細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義(新)

1、細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義 吳錦程 梁 杰 編莆田學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)系生物技術(shù)專業(yè) 2009年2月目 錄1. 前言. 32. 實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡及暗視野顯微鏡的使用. 43. 實(shí)驗(yàn)二 熒光和相差顯微鏡及其使用. .164. 實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞膜的滲透性. .235. 實(shí)驗(yàn)四 細(xì)胞凝集反應(yīng). .276. 實(shí)驗(yàn)五 葉綠體的分離與熒光觀察. 297. 實(shí)驗(yàn)六 線粒體與液泡的超活染色與觀察. 328. 實(shí)驗(yàn)七 酸性磷酸酶的顯示方法 (選做）. .369. 實(shí)驗(yàn)八 植物細(xì)胞原生質(zhì)流動(dòng)及其影響因素 (選做）. 3910. 實(shí)驗(yàn)九 植物細(xì)胞骨架的觀察 (選做）. 41 前 言細(xì)胞生物學(xué)是當(dāng)前生命科學(xué)中核心學(xué)科之一，也

2、是重要的專業(yè)基礎(chǔ)課，其理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)已廣泛地用于研究細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)與克隆、病毒、細(xì)菌、胚胎發(fā)育、遠(yuǎn)緣雜交、人類疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物機(jī)理等領(lǐng)域，隨著分子生物學(xué)的研究滲入，分子細(xì)胞生物學(xué)也得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。目前許多綜合大學(xué)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)及藥科大學(xué)把細(xì)胞生物學(xué)作為本科生和研究生的必修課或基礎(chǔ)理論課，同時(shí)也開設(shè)了專門的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課，學(xué)生們通過實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步地加深了對(duì)理論課的理解，也為今后的專業(yè)實(shí)驗(yàn)課和畢業(yè)論文實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。本講義精心選擇了細(xì)胞生物學(xué)中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)，作為教材面向本系生物技術(shù)專業(yè)本科生進(jìn)行講授。實(shí)驗(yàn)一 普通光學(xué)顯微鏡及暗視野顯微鏡的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 強(qiáng)化普通光鏡結(jié)構(gòu)和使

3、用技能的知識(shí)，掌握讓其發(fā)揮最佳效能的方法。 2. 了解暗場(chǎng)顯微鏡的構(gòu)造和原理，并掌握它們使用方法。二、實(shí)驗(yàn)用品 1. 材料與標(biāo)本：載玻片、蓋玻片、牙簽，香柏油、生物永久裝片、擦鏡紙、 洋蔥。 2. 器材：普通光學(xué)顯微鏡，暗視場(chǎng)顯微鏡。3、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法（1） 普通光學(xué)顯微鏡1. 顯微鏡的用途 顯微鏡是用來觀察、記錄和研究經(jīng)過制片技術(shù)處理后被檢物體細(xì)微結(jié)構(gòu) 的最主要的光學(xué)精密儀器。400多年來，經(jīng)不斷改進(jìn)，顯微鏡的結(jié)構(gòu)和性能 逐步完善，形成了品種繁多、型號(hào)各異的光學(xué)顯微鏡系列它廣泛地應(yīng)用于各 學(xué)科領(lǐng)域中，對(duì)微觀世界的探索及理論的研究起著極其重要的作用（如圖 1-1）。最常用的是普通光學(xué)顯微鏡，

4、此外還有多種專用于不同顯微術(shù)的顯微 鏡，它們是利用不同的光學(xué)原理在顯微鏡基本設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，如 相差顯微鏡、暗視野顯微鏡、熒光顯微鏡和倒置顯微鏡等具有特殊功能或用 途的光鏡。形形色色的光學(xué)顯微鏡雖然外形和結(jié)構(gòu)差異較大，但其基本構(gòu)造 和工作原理是相似的。 圖1-1 光學(xué)顯微鏡型號(hào)實(shí)例 2. 顯微鏡的一些基本知識(shí) 普通光學(xué)顯微鏡的基本工作原理是利用物鏡和目鏡的多組凸透鏡將物 像逐級(jí)放大并反射到視網(wǎng)膜上的過程。而顯微鏡的性能和質(zhì)量的高低可通過 分辨率、數(shù)值孔徑、總放大倍率等指標(biāo)來反映。 (1) 分辨率：衡量光學(xué)系統(tǒng)分辨相隔微小距離的兩個(gè)點(diǎn)能力的指標(biāo)，即“能 夠分辨兩點(diǎn)之間最小距離的能力”，稱

