感

4、染人數(shù)多死亡人數(shù)多死亡人數(shù)多耐藥患者多耐藥患者多潛伏感染多潛伏感染多“4多多”WHO report，2013整理整理ppt結(jié)核病診治中存在的問題結(jié)核病診治中存在的問題預(yù)防預(yù)防問題問題診斷診斷問題問題治療治療問題問題醫(yī)療醫(yī)療問題問題檢驗(yàn)人員最關(guān)檢驗(yàn)人員最關(guān)心的問題心的問題整理整理ppt根據(jù)不同分子水平及技術(shù)特點(diǎn)來選擇診斷檢測體系整理整理ppt細(xì)菌載細(xì)菌載體疫苗體疫苗DNADNA疫苗疫苗靈敏度靈敏度特異性特異性標(biāo)本類型標(biāo)本類型 目的用途目的用途費(fèi)用費(fèi)用實(shí)驗(yàn)平臺實(shí)驗(yàn)平臺 檢測時間檢測時間方法選擇方法選擇方法選擇的影響因素方法選擇的影響因素整理整理ppt孵育孵育4-8周周（陽性）（陽性）（陽性）（陽性

5、）涂陽涂陽=60-98%有結(jié)核分枝桿菌，有結(jié)核分枝桿菌，因此涂陽后最好用分子生物學(xué)因此涂陽后最好用分子生物學(xué)方法進(jìn)行快速鑒定方法進(jìn)行快速鑒定整理整理pptIGRAs、TST等等RNA水平水平DNA水平水平蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)水平恒溫?cái)U(kuò)增恒溫?cái)U(kuò)增 變溫?cái)U(kuò)增變溫?cái)U(kuò)增 鑒定鑒定 鑒定鑒定+耐藥耐藥結(jié)核病分子結(jié)核病分子診斷診斷 擴(kuò)增擴(kuò)增 雜交雜交LAMP、SDA 芯片、芯片、RT-PCRSAT、TMAFISH、Probe整理整理ppt分子診斷適宜技術(shù)的選擇分子診斷適宜技術(shù)的選擇整理整理pptT-SPOT.TB與與 QFT-GI為為IGRAs實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)潛伏性結(jié)核潛伏性結(jié)核（LTBILTBI）結(jié)核菌素試驗(yàn)（結(jié)核

6、菌素試驗(yàn)（TST）T-SPOT.TBQuantiFERON-TB Gold in-tube (QFT-GI)蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)水平整理整理ppt全血全血IFN-釋放分析技術(shù)釋放分析技術(shù)(IGRA)結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子（胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌多種細(xì)胞因子（IFN-）。）。因此，檢測效應(yīng)因此，檢測效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。的診斷。由于效應(yīng)由于效應(yīng)T細(xì)胞細(xì)胞存活時間很短存活時間很短，而且，而且具有特異性具有特異性，

7、因此可，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀。以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀?；诨贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被原理的產(chǎn)品目前已被美國、加拿大、英國、德美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入等二十余個國家寫入本國的結(jié)核診療指南中本國的結(jié)核診療指南中整理整理ppt-干擾素釋放實(shí)驗(yàn)干擾素釋放實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)培養(yǎng)濾液蛋白培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP 10）早期抗原靶早期抗原靶6（ESAT-6）一、一、T-SPOT技術(shù)基礎(chǔ)技術(shù)基礎(chǔ)整理整理ppt由結(jié)核桿菌基因組由結(jié)核桿菌基因

8、組RD1區(qū)區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列均丟失該基因序列絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌絕大多數(shù)的環(huán)境分枝桿菌也不存在也不存在RD1區(qū)區(qū)結(jié)核桿菌特異抗原結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6與與CFP 10抗原抗原整理整理pptPlamaPBMCsGel BarrierErythrocytes檢測過程檢測過程分離分離PBMCs加入加入PBMCs與結(jié)核特異抗原與結(jié)核特異抗原37孵育孵育16-20小時小時PBMCs特異抗原特異抗原-干擾素抗體干擾素抗體加入標(biāo)記二抗，孵育加入標(biāo)記二抗，孵育1小時小時加入顯色液，終止反應(yīng)加入顯色液，終止反應(yīng)觀察結(jié)果：觀察

