核酸的分離純化PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計(jì)學(xué)1核酸的分離純化核酸的分離純化第五章第五章 核酸的分離純化核酸的分離純化第1頁/共152頁第五章第五章 核酸的分離純化核酸的分離純化第2頁/共152頁第五章第五章 核酸的分離純化核酸的分離純化第3頁/共152頁第4頁/共152頁第一節(jié)第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第二節(jié)第二節(jié) 基因組基因組DNADNA的分離純化的分離純化第三節(jié)第三節(jié) 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取與純化的提取與純化第四節(jié)第四節(jié) RNARNA的分離純化的分離純化第5頁/共152頁第6頁/共152頁一、材料與方法的選擇一、材料與方法的選擇二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)三、核酸的鑒定與保存三、核酸的

2、鑒定與保存第一節(jié)第一節(jié) 核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則核酸分離純化的設(shè)計(jì)及原則第7頁/共152頁一、材料與方法的選擇一、材料與方法的選擇（一） 材料與方法的選擇（二） 選擇原則 第8頁/共152頁一、材料與方法的選擇一、材料與方法的選擇第9頁/共152頁 1、保持核酸堿基序列的完整性 2、盡量清除其它分子的污染，保證核酸純度 3、保持核酸的完整性 應(yīng)盡量簡化分離純化步驟，縮短提取時(shí)間 盡量避免各種有害因素對核酸的破壞 （二） 選擇原則一、材料與方法的選擇一、材料與方法的選擇第10頁/共152頁二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)（一）核酸的釋放（二）核酸的分離與純化（三）核酸的濃縮、沉淀與洗滌第11

3、頁/共152頁二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)第12頁/共152頁細(xì)胞破碎方法 應(yīng)用 機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母 物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞 化學(xué)法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母第13頁/共152頁第14頁/共152頁第15頁/共152頁第16頁/共152頁（二）核酸的分離與純化二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)第17頁/共152頁二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)二、技術(shù)路線的設(shè)計(jì)第18頁/共152頁三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存（一）核酸的鑒定（二）核酸的保存第19頁/

4、共152頁（一）核酸的鑒定（一）核酸的鑒定1、濃度鑒定2、純度鑒定3、完整性鑒定三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第20頁/共152頁1、濃度鑒定三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第21頁/共152頁 各種堿基的紫外吸收光譜各種堿基的紫外吸收光譜三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第22頁/共152頁三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第23頁/共152頁EB與DNA的結(jié)合第24頁/共152頁2、純度鑒定三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第25頁/共152頁1. DNA1. DNA或或RNARNA的定量的定量ODOD260260相當(dāng)于相當(dāng)于5050g/mlg/ml雙鏈

5、雙鏈DNADNA4040g/mlg/ml單鏈單鏈DNADNA（或（或RNARNA）20g/ml20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.2.判斷核酸樣品的純度判斷核酸樣品的純度DNADNA純品純品: : ODOD260260/OD/OD280 280 RNARNA純品純品: : ODOD260260/OD/OD280 280 三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第26頁/共152頁(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，20 g/ml單鏈寡核苷酸）第27頁/共152頁三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第28頁/共152頁第29頁/共152頁3、完整性鑒定

6、三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第30頁/共152頁DNADNA片段的降解片段的降解三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第31頁/共152頁三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第32頁/共152頁三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第33頁/共152頁 總總RNARNA電泳圖譜電泳圖譜三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第34頁/共152頁 正常時(shí)，正常時(shí)，28S RNA的熒光強(qiáng)度的熒光強(qiáng)度約為約為18S RNA的的2倍，否則提示倍，否則提示RNA的降解的降解第35頁/共152頁（二）核酸的保存1、DNA的儲存2、RNA的儲存三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第3

7、6頁/共152頁三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存（二）核酸的保存 _DNA的儲存第37頁/共152頁三、核酸的鑒定與保存三、核酸的鑒定與保存第38頁/共152頁第39頁/共152頁生物體組織細(xì)胞玻棒纏繞法酚抽提法基因組 DNA粗品PFGE分離特定的DNA片段AGE分離PAGE分離乙醇沉淀洗滌基因組DNA純品精分離 粗分離前處理離子交換層析純化有機(jī)溶劑抽提細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)變性沉淀降解DNA釋放甲酰胺解聚法 哺乳動物基因組DNA分離純化的一般技術(shù)路線第二節(jié)第二節(jié) 真核基因組真核基因組DNADNA的分離純化的分離純化第40頁/共152頁第二節(jié)第二節(jié) 真核基因組真核基因組DNADNA的分離純化的