5、之為光學(xué)系統(tǒng)的分辨率。一個(gè)光 學(xué)系統(tǒng)它所能分辨的兩點(diǎn)之間的距離愈小，分辨率也就越高。顯微鏡的 分辨率用公式表示為：d=0.61/NA 式中d為最小分辨距離；為光線 的波長；NA為物鏡的數(shù)值孔徑?？梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值 與照明光源的波長兩個(gè)因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則 d值越小，分辨率就越高。 要提高分辨率，即減小d值，可采取以下 措施: 降低波長值,使用短波長光源。 提高NA值。 消色差。 增加明暗反差。 (2) 數(shù)值孔徑：數(shù)值孔徑簡(jiǎn)寫NA，數(shù)值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術(shù)參 數(shù)，是判斷兩者（尤其對(duì)物鏡而言）性能高低的重要標(biāo)志。其數(shù)值的大 小，分別標(biāo)科在物鏡和聚光鏡的外

6、殼上。這里必須指出，為了充分發(fā)揮 物鏡數(shù)值孔徑的作用，在觀察時(shí)，聚光鏡的NA值應(yīng)等于或略大于物鏡 的NA值，數(shù)值孔徑與其它技術(shù)參數(shù)有著密切的關(guān)系，它幾乎決定和影 響著其它各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深 成反比，NA值增大，視場(chǎng)寬度與工作距離都會(huì)相應(yīng)地變小。 (3) 放大率：放大率就是放大倍數(shù)，是指被檢驗(yàn)物體經(jīng)物鏡放大再經(jīng)目鏡放 大后，人眼所看到的最終圖像的大小對(duì)原物體大小的比值，是物鏡和目 鏡放大倍數(shù)的乘積，即：顯微鏡的總放大倍率=單個(gè)物鏡的放大倍率× 目鏡的放大倍率。放大率也是顯微鏡的重要參數(shù)，但也不能盲目相信放 大率越高越好，在選擇時(shí)應(yīng)首先考慮物鏡的數(shù)值孔

7、徑。 (4) 焦深：焦深為焦點(diǎn)深度的簡(jiǎn)稱，即在使用顯微鏡時(shí)，當(dāng)焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)某一物 體時(shí)，不僅位于該點(diǎn)平面上的各點(diǎn)都可以看清楚，而且在此平面的上下 一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個(gè)清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可 以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦 深與其它技術(shù)參數(shù)有以下關(guān)系： 焦深與總放大倍數(shù)及物鏡的數(shù)值孔 鏡成反比； 焦深大，分辨率降低。由于低倍物鏡的景深較大，所以 在低倍物鏡照相時(shí)造成困難。 (5) 視場(chǎng)直徑（Fieldof view）：觀察顯微鏡時(shí)，所看到的明亮的原形范圍叫 視場(chǎng)，它的大小，是由目鏡里的視場(chǎng)光闌決定的。視場(chǎng)直徑也稱視場(chǎng)寬 度，是指在顯微鏡下看到的

8、圓形視場(chǎng)內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。 視場(chǎng)直徑23最為科學(xué)，大視場(chǎng)容易引起場(chǎng)曲。 F=FN/Mob F: 視場(chǎng)直 徑，F(xiàn)N：視場(chǎng)數(shù)，Mob:物鏡放大率。視場(chǎng)數(shù)（Field Number, 簡(jiǎn)寫為 FN），標(biāo)刻在目鏡的鏡筒外側(cè)。由公式可看出： 視場(chǎng)直徑與視場(chǎng)數(shù) 成正比； 增大物鏡的倍數(shù)，則視場(chǎng)直徑減小。因此，若在低倍鏡下 可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很 小一部份。 (6) 覆蓋差：顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。由于蓋玻片的厚度不 標(biāo)準(zhǔn)，光線從蓋玻片進(jìn)入空氣產(chǎn)生折射后的光路發(fā)生了改變，從而產(chǎn)生 了像差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產(chǎn)生影響了顯微鏡的成像質(zhì)量。國際 上

9、規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17 mm, 許可范圍在0.160.18 mm.,在 物鏡的制造上已將此厚度范圍的像差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)記0.17, 即表明該物鏡要求蓋玻片的厚度。 (7) 工作距離：工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之 間的距離。鏡檢時(shí)，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此， 它與焦距是兩個(gè)概念，平時(shí)習(xí)慣所說的調(diào)焦，實(shí)際上是調(diào)節(jié)工作距離。 在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的 高倍物鏡，其工作距離小。 (8) 機(jī)械系統(tǒng)： 鏡筒：是安裝在光鏡最上方或鏡臂前方的圓筒狀結(jié)構(gòu)或 方形結(jié)構(gòu)，其上端裝有目鏡，下端與物鏡轉(zhuǎn)換器相連（圖12）。

10、 物鏡轉(zhuǎn)換器：又稱旋轉(zhuǎn)盤，是安裝在鏡筒下方的一圓盤狀結(jié)構(gòu)，可 以按順時(shí)針或逆時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)，其上均勻分布有3-4個(gè)圓孔，用以裝 載不同放大倍數(shù)的物鏡。轉(zhuǎn)動(dòng)旋轉(zhuǎn)盤可使不同的物鏡到達(dá)工作位置（即 與光路合軸），此時(shí)能聽到“咔”的一聲。 鏡臂 ：是支持鏡筒和鏡 臺(tái)的彎曲狀結(jié)構(gòu)，是取用顯微鏡時(shí)握持的部位。 調(diào)焦器：也稱調(diào)焦 螺旋，是調(diào)節(jié)焦距的裝置，位于鏡柱的下端，左右對(duì)稱各一套。分粗 調(diào)螺旋（大螺旋）和細(xì)調(diào)螺旋（小螺旋）兩種。粗調(diào)螺旋可使載物臺(tái) 以較快速度或較大幅度升降，能迅速調(diào)節(jié)好焦距，使物像呈現(xiàn)在視野 中，適于低倍鏡觀察時(shí)的調(diào)焦。細(xì)調(diào)螺旋只能使載物臺(tái)緩慢或較小幅 度地升降，升或降的幅度不易被肉眼觀察

11、到，適用于高倍鏡和油鏡焦 距的精細(xì)調(diào)節(jié)；也常用于觀察標(biāo)本的不同層次，一般在粗調(diào)螺旋調(diào)焦 的基礎(chǔ)上使用。有些類型的光鏡，在左側(cè)粗調(diào)螺旋的內(nèi)側(cè)有一窄環(huán)， 稱為粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)輪，其功能是調(diào)節(jié)粗調(diào)螺旋的松緊度。另外，在右 側(cè)粗調(diào)螺旋的內(nèi)側(cè)有一粗調(diào)限位凸柄，當(dāng)用粗調(diào)螺旋調(diào)準(zhǔn)焦距后向上 推緊該柄，可使粗調(diào)螺旋限位，此時(shí)鏡臺(tái)不能繼續(xù)上升，但細(xì)調(diào)螺旋 仍可調(diào)節(jié)。 載物臺(tái)：也稱鏡臺(tái)，是位于物鏡轉(zhuǎn)換器下方的方形平臺(tái)， 用于放置被觀察的玻片標(biāo)本。載物臺(tái)的中央有圓形的通光孔，來自下 方的光線經(jīng)此孔照射到標(biāo)本上。在載物臺(tái)上裝有標(biāo)本移動(dòng)器，也稱推 進(jìn)器或推進(jìn)尺，其上安裝的彈簧夾用于固定玻片標(biāo)本，載物臺(tái)的左下 方的兩個(gè)螺旋可

12、以移動(dòng)推進(jìn)器，可使玻片標(biāo)本在水平面上前后左右移 動(dòng)，用來尋找目標(biāo)。 鏡柱：是連接鏡臂與鏡座的短柱，其上有調(diào)焦 器。 鏡座：位于最底部，是整臺(tái)顯微鏡的基座，用于支持和穩(wěn)定鏡 體。在鏡座內(nèi)裝有照明光源。 (9) 光學(xué)系統(tǒng):光學(xué)系統(tǒng)包括目鏡和物鏡。 目鏡：又稱接目鏡，安裝在鏡 筒的上端，起著將物鏡所放大的物像進(jìn)一步放大的作用。每個(gè)目鏡一般 由兩個(gè)透鏡組成，在上下兩個(gè)透鏡（即接目透鏡和會(huì)聚透鏡）之間安裝 有能決定視野大小的金屬光闌視場(chǎng)光闌，此光闌的位置即是物鏡所 放大實(shí)像的位置。因此，可將一小段細(xì)金屬絲或頭發(fā)粘附在光闌上作為 指針，用以指示視野中的某一部分供他人觀察。另外，還可在光闌的面 上安裝目鏡測(cè)

13、微尺。每臺(tái)顯微鏡通常配置23個(gè)不同放大倍數(shù)的目鏡， 如“5×”、“10×”和“15×”（數(shù)字表示放大倍數(shù)）目鏡，可根據(jù)不同 需要選擇使用，最常使用的是“10×”目鏡。 物鏡：也稱接物鏡， 安裝在物鏡轉(zhuǎn)換器上。每臺(tái)光鏡一般有34個(gè)不同放大倍數(shù)的物鏡， 每個(gè)物鏡由數(shù)片凸透鏡組合而成，是顯微鏡最主要的光學(xué)部件，決定著 光鏡分辨力的高低。常用物鏡的放大倍數(shù)有“10 ×”、“40 ×”和“100 ×”等幾種。一般將“10×”物鏡稱為低倍鏡（而將“5×”及以下的 叫做放大鏡），將“40×”或“45×

14、;”物鏡稱為高倍鏡，將“100×”物 鏡稱為油鏡（這種鏡頭在使用時(shí)其頂端需浸在香柏油中）。在每個(gè)物鏡 的側(cè)壁通常都標(biāo)有能反映其主要性能的參數(shù)（圖1-3），主要有放大倍 數(shù)和數(shù)值孔徑（如10/0.25、40/0.65、100/1.25）、該物鏡所要求的鏡筒 長度和標(biāo)本上的蓋玻片厚度（160/0.17，單位為mm）；另外，在油鏡上 還常標(biāo)有“油”或“oil”字樣。 物鏡頭與玻片標(biāo)本之間的介質(zhì)一般為空氣。由于玻璃與空氣的折光率不 同，光線通過載玻片和空氣進(jìn)入物鏡，部分光線產(chǎn)生折射而損失掉，導(dǎo) 致進(jìn)入物鏡的光線減少，分辨率降低。而油鏡用香柏油或石蠟油作為介 質(zhì)，香柏油或石蠟油折射率與玻璃近似

15、（玻璃、香柏油和石蠟油的折射 率分別為1.52、1.51和1.46，空氣為1），可減少光線的折射，增加視 野亮度，提高分辨率。物鏡分辨率還和數(shù)值孔徑有關(guān)，其數(shù)值越大，分 辨率越高。不同物鏡有不同的工作距離，所謂工作距離是指顯微鏡處于 工作狀態(tài)（焦距調(diào)好、物像清晰）時(shí)，物鏡最下端與玻片上表面之間的 距離（圖1-3）。物鏡的放大倍數(shù)與其工作距離成反比。當(dāng)?shù)捅剁R被調(diào) 節(jié)到工作距離后，可直接轉(zhuǎn)換高倍鏡，只需旋動(dòng)細(xì)調(diào)螺旋，便可見到清 晰的物像，這種情況稱為同高調(diào)焦。不同放大倍數(shù)的物鏡可從長短上加 以區(qū)分，一般來說，低倍鏡最短，油鏡最長，而高倍鏡的長度介于兩者 之間。 (10) 照明系統(tǒng)： 聚光器：位于載

16、物臺(tái)通光孔的下方，由23個(gè)透鏡組 合而成，其主要功能是將光線集中到所要觀察的標(biāo)本上，增加視野的 亮度。在聚光器的左下方，有一調(diào)節(jié)螺旋，可使其上升或下降，從而 調(diào)節(jié)光線的強(qiáng)弱。升高聚光器可使聚光作用增強(qiáng)，反之則聚光作用減 弱。 光圈：也稱彩虹光闌或孔徑光闌，位于聚光器的下端，是能夠 控制進(jìn)入聚光鏡光束大小的可變圓環(huán)結(jié)構(gòu)。它由十幾張金屬薄片組合 排列而成，其外側(cè)有一小柄，可使光圈的孔徑開大或縮小，以調(diào)節(jié)光 線的強(qiáng)弱。有的顯微鏡光圈的下方還裝有濾光片框，可放置不同顏色 的濾光片。 光源：包括電源線及其插頭和燈泡及其開關(guān)。電源線在 鏡柱下面的鏡座側(cè)面。用時(shí)將其插頭插入電源插座中。燈泡在鏡座上 面中央位