9、結(jié)果：1個斑點(diǎn)個斑點(diǎn)=1個效應(yīng)個效應(yīng)T細(xì)胞細(xì)胞整理整理ppt結(jié)果判斷圖結(jié)果判斷圖陰性結(jié)果陰性結(jié)果陽性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照空白對照抗原抗原 AESAT-6抗原抗原 BCFP10陽性對照陽性對照（PHA）整理整理ppt潛伏性結(jié)核（潛伏性結(jié)核（LTBI）診斷技術(shù)比較）診斷技術(shù)比較IGRAs與TST相比，具有更高的靈敏度和特異性IGRAs與BCG, NTM無交叉反應(yīng)，TST有交叉反應(yīng)難以從感染者中鑒別出活動性肺結(jié)核患者小于5歲兒童、免疫力低下患者不適合采用IGRAs檢測試劑成本非常高整理整理ppt costs（費(fèi)用）（費(fèi)用） availability for clinicians and other

10、health workers（醫(yī)療水平）（醫(yī)療水平） patient acceptability（患者是否接受）（患者是否接受）ease of distribution and storage（實(shí)驗(yàn)平臺）（實(shí)驗(yàn)平臺） 整理整理ppt核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)條件反應(yīng)條件擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法檢測方法代表公司代表公司RT-PCR熱循環(huán)DNA實(shí)時RocheRT-LAMP恒溫DNAEikenGenoType MTBDRplus熱循環(huán)DNAHain LifescienceCPA恒溫DNA優(yōu)思達(dá)NASBA恒溫 RNAbioMerieuxTMA恒溫RNA終點(diǎn)Gen-ProbeS

11、AT恒溫RNA實(shí)時仁度SAT：Simultaneous Amplification and Testing (RNA仁度仁度) CPA: Cross Priming Amplification (DNA/RNA,優(yōu)思達(dá)優(yōu)思達(dá))LAMP:Loop-Mediated Isothermal Amplification (DNA, Japan)TMA: Transcription Mediated Amplification (RNA, Gen-Probe)GenoType MTBDRplus：(Hain Lifescience) NASBA: Nucleic Acid Sequence-Based

12、Amplification (RNA,OT) RCA: Rolling Circle Amplification (DNA, Molecular Staging) HDA：Helicase-Dependant Amplification (DNA, Biohelix, NEB)整理整理pptRNA 拷貝數(shù)拷貝數(shù) DNA拷貝數(shù)拷貝數(shù) 生命力旺盛的病原體生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍轉(zhuǎn)錄活躍較好的愈后指標(biāo)較好的愈后指標(biāo)交叉污染少交叉污染少RNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)作為臨床分子診斷靶標(biāo)整理整理ppt二、二、SAT技術(shù)技術(shù) 同一溫度下（同一溫度下（42），以），以RNA為起始模板為起始模板，通過，通

13、過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個雙鏈個雙鏈DNA拷貝拷貝，然后利用，然后利用T7 RNA多聚酶多聚酶從從DNA拷貝上產(chǎn)生多個（拷貝上產(chǎn)生多個（1001000個）個）RNA拷貝；每一個拷貝；每一個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴(kuò)增循環(huán)；拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴(kuò)增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的同時，帶有熒光標(biāo)記的探針探針和這些和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實(shí)時捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況號可由熒光檢測儀器實(shí)時捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況RNA(+)Forward PrimerRTRNase H activityRevers

14、e PrimerRTT7100-1000 copiesMolecular BeaconReverse PrimerForward PrimerRT/RNase H activityRNA(+)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(-)DNA(+)RNA(-)RNA(-)RNA(-)DNA(+)DNA(+)整理整理pptTB-SAT操作步驟操作步驟陽性結(jié)果陽性結(jié)果陰性結(jié)果陰性結(jié)果恒溫?cái)U(kuò)增 -42CRNA 檢測 -起始靶標(biāo)與擴(kuò)增產(chǎn)物都是RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的污染更少 -RNA環(huán)境中易降解更高的擴(kuò)增效率-30分鐘內(nèi)擴(kuò)增10億倍反應(yīng)穩(wěn)定 - 抑制物少高靈敏度、特異性活菌檢測操作簡單、快速整理整理ppt

15、整理整理pptMTBDRsl-鑒定鑒定XDRMTBDRplus-鑒定鑒定MDRMTBC-鑒定鑒定MTB復(fù)合群復(fù)合群MTBCM-鑒定鑒定MTB和和NTMGene-Probe(TMA/Hain)技術(shù)技術(shù)整理整理ppt三、三、MTBC-鑒定鑒定MTB復(fù)合群復(fù)合群(TMA技術(shù)技術(shù))方法名稱：方法名稱： HPV（Hybridization Protection Assay）-雜交保護(hù)分析法為雜交保護(hù)分析法為Gen-probe公司專利公司專利原理：原理： 以以rRNA為靶標(biāo)，采用線性探針技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群為靶標(biāo)，采用線性探針技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測設(shè)備：檢測設(shè)備： LEADER 50iHPA

16、-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct): 2.5h 報(bào)告，直接從標(biāo)本中檢測結(jié)核菌報(bào)告，直接從標(biāo)本中檢測結(jié)核菌HPA-Accuprobe: 1h 報(bào)告，用菌落或自動培養(yǎng)系統(tǒng)的菌報(bào)告，用菌落或自動培養(yǎng)系統(tǒng)的菌整理整理ppt樣本樣本細(xì)胞溶解細(xì)胞溶解目標(biāo)目標(biāo) r-RNA釋放釋放MTD技術(shù)路線技術(shù)路線雜交體雜交體rRNAAEAEAEAEAEAEAEAE60C15分鐘分鐘加入探針加入探針探針探針雜交雜交AEAEAE選擇性試劑選擇性試劑60C化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀 熒光檢測熒光檢測整理整理pptMTD技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)整理整理pptMTD結(jié)核分枝桿菌檢測技術(shù)特點(diǎn)結(jié)

17、核分枝桿菌檢測技術(shù)特點(diǎn)n采用分子技術(shù)快速鑒定（2.5小時小時）結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群n標(biāo)本可以是涂片陰性或者陽性涂片陰性或者陽性的痰標(biāo)本；也可以是培養(yǎng)物n唯一獲得FDA推薦推薦的凃陰樣本快速檢測技術(shù)n檢測RNA，RNA只能來源于活的細(xì)菌，可鑒定活動性結(jié)核病人）n采用TMA恒溫?cái)U(kuò)增恒溫?cái)U(kuò)增，不使用PCR儀器，無需專業(yè)的PCR實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證nHPA雜交保護(hù)分析技術(shù)：靈敏、特異靈敏、特異n嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室防污染技術(shù)實(shí)驗(yàn)室防污染技術(shù)：整個實(shí)驗(yàn)過程所有試劑和樣本全部在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，杜絕交叉污染整理整理pptMTD結(jié)核分枝桿菌的直接檢測意義結(jié)核分枝桿菌的直接檢測意義nTB與其他分枝桿菌區(qū)分與其他分枝桿菌區(qū)分 A

18、IDS患者鳥分枝桿菌小腸黏膜感染患者鳥分枝桿菌小腸黏膜感染 龜分枝桿菌引起嚴(yán)重院內(nèi)感染（南方某醫(yī)院）龜分枝桿菌引起嚴(yán)重院內(nèi)感染（南方某醫(yī)院）n提高提高TB檢出率檢出率 CSF、胸腹水等、胸腹水等n疑似患者疑似患者 長期低熱、長期低熱、ESR持續(xù)增快，排除腫瘤和免疫性疾病患者，持續(xù)增快，排除腫瘤和免疫性疾病患者，做血、痰做血、痰TB菌菌MTD檢測檢測整理整理pptDNA作為臨床分子診斷作為臨床分子診斷靶標(biāo)靶標(biāo)整理整理ppt四、四、MTBDRplus-鑒定鑒定MDR方法名稱：方法名稱： 耐多藥結(jié)核病耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)快速診斷為快速診斷為Hain Lifescience公司公司專利專利原理