8、分離純化一、酚抽提法二、甲酰胺解聚法三、玻棒纏繞法四、其它方法五、DNA片段的純化六、DNA片段的回收第41頁/共152頁DNA酚抽提法示意圖 一、酚抽提法一、酚抽提法第42頁/共152頁第43頁/共152頁第44頁/共152頁第45頁/共152頁第46頁/共152頁第47頁/共152頁第48頁/共152頁第49頁/共152頁第50頁/共152頁第51頁/共152頁第52頁/共152頁第53頁/共152頁第54頁/共152頁第55頁/共152頁第56頁/共152頁DNA玻棒纏繞法示意圖 三、玻棒纏繞法三、玻棒纏繞法第57頁/共152頁第58頁/共152頁第59頁/共152頁DNA柱層析法柱層析

9、法示意圖示意圖五、五、 DNADNA片段的純化片段的純化第60頁/共152頁第61頁/共152頁（二） 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段（一） 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段第62頁/共152頁六、六、 DNADNA片段的回收片段的回收第63頁/共152頁第64頁/共152頁第65頁/共152頁第66頁/共152頁第67頁/共152頁第68頁/共152頁六、六、 DNADNA片段的回收片段的回收第69頁/共152頁六、六、 DNADNA片段的回收片段的回收第70頁/共152頁第71頁/共152頁第72頁/共152頁第73頁/共152頁第74頁/共152頁第75頁/共152頁第76頁/共152頁第7

10、7頁/共152頁第78頁/共152頁第79頁/共152頁第80頁/共152頁第81頁/共152頁第82頁/共152頁第83頁/共152頁第84頁/共152頁第85頁/共152頁第86頁/共152頁第87頁/共152頁第88頁/共152頁二、煮沸裂解法三、SDS裂解法四、其它方法一、 堿裂解法五、質(zhì)粒DNA的純化第89頁/共152頁第90頁/共152頁第91頁/共152頁一、堿裂解法一、堿裂解法堿裂解法示意圖第92頁/共152頁第93頁/共152頁第94頁/共152頁第95頁/共152頁第96頁/共152頁第97頁/共152頁第98頁/共152頁（二）牙簽少量制備法(一) 小量一步提取法第99頁

11、/共152頁第100頁/共152頁第101頁/共152頁第102頁/共152頁第103頁/共152頁第104頁/共152頁五、質(zhì)粒五、質(zhì)粒DNADNA的純化的純化第105頁/共152頁第106頁/共152頁第107頁/共152頁EBCsCl密度梯度離心法示意圖五、質(zhì)粒五、質(zhì)粒DNADNA的純化的純化第108頁/共152頁五、質(zhì)粒五、質(zhì)粒DNADNA的純化的純化第109頁/共152頁第110頁/共152頁第111頁/共152頁第112頁/共152頁第113頁/共152頁內(nèi)源性內(nèi)源性RNA酶酶第114頁/共152頁第115頁/共152頁第116頁/共152頁第117頁/共152頁第118頁/共15

12、2頁第119頁/共152頁OC-CH2-CH3OC-CH2-CH3O=DEPC水制備：0.1%DEPC在37C處理1h，并高壓滅菌15min。玻璃制品和塑料制品應(yīng)浸泡在0.1%的DEPC水溶液中， 37C處理1h或室溫下過夜。DEPC非選擇性的修飾蛋白質(zhì)和RNA，且與一些緩沖液不相容，故在分離和純化RNA的過程中不使用DEPC。第120頁/共152頁第121頁/共152頁第122頁/共152頁二、酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法三、商品化的單相裂解試劑法分RNA四、mRNA的分離純化一、RNA制備的條件與環(huán)境第123頁/共152頁第124頁/共152頁第125頁/共152頁第126頁/共152頁

13、第127頁/共152頁第128頁/共152頁第129頁/共152頁第130頁/共152頁第131頁/共152頁第132頁/共152頁第133頁/共152頁第134頁/共152頁第135頁/共152頁第136頁/共152頁第137頁/共152頁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+總RNA中的poly(A) +RNA分子退火形成雜交體 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5鏈親和素標(biāo)記的磁珠+Streptavidin- 磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合 磁性分離5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁鐵3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁洗滌與洗脫水相(含純化的mRNA)固相生物素標(biāo)記的oligo(dT)磁鐵5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptav