體外生物測定及其在新藥開發(fā)中的應(yīng)用

1、.體外生物測定及其在新藥開發(fā)中的應(yīng)用沈嘉 摘要：簡介用體外模型以離體細(xì)胞或純化酶測定試驗(yàn)樣品，對受體及酶的拮抗或抑制作用的體外生物測定法在國外新藥及標(biāo)準(zhǔn)提取物和日本漢方制劑研究開發(fā)過程中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：受體；酶；標(biāo)準(zhǔn)提取物；日本漢方藥；拮抗劑；抑制劑IN VITRO BIOASSAY AND ITS APPLICATIONS IN NEW DRUG DEVELOPMENTShen Jia(Department of Traditional Chinese Medicines,ShenyangPharmaceutical University, Shenyang 110015)ABSTRACT：

2、The applications of in vitro bioassay which util izes in vitro model,isolated cells or purified enzyme to measure the antagonisti c or inhibitive effects on receptor or enzyme,in development of new drug,standard ext ract and Japanese-Chinese traditional herbal medicine were briefly introduced.KEY WO

3、RDS：Receptor; Enzyme; Standardized extract; Japanese-C hinese traditional herbal medicine; Antagonist; Inhibitor無論以傳統(tǒng)方法還是以最新的組合化學(xué)技術(shù)開發(fā)藥用活性成分都需要篩選大量的化合物，這需要高效、快速、準(zhǔn)確的生物學(xué)活性測定方法作為篩選手段，而體外生物測定法正是適用于較大規(guī)模的各種成分的活性篩選方法之一。體外生物活性研究有多種形式如：細(xì)胞培養(yǎng)、模擬體內(nèi)條件以離體細(xì)胞或純化酶測定試驗(yàn)樣品對受體及酶的拮抗或抑制作用等等?，F(xiàn)在著重從以下4個(gè)方面簡介后一種形式及其在新藥開發(fā)中的應(yīng)用。1在

4、傳統(tǒng)植物藥研究開發(fā)中體外生物測定的應(yīng)用 對從北美金縷梅、銳刺山楂及歐洲七葉樹中分得的8個(gè)化合物外加一個(gè)合成化合物進(jìn)行體外活性研究，以大鼠嗜堿細(xì)胞性白血病的細(xì)胞溶質(zhì)組分（5-LO主要來源）及綿羊腸淋巴結(jié)制品（AT主要來源）測定活性。結(jié)果表明，化合物中有4個(gè)5-LO抑制劑及5個(gè)AT抑制劑，其中一個(gè)化合物具有雙重抑制活性。這一研究既找到了上述植物藥抗炎活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，有利于進(jìn)一步開發(fā)其藥用價(jià)值，也為開發(fā)新合成藥做了工作1。在大鼠肝微粒體中加硫酸亞鐵做脂質(zhì)過氧化的起始劑，以測定加入的硫巴比妥酸的反應(yīng)物來評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化百分率，用這一體外試驗(yàn)測得柱狀田頭菇中分離出的2個(gè)化合物可有效地抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并

5、具有消除自由基的活性2。1993年9月在德國Dusseldorf海涅大學(xué)召開的41次世界藥用植物研究年會(huì)上的大會(huì)發(fā)言中，10個(gè)為介紹植物提取物及成分的活性研究，其中7個(gè)的活性研究方式為體外活性測定3。瑞典研究南美洲抗銀屑病植物提取物Calaguala的過程可說明體外活性研究可起重要作用。南美洲蕨類植物Polypodium decumanum Willd的提取物Calaguala在當(dāng)?shù)亻L期用于治療銀屑病、特應(yīng)性皮炎等皮膚疾患，以雙盲法、安慰劑對照臨床試驗(yàn)證明Calaguala對銀屑病確有療效。動(dòng)物皮膚移植試驗(yàn)證明Calaguala可抗同種移植排斥，而免疫調(diào)節(jié)劑血小板活化因子（PAF）可引起同種移

6、植排斥，并且與銀屑病相關(guān)，故以PAF誘導(dǎo)的胞吐作用的體外活性測定為導(dǎo)向（中性粒細(xì)胞為供酶體、特異性PAF受體拮抗劑BN52021為陽性對照），對Calaguala做植化分離，先后在其中分離出有拮抗PAF受體活性的腺苷和1, 2-2 -O-十六酰-3-O-（6-硫-D-喹諾糖酰）-丙三醇，并證明后者還能劑量依賴性地引起3H PAF從其受體移位，是類似于BN52021樣的競爭性PAF受體拮抗劑。體外試驗(yàn)證明Calaguala之中還存在著抑制PAF生物合成的化學(xué)成分，這樣從抑制PAF方面解釋了Calaguala抗銀屑病的作用機(jī)制，還發(fā)現(xiàn)了新的PAF拮抗劑。由于銀屑病患者體內(nèi)的5-LO活性大大高于正常