19、：原理： 采用采用線性探針技術(shù)線性探針技術(shù)（Line-Probe或稱或稱DNA-Strip）檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)）檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群合群利福平利福平(rpoB)和異煙肼和異煙肼(katG和和inhA)等結(jié)核治療藥物的等結(jié)核治療藥物的耐藥基因耐藥基因來來判斷判斷TB體內(nèi)耐藥性體內(nèi)耐藥性MTBDRplus: 6h報(bào)告結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定與耐藥結(jié)果報(bào)告結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定與耐藥結(jié)果整理整理ppt抗 結(jié) 核藥物 靶基因 編碼的產(chǎn)物 靶區(qū)域和突變率 最常見突變位點(diǎn) 耐藥水平 RFPrpoBRNA聚合酶亞單位RRDR 81 bp，95Codon531，30-75高INHkatG過氧化氫酶-過氧化物酶

20、整個基因，60-95S315T，60-95高INHinhA烯?；€原酶調(diào)節(jié)區(qū)，25inhA-15低INHa h p C -Promoter過氧化物酶啟動區(qū)，12%低PZApncA吡嗪酰胺酶整個基因，68-97無特定位點(diǎn)高EMBembB阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶ERDR少數(shù)密碼子， 47-94Codon306，47-89高SMrpsL核糖體蛋白S12Codons 43 和88， 40-95K43R，40-90高SMrrs16S rRNA多個堿基，29%513位、905位堿基，各占10.3%低喹 諾 酮類gyrAgyrBDNA旋轉(zhuǎn)酶67106位,75-94%Codon90,94高結(jié)核耐藥結(jié)核耐藥的分子的分子

21、機(jī)制機(jī)制整理整理pptMTBDRplus技術(shù)路線技術(shù)路線DNA提取提取PCR擴(kuò)增擴(kuò)增探針雜交探針雜交結(jié)果判讀結(jié)果判讀整理整理ppt結(jié)果解釋結(jié)果解釋 野生型：有雜交帶顯色為野生型：有雜交帶顯色為“+”，表示未發(fā)生突變，表示未發(fā)生突變 耐藥突變位點(diǎn)：有雜交帶顯耐藥突變位點(diǎn)：有雜交帶顯色為色為“+”，表示發(fā)生突變，表示發(fā)生突變 敏感：所有野生型探針敏感：所有野生型探針“+”和所有耐藥位點(diǎn)探針和所有耐藥位點(diǎn)探針“-” 耐藥：對應(yīng)藥物有耐藥：對應(yīng)藥物有1條野生條野生型探針型探針“-”或有或有1條耐藥位點(diǎn)條耐藥位點(diǎn)“+”整理整理ppt 優(yōu)勢優(yōu)勢快速檢測快速檢測RFP和和INH的耐藥的耐藥時間短、操作簡單、

22、安全高時間短、操作簡單、安全高 特異性和靈敏度較高、重復(fù)性好特異性和靈敏度較高、重復(fù)性好主觀因素影響小、更為可靠主觀因素影響小、更為可靠不足不足不能檢測所有藥物的耐藥基因型不能檢測所有藥物的耐藥基因型缺少缺少ahpC-oxyR間隔序列范圍間隔序列范圍不能取代傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測、只能不能取代傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測、只能作為參考作為參考技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)MTBDRplus技術(shù)技術(shù)整理整理ppt方法方法結(jié)果結(jié)果比例法藥敏結(jié)果比例法藥敏結(jié)果耐藥耐藥敏感敏感靈敏度（靈敏度（% %）特異度（特異度（% %）符合率（符合率（% %）MTBDRplusRFP耐藥耐藥48098.0100.098.5敏感敏感116RFP（涂陽

23、）耐藥耐藥391295.192.192.7敏感敏感2140INH耐藥耐藥45086.5100.089.7敏感敏感716INH（涂陽）耐藥耐藥63098.4100.099.5敏感敏感1129MTBDRplus技術(shù)性能參數(shù)技術(shù)性能參數(shù)J Clin Microbiol. 2010 Aug;45(8):2635-40. Epub 2007 May 30整理整理pptMTBDRplus技術(shù)性能參數(shù)技術(shù)性能參數(shù)中國人群存在一定中國人群存在一定數(shù)量的數(shù)量的KatG S315N突變突變整理整理pptnWHO、蓋茨基金會推薦使用的快速線性探針技術(shù)，可以在6小時小時內(nèi)給出藥敏鑒定結(jié)果n可以做一線結(jié)核藥物一線結(jié)核藥

24、物（異煙肼 利福平）、二線結(jié)核藥物二線結(jié)核藥物的耐藥檢測（乙胺丁醇、氟喹諾酮類藥物、可注射結(jié)核藥物）n標(biāo)本可是涂片陽性的痰標(biāo)本痰標(biāo)本，或是培養(yǎng)物培養(yǎng)物n技術(shù)步驟簡單技術(shù)步驟簡單：核酸提取、PCR擴(kuò)增、核酸雜交儀檢測n每個試劑條上自帶質(zhì)控：CC雜交質(zhì)控、AC擴(kuò)增質(zhì)控、TUB結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控，確保整個實(shí)驗(yàn)流程的可信度可信度 HAIN-結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)特點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)特點(diǎn)整理整理ppt五、交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)五、交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (Cross Priming Amplification, CPA) 本試劑盒將病原體本試劑盒將病原體DNA擴(kuò)增、核酸雜交和核酸試擴(kuò)增、核酸

25、雜交和核酸試紙條檢測三種技術(shù)有機(jī)地融為一體，在恒溫?cái)U(kuò)增反紙條檢測三種技術(shù)有機(jī)地融為一體，在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中加入應(yīng)中加入兩對兩對TB特異性引物、一對特異性探針特異性引物、一對特異性探針，同，同時一次性完成時一次性完成TB DNA的擴(kuò)增及雜交過程，然后用的擴(kuò)增及雜交過程，然后用3號一次性號一次性核酸檢測裝置核酸檢測裝置對對TB感染進(jìn)行定性診斷，其感染進(jìn)行定性診斷，其檢測檢測靈敏度為靈敏度為10個病原體，高特異引物個病原體，高特異引物設(shè)計(jì)確保了設(shè)計(jì)確保了結(jié)果的可靠性。由于待測樣本的擴(kuò)增（結(jié)果的可靠性。由于待測樣本的擴(kuò)增（PCR管蓋和管蓋和石蠟油雙重保護(hù)）和檢測過程均在石蠟油雙重保護(hù)）和檢測過程均在物理

26、封閉條件物理封閉條件下下完成，所以本試劑盒具有防止實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增物完成，所以本試劑盒具有防止實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增物交叉污交叉污染染，防止假陽性的效果，防止假陽性的效果杭州優(yōu)思達(dá)公司杭州優(yōu)思達(dá)公司整理整理pptCPA技術(shù)原理圖技術(shù)原理圖A:引入交叉引入交叉引物位點(diǎn)引物位點(diǎn)B:交叉引交叉引物擴(kuò)增物擴(kuò)增C:檢測產(chǎn)物檢測產(chǎn)物整理整理pptCPA技術(shù)路線圖技術(shù)路線圖核酸提取核酸提取痰液痰液石蠟油石蠟油反應(yīng)液反應(yīng)液試劑配制試劑配制63 2恒溫?cái)U(kuò)增恒溫?cái)U(kuò)增金屬浴金屬浴防污染檢測裝置防污染檢測裝置取出反應(yīng)管取出反應(yīng)管15-30分鐘分鐘讀取結(jié)果讀取結(jié)果整理整理ppt有色顆粒有色顆粒抗抗A抗體抗體雙重標(biāo)記的雙重標(biāo)記的特異性擴(kuò)增

27、物特異性擴(kuò)增物陽性陽性抗抗體抗抗體有色顆粒有色顆粒抗抗A抗體抗體停留，顯色停留，顯色試紙條檢測結(jié)果判讀原理圖試紙條檢測結(jié)果判讀原理圖抗體包被的顆?？贵w包被的顆粒有色顆粒有色顆?？箍笰抗體抗體陰性陰性無特異性擴(kuò)增物無特異性擴(kuò)增物抗抗體抗抗體有色顆粒有色顆?？箍笰抗體抗體無抗抗原無抗抗原有色顆粒流出有色顆粒流出停留，但無色停留，但無色整理整理ppt結(jié)果的判讀結(jié)果的判讀n 陽性：陽性：試紙條出現(xiàn)試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶兩條紅色條帶，一條位于質(zhì)控區(qū)（，一條位于質(zhì)控區(qū)（C C線），一條位于線），一條位于檢測檢測 區(qū)（區(qū)（T T線）且其強(qiáng)度線）且其強(qiáng)度L4L4（與附帶的色卡比較）。表明樣本中含有（與附帶的色

28、卡比較）。表明樣本中含有結(jié)核分枝桿菌，且其水平達(dá)到或超過本試劑盒的最低檢出限結(jié)核分枝桿菌，且其水平達(dá)到或超過本試劑盒的最低檢出限n 陰性陰性：試紙條質(zhì)控區(qū)（試紙條質(zhì)控區(qū)（C C線）出現(xiàn)一線）出現(xiàn)一條紅色條帶條紅色條帶，檢測區(qū)（，檢測區(qū)（T T線）沒有條線）沒有條帶或者其強(qiáng)度帶或者其強(qiáng)度L4L4（與附帶的色卡比較）。表明樣本中不含結(jié)核分枝桿菌，（與附帶的色卡比較）。表明樣本中不含結(jié)核分枝桿菌，或其水平低于本試劑盒的最低檢出限或其水平低于本試劑盒的最低檢出限n 無效無效：試紙條質(zhì)控區(qū)（試紙條質(zhì)控區(qū)（C C線）線）未出現(xiàn)條帶未出現(xiàn)條帶。表明試劑盒已損壞、失效或。表明試劑盒已損壞、失效或者操作有誤者操

29、作有誤恒溫?cái)U(kuò)增恒溫?cái)U(kuò)增-CPA整理整理pptCAP技術(shù)技術(shù)CPA的優(yōu)勢：快速，簡單，靈活，穩(wěn)定的優(yōu)勢：快速，簡單，靈活，穩(wěn)定ffordable低價低價: 不需昂貴的設(shè)備和分子實(shí)驗(yàn)室不需昂貴的設(shè)備和分子實(shí)驗(yàn)室Sensitive靈敏：靈敏：10個菌個菌/ml；與快培比較：；與快培比較：87%Specific特異：能鑒別人型和牛型特異：能鑒別人型和牛型結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌User-friendly容易使用：不需容易使用：不需PCR儀儀, 操作簡單操作簡單Rapid/robust快速快速/穩(wěn)定：樣本到結(jié)果穩(wěn)定：樣本到結(jié)果2小時小時Equipment-free無儀器：僅需離心機(jī)、水浴鍋或金屬浴無儀器

30、：僅需離心機(jī)、水浴鍋或金屬浴Deliverable易儲運(yùn)：不需冷鏈運(yùn)輸。裝置易儲運(yùn)：不需冷鏈運(yùn)輸。裝置可儲存于室溫可儲存于室溫ASSURED 整理整理pptCPA技術(shù)性能參數(shù)技術(shù)性能參數(shù)整理整理ppt六、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)六、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP ) 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法是日本榮研化學(xué)獨(dú)立研發(fā)的一種環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法是日本榮研化學(xué)獨(dú)立研發(fā)的一種“簡便、快速、準(zhǔn)簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價確、廉價”的基因擴(kuò)增方法。它的特征是針對目標(biāo)的基因擴(kuò)增方法。它的特征是針對目標(biāo)DNA鏈上的鏈上的六個區(qū)段六個區(qū)段設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)四個不同的引物

31、四個不同的引物，然后再利用，然后再利用鏈置換反應(yīng)鏈置換反應(yīng)在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)。在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)只需要把基因模板、引物、鏈置換型反應(yīng)只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度下一定溫度下（60-65）、經(jīng)一個步驟即可完成。擴(kuò)增效率極高，可在）、經(jīng)一個步驟即可完成。擴(kuò)增效率極高，可在15min-1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)內(nèi)實(shí)現(xiàn)109-1010倍的擴(kuò)增。而且由于有著高度的特異性，只需根倍的擴(kuò)增。而且由于有著高度的特異性，只需根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的有無可對靶基因序列的存在與否作出判斷據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的有無可對靶基因序列的存在與否作出判斷 不需要使雙鏈不需要使雙鏈D

32、NA先變性成單鏈先變性成單鏈 擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增反應(yīng)在等溫等溫下可持續(xù)進(jìn)行下可持續(xù)進(jìn)行 擴(kuò)增擴(kuò)增效率極高效率極高 針對六個區(qū)段使用兩種不同的引物，可特異性擴(kuò)增靶基因序列針對六個區(qū)段使用兩種不同的引物，可特異性擴(kuò)增靶基因序列 僅使用一種鏈置換僅使用一種鏈置換DNA聚合酶，聚合酶，成本低廉成本低廉 擴(kuò)增產(chǎn)物是在同一條擴(kuò)增產(chǎn)物是在同一條DNA鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 當(dāng)模板是當(dāng)模板是RNA時，僅需加入時，僅需加入逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶即可與即可與DNA一樣進(jìn)行擴(kuò)增一樣進(jìn)行擴(kuò)增整理整理pptLAMP技術(shù)原理動畫圖技術(shù)原理動畫圖整理整理ppt整理整理pptLAM

33、P方法建立階段所需的試劑方法建立階段所需的試劑 DNA 擴(kuò)增擴(kuò)增 RNA擴(kuò)增擴(kuò)增 n模板模板DNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶ndNTPsn反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液n模板模板RNAn引物引物FIPF3BIPB3nBstDNA 聚合酶聚合酶n逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶ndNTPsn反應(yīng)緩沖液反應(yīng)緩沖液整理整理pptLAMP技術(shù)結(jié)果判讀原理圖技術(shù)結(jié)果判讀原理圖LAMP法結(jié)果判斷方式法結(jié)果判斷方式-目視檢查混濁目視檢查混濁 LAMP法結(jié)果判斷方式法結(jié)果判斷方式/-目視檢查綠色熒光目視檢查綠色熒光/濁度檢測儀濁度檢測儀 整理整理pptn 擴(kuò)增反應(yīng)在等溫條件（擴(kuò)增反應(yīng)在等溫條件（6065

34、）下連續(xù)進(jìn)行）下連續(xù)進(jìn)行 可以使用簡便、廉價的擴(kuò)增裝置可以使用簡便、廉價的擴(kuò)增裝置n 擴(kuò)增效率高、可在短時間內(nèi)完成擴(kuò)增擴(kuò)增效率高、可在短時間內(nèi)完成擴(kuò)增 可在短時間內(nèi)得出結(jié)果可在短時間內(nèi)得出結(jié)果n 有非常高的特異性有非常高的特異性 可得出可得出“擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生=有目的菌存在有目的菌存在”的結(jié)論的結(jié)論n 產(chǎn)生大量擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測方法簡便產(chǎn)生大量擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測方法簡便 無需用電泳、特殊探針等，可通過濁度儀、熒光目視無需用電泳、特殊探針等，可通過濁度儀、熒光目視 方法確認(rèn)擴(kuò)增結(jié)果方法確認(rèn)擴(kuò)增結(jié)果n 從擴(kuò)增到檢測可在從擴(kuò)增到檢測可在1個反應(yīng)試管內(nèi)（封閉系統(tǒng)）完成個反應(yīng)試管內(nèi)（封閉系統(tǒng)）完成 可防