7、人，故以體外5-LO活性抑制為導(dǎo)向（白細(xì)胞為供酶體、柳氮磺吡啶為陽性對照）同樣做Calaguala的植化分離，分離出幾個(gè)抑制5- LO產(chǎn)生LTB4的不飽和脂肪酸，又從抑制5-LO產(chǎn)生LTB4方面解釋了C alaguala抗銀屑病的作用機(jī)制。同時(shí)以分出的具抑制5-LO活性的不飽和脂肪酸為母核，合成、半合成出一系列不同取代基、不同雙鍵位置及構(gòu)型的不飽和脂肪酸衍生物，仍以體外 5-LO活性抑制試驗(yàn)篩選活性成分，篩選開發(fā)5-LO抑制劑新藥4, 5。由此可見發(fā)達(dá)國家將體外生物測定研究用于傳統(tǒng)植物藥研究開發(fā)可一舉數(shù)得，既闡明傳統(tǒng)藥的分子水平作用機(jī)制，以利于將其開發(fā)成為國際通用藥物，又從中篩選出新的活性化合

8、物，為開發(fā)合成藥服務(wù)。2在合成藥物研究開發(fā)中體外生物測定的應(yīng)用 從植物藥中篩選出活性母核后即進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成系列衍生物進(jìn)行活性篩選，這種以藥用植物成分做化學(xué)合成的模板的例子很多，而最常見的活性篩選方法為體外活性測定法。 黃酮普遍存在于多種植物中，其抗炎抗血栓形成等活性早已在體外和體內(nèi)得到證實(shí)，研究證明黃酮類能夠抑制幾種類型的細(xì)胞的前列腺素合成酶(PGES)，故以體外方法研究黃酮為母核在不同位置上有不同取代基的32種合成化合物（21種黃酮衍生物、6種黃烷酮衍生物、5種兒茶酸衍生物）的抑制PGES活性。其研究結(jié)果確定出可抑制PGES的黃酮結(jié)構(gòu)、篩選出有意義的活性母核，并且這些化合物還能被用于揭示

9、一些酶的活性中心的結(jié)構(gòu)?？梢娫诎l(fā)達(dá)國家開發(fā)傳統(tǒng)藥物和合成藥物及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究緊密相關(guān)的程度及在這全過程中體外測定研究起的重要作用 6, 7。 HIV病毒編碼的蛋白酶抑制劑可以起到抗HIV的作用，體外試驗(yàn)占此類化合物的活性研究的很大部分。如在體外進(jìn)行3個(gè)HIV蛋白酶抑制劑：利托那韋、沙奎那韋和印地那韋對人肝細(xì)胞微粒體中細(xì)胞色素同功酶催化代謝的抑制效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。肝微粒體從腎移植供者的正常肝臟中制取，細(xì)胞色素P450同功酶的探針底物分別是非那西丁、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和睪酮，用HPLC檢測代謝產(chǎn)物。研究結(jié)果證明蛋白酶抑制劑對細(xì)胞色素P450酶的作用是有選擇性的 8。 又如4-（4-環(huán)己基-2-甲基噁 H

10、T唑-5）-2-氟苯基磺酰胺（JIE-522）是一種新型強(qiáng)效的COX-2選擇性抑制劑。體外研究證明：該藥能顯著抑制大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中COX-2依賴的PGE2的生成。而對COX -1依賴的PGE2生成抑制很弱9。 同樣體外研究被應(yīng)用在新近發(fā)展起來的組合化學(xué)技術(shù)中，體外試驗(yàn)可對大量化合物進(jìn)行微量快速的活性追蹤試驗(yàn)及分子水平、細(xì)胞水平的活性機(jī)制研究。3在西歐標(biāo)準(zhǔn)提取物研究開發(fā)中體外生物測定的應(yīng)用 西歐標(biāo)準(zhǔn)提取物為發(fā)達(dá)國家以現(xiàn)代科技開發(fā)傳統(tǒng)植物藥成為國際通用藥物的一個(gè)成功模式。迄今為止標(biāo)準(zhǔn)提取物中的佼佼者為銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取物、貫葉金絲桃標(biāo)準(zhǔn)提取物，在它們的研究開發(fā)中體外測定起著重要作用。 銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取物中

11、占6%的一主要有效成分為銀杏內(nèi)酯類（其中活性最強(qiáng)的代表為銀杏內(nèi)酯B，即BN52021），它們?yōu)樘禺愋訮AF受體拮抗劑。大量報(bào)道BN52021與PAF受體特異性、競爭性的結(jié)合及它與PAF受體結(jié)合后抑制了PAF所引起的眾多的生理作用，很多是以體外方式進(jìn)行的10。銀杏標(biāo)準(zhǔn)提取物中占24%的另一主要有效成分為黃酮糖甙類，這類化合物具有清除自由基、抗過氧化、改善微循環(huán)、抗炎等活性。在體外用離體大鼠肝細(xì)胞以叔丁基過氧化物致毒，即引發(fā)脂質(zhì)過氧化；以產(chǎn)生的丙二醛（MAD）量檢測過氧化的水平，以二苯基苦基偕腙肼試劑脫色反應(yīng)檢測清除自由基活性。試驗(yàn)證明雙黃酮、白果素、銀杏素、異銀杏素可極強(qiáng)地減少 MAD的產(chǎn)生，并

12、具有較強(qiáng)的清除自由基活性。該體外試驗(yàn)還證明：對抗自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用主要由于中心吡喃環(huán)的C2-C3雙鍵和B環(huán)鄰位羥基的存在11。 體外研究發(fā)現(xiàn)金絲桃抑制MAO最強(qiáng)的部位含有的黃酮類化合物的濃度最高。金絲桃中的口占噸酮成分在體外試驗(yàn)中也具有對M AOA強(qiáng)抑制活性。體外試驗(yàn)還證明金絲桃提取物抗抑郁機(jī)制為：金絲桃浸膏可抑制5-羥色胺受體表達(dá)，金絲桃浸膏還可抑制5-羥色胺的吸收。 其他體外試驗(yàn)如：將金絲桃粗提物對39種受體和2種酶系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，其結(jié)果證明金絲桃粗提取對MAO具50%抑制活性，對腺嘌呤核苷、5-羥色胺、苯二氮zhuo、肌醇三磷酸及MAOAB等受體有明顯的親和性12, 13。4在日本漢

13、方制劑現(xiàn)代化中體外生物測定的應(yīng)用 日本的漢方醫(yī)學(xué)起源于中國，在其發(fā)展過程中融合了日本民族的特點(diǎn)，漢方制劑處方絕大部分出自中國古代經(jīng)典醫(yī)著，以日本數(shù)一數(shù)二的漢方制劑公司津村漢方公司1996年產(chǎn)品介紹書列出的產(chǎn)品為例：全部134個(gè)漢方顆粒劑中97%處方出自中國古經(jīng)典醫(yī)著14。 日本的醫(yī)療體制自明治以來完全是西醫(yī)的行政管理模式，醫(yī)療實(shí)踐這一社會(huì)性行為也必須按照西醫(yī)學(xué)的規(guī)范，醫(yī)師只接受西醫(yī)的系統(tǒng)教育，醫(yī)療保險(xiǎn)也是以西醫(yī)的疾病為單位進(jìn)行的。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)只在部分醫(yī)藥科大學(xué)中作為選修課或講座開設(shè)。但在這一社會(huì)條件下，近年來漢方顆粒劑的臨床應(yīng)用量卻在大幅度地逐年上升，其主要原因之一是從70年代以來，日本按現(xiàn)代化的

14、國際標(biāo)準(zhǔn)以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論和最新技術(shù)手段研究漢方制劑的作用機(jī)制。這一研究工作加速了日本漢方藥與現(xiàn)代自然科學(xué)的融合匯通，也加快了其商品化及進(jìn)入國際醫(yī)藥主流市場的進(jìn)程（津村漢方顆粒劑產(chǎn)品的60%出口進(jìn)入國際市場）。 在日本漢方藥現(xiàn)代化的過程中，體外測定研究同樣起著重要作用。以1996年日本津村漢方公司產(chǎn)品說明書為例：134個(gè)漢方顆粒劑中有21個(gè)顆粒劑說明書的藥理藥效項(xiàng)下出現(xiàn)34個(gè)各種體外測定研究的結(jié)果介紹。以在日本銷售量最大的“小柴胡湯”為例，其藥理、藥效項(xiàng)下列出9項(xiàng)研究結(jié)果，其中整體動(dòng)物研究結(jié)果為3項(xiàng)，即做整體動(dòng)物研究又做體外活性測定的研究結(jié)果為5項(xiàng)，單做體外活性測定的研究結(jié)果為1項(xiàng)。可見在“小柴胡

15、湯”的藥理、藥效研究中體外測定所占的比例14。 在日本漢方制劑現(xiàn)代化過程中體外測定一方面用于單味藥的研究，如用體外方法以大鼠腹腔內(nèi)多形核白細(xì)胞（PMN）勻漿研究黃芩中8種黃酮類對AA代謝的影響；以人的PMN研究黃芩黃素抑制LTB4，LTC4產(chǎn)生的作用；以白細(xì)胞研究黃芩黃素對白細(xì)胞生成LTs及脫顆粒反應(yīng)的抑制作用的機(jī)制。另一方面用于復(fù)方藥的研究15，并進(jìn)行拆方研究，以體外試驗(yàn)證明“當(dāng)歸芍藥散”具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞結(jié)合免疫復(fù)合物的能力，而“當(dāng)歸芍藥散”中的某一單味藥則無此活性?？梢娫谝試H公認(rèn)的現(xiàn)代化標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)研究傳統(tǒng)復(fù)方中藥的過程中體外研究的諸多長處可充分地顯示出來，而日本人在漢方制劑現(xiàn)代化的研究開發(fā)

16、中可謂淋漓盡致地利用了體外測定這一研究方式。 大量的現(xiàn)代化國際標(biāo)準(zhǔn)的分子水平、細(xì)胞水平的體外研究有助于日本的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)教育體系培養(yǎng)出的西醫(yī)大夫在臨床上使用漢方藥物，也有利于使西醫(yī)藥為一統(tǒng)天下的歐美接受日本的漢方制劑。漢方西用也導(dǎo)致一系列問題，這類問題及對策已有討論16, 17，但是現(xiàn)代化的機(jī)制研究無疑是推動(dòng)了傳統(tǒng)復(fù)方藥走向更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域，走向世界。5討論 新藥的藥效學(xué)試驗(yàn)最終離不開整體動(dòng)物試驗(yàn)，但發(fā)現(xiàn)新藥的關(guān)鍵步驟-活性成分篩選則不同。傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)是在動(dòng)物模型上進(jìn)行篩選，只能是小規(guī)模篩選，勞動(dòng)密集耗費(fèi)時(shí)間，不能提供分子靶和作用機(jī)制的知識(shí)，還有可能使先導(dǎo)化合物漏掉，不能給第二代藥物的尋找提供指

17、導(dǎo)18，而體外測定篩選可克服上述傳統(tǒng)整體動(dòng)物模型篩選的全部弱點(diǎn)。動(dòng)物模型篩選需較大量的樣品，而實(shí)際工作中植化分離出的樣品、化學(xué)合成出的化合物往往是極微量的，整體動(dòng)物給藥不可能，而做體外測定則幾毫克樣品即可完成。 從前述例子中可見：瑞典研究Calaguala以體外測定導(dǎo)向分出的化合物大多是已知化合物，但體外測定明確了這些已知化合物在復(fù)合成分之中的受體拮抗劑、酶抑制劑等分子水平的作用機(jī)制，賦予了它們新意義，并馬上以這些已知化合物為母核，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，合成出系列類似化合物再以體外測定進(jìn)行新拮抗劑、抑制劑的篩選尋找新藥，可謂有的放矢、注重實(shí)效地達(dá)到新藥開發(fā)的目的。我國的植化工作者每年從傳統(tǒng)植物藥中分離

18、出大量單體，如將分離與體外測定結(jié)合起來，將同樣為開發(fā)新藥起到一舉數(shù)得的作用。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，而傳統(tǒng)中藥卻因其成分復(fù)雜、缺乏明確的有效成分研究等因素未能得到應(yīng)有的發(fā)展，但從日本漢方藥采用體外測定進(jìn)行藥理、藥效學(xué)等研究可見，以體外測定研究結(jié)果解釋復(fù)方漢方藥的分子水平、細(xì)胞水平的作用機(jī)制，也促進(jìn)了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)接受傳統(tǒng)復(fù)方藥。預(yù)計(jì)今后二三十年新藥研制事業(yè)將有很大的進(jìn)展，將出現(xiàn)更多的按作用靶標(biāo)或作用機(jī)制分類的藥物，如鈣離子拮抗劑、各種受體或酶抑制劑等，這將更擴(kuò)大了體外測定在新藥開發(fā)中的應(yīng)用。當(dāng)然常規(guī)的體外測定篩選遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上近年發(fā)展起來的組合化學(xué)中的高通量篩選。對大量化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)具有生物活性

19、的先導(dǎo)化合物是研究開發(fā)新藥的源頭，藥物篩選工作滯后已成為制約我國新藥創(chuàng)制工作的“瓶頸”19。充分利用體外測定將有利于我們的新藥研究開發(fā)及傳統(tǒng)中藥走向世界成為國際通用藥物。作者單位：沈嘉(沈陽藥科大學(xué)中藥系天然藥化研究室，沈陽110015)參考文獻(xiàn)：1Hartisch C, Kolodziej H, Bruchhausen FV. Dual inhibitory activities o f tannins from Hamamelis Virginiana and related polyphenols on 5-Lipoxygenase and Lyso-PAF: Acetyl-CoA Ac

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