35、止由于擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的污染可防止由于擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的污染n 從從RNA經(jīng)一步反應(yīng)可完成擴(kuò)增經(jīng)一步反應(yīng)可完成擴(kuò)增 無需另外進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)無需另外進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)LAMP技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)整理整理pptLAMP技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域 食品領(lǐng)域食品領(lǐng)域 食物中毒致病菌的檢測食物中毒致病菌的檢測 食品的衛(wèi)生管理食品的衛(wèi)生管理 食物中毒的防止食物中毒的防止 臨床領(lǐng)域臨床領(lǐng)域 病原菌病原菌、病毒的檢測及鑒定病毒的檢測及鑒定 通過通過SNP多態(tài)性分型決定用多態(tài)性分型決定用藥量藥量 農(nóng)業(yè)領(lǐng)域農(nóng)業(yè)領(lǐng)域 植物病害的早期發(fā)現(xiàn)植物病害的早期發(fā)現(xiàn)及蔓延防止及蔓延防止 轉(zhuǎn)基因作物的檢測轉(zhuǎn)基因作物的檢測 環(huán)境領(lǐng)域環(huán)境領(lǐng)域 環(huán)

36、境、水中病原微生物的檢環(huán)境、水中病原微生物的檢測測 工業(yè)領(lǐng)域工業(yè)領(lǐng)域 工業(yè)產(chǎn)品用大量工業(yè)產(chǎn)品用大量DNA的生的生產(chǎn)成為可能產(chǎn)成為可能 畜牧業(yè)領(lǐng)域畜牧業(yè)領(lǐng)域 雌雄性別判斷雌雄性別判斷 病原微生物的檢測病原微生物的檢測 遺傳病的發(fā)現(xiàn)遺傳病的發(fā)現(xiàn)整理整理pptLAMP技術(shù)性能參數(shù)技術(shù)性能參數(shù)整理整理ppt七、七、DNA微陣列（基因芯片）技術(shù)微陣列（基因芯片）技術(shù) DNA微陣列或芯片技術(shù)是利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷以及固相微陣列或芯片技術(shù)是利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相表面合成成千上萬個表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針，或?qū)⒐押塑账崽结?，?/p>

37、將液相合成的探針液相合成的探針由微陣列器或機(jī)器人點(diǎn)樣于由微陣列器或機(jī)器人點(diǎn)樣于尼龍膜或硅片尼龍膜或硅片上，再與上，再與放射放射性同位素或熒光物標(biāo)記的性同位素或熒光物標(biāo)記的DNA或或cDNA雜交雜交，用于分析，用于分析DNA突變及多態(tài)突變及多態(tài)性、性、DNA測序、監(jiān)測同一組織細(xì)胞在不同狀態(tài)下多種組織細(xì)胞基因表達(dá)測序、監(jiān)測同一組織細(xì)胞在不同狀態(tài)下多種組織細(xì)胞基因表達(dá)水平的差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關(guān)基因等多個研究領(lǐng)域水平的差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關(guān)基因等多個研究領(lǐng)域博奧生物博奧生物整理整理ppt基因芯片技術(shù)操作流程基因芯片技術(shù)操作流程樣品制備樣品制備試劑配制試劑配制雜交雜交激光共焦掃描激

38、光共焦掃描軟件判讀軟件判讀整理整理pptr分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）微陣列芯片法）同時快速檢測同時快速檢測 17 種分枝桿菌：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、種分枝桿菌：結(jié)核、胞內(nèi)、鳥、戈登、堪薩斯、偶然、瘰疬、淺黃、土、龜龜-膿腫、草、不色、海膿腫、草、不色、海-潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍及恥垢。潰瘍、金色、蘇爾加、蟾蜍及恥垢。分離株或者痰樣本均可檢測。分離株或者痰樣本均可檢測。 通通 量：量：同時檢測同時檢測 17 種分枝桿菌種分枝桿菌速速 度：度：6小時小時 versus 傳統(tǒng)傳統(tǒng) 4 周周靈敏度：靈敏度： 103 CFU/反應(yīng)反應(yīng)特異性：防污染體系；對照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動判讀特異性：防污染體系；對照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)