17、置，其開關(guān)在鏡座上鏡柱底部的左側(cè)（有的顯微鏡開關(guān)在鏡 柱上）。可通過燈泡開關(guān)旋鈕來調(diào)節(jié)光線亮度以適應(yīng)不同的觀察需要。3. 光學(xué)顯微鏡的使用方法： (1) 準(zhǔn)備工作和基本要求：取用顯微鏡時(shí)，一手握住鏡臂，另一手托住鏡座， 將顯微鏡平穩(wěn)地放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座后緣離桌臺(tái)邊緣約5cm。用顯微 鏡觀察標(biāo)本時(shí)，要求雙眼同時(shí)睜開，雙手并用；逐步養(yǎng)成左手調(diào)焦、右 手移動(dòng)標(biāo)本或繪圖記錄的良好習(xí)慣。 (2) 低倍鏡的使用： 調(diào)光：打開顯微鏡光源，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋，使載物臺(tái) 稍下降，調(diào)節(jié)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)（即低倍鏡頭對(duì)準(zhǔn)通 光孔），當(dāng)鏡頭完全到位時(shí)，可聽到輕微的頓挫聲。側(cè)面觀察的同時(shí)用粗 調(diào)螺旋使鏡臺(tái)上升

18、到離物鏡約1厘米處。打開光圈并使聚光器上升到適 當(dāng)位置（以聚光鏡上端透鏡平面稍低于載物臺(tái)平面的高度為宜），然后雙 眼觀察目鏡，同時(shí)調(diào)節(jié)光源的亮度，使視野內(nèi)的光線均勻、亮度適中。 放片：取需要觀察的玻片標(biāo)本，先對(duì)著光線用肉眼觀察標(biāo)本的全貌和 位置；再將其放置到載物臺(tái)上，用推進(jìn)器上的彈簧夾固定好，注意應(yīng)使 有蓋玻片或有標(biāo)簽的一面朝上；然后，旋動(dòng)推進(jìn)器的螺旋，使需要觀察 的標(biāo)本部位處于通光孔的中央位置。 調(diào)焦：用眼睛從側(cè)面注視低倍鏡， 同時(shí)用粗調(diào)螺旋使載物臺(tái)上升，直至低倍鏡頭距玻片標(biāo)本的距離約 0.5 cm（注意操作時(shí)必須從側(cè)面注視鏡頭與玻片的距離，以避免鏡頭壓 壞玻片）；然后，雙眼觀察目鏡，同時(shí)慢

19、慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)螺旋使載物臺(tái)下降， 直至視野中出現(xiàn)較清晰的物像為止；最后，轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)螺旋，使視野中的 物像更清晰。如果需觀察的物像不在視野中央，甚至不在視野內(nèi)，可用 推進(jìn)器前后、左右移動(dòng)標(biāo)本片，使物像進(jìn)入視野并移至中央。在調(diào)焦時(shí)， 如果鏡頭與玻片的距離已超過了1 cm還未見到物像，應(yīng)嚴(yán)格按上述步驟 重新操作。如果不能確定視野中的物像是目標(biāo)物像，可先移動(dòng)一下標(biāo)本 推進(jìn)尺，如果視野中的物像不隨之移動(dòng)，說明此物像是目鏡或物鏡頭表 面上的異物，而不是要找的物像，應(yīng)繼續(xù)調(diào)焦或移動(dòng)標(biāo)本推進(jìn)器。如果 移動(dòng)標(biāo)本推進(jìn)器物像隨之移動(dòng)，a. 轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)節(jié)器，使鏡臺(tái)細(xì)微上升，使 標(biāo)本上表面上的異物物像消失，進(jìn)而出現(xiàn)真正要觀察的

20、標(biāo)本物像；b. 如 第a種方法仍不能看到真正的標(biāo)本物像，可繼續(xù)用粗調(diào)節(jié)器緩慢下降鏡 臺(tái)，使標(biāo)本下表面上的異物物像消失，直至看到真正的標(biāo)本物像；c. 如果第a和第b種方法都不行，應(yīng)重復(fù)調(diào)焦。 (3) 高倍鏡的使用：由于高倍鏡放大倍數(shù)高于低倍鏡，其觀察視野小于低倍 鏡，所以在使用高倍鏡前，應(yīng)先用低倍鏡尋找到需觀察的物像，并將其 移至視野中央，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)螺旋，使被觀察的物像清晰。 轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡轉(zhuǎn)到工作狀態(tài)（高倍鏡頭對(duì)準(zhǔn)通光孔），此時(shí)， 視野中一般可見到不太清晰的物像，只需調(diào)節(jié)細(xì)調(diào)螺旋便可使物像清晰。 有時(shí)在低倍鏡準(zhǔn)焦?fàn)顟B(tài)下，直接轉(zhuǎn)換高倍鏡時(shí)會(huì)發(fā)生高倍鏡鏡頭碰擦玻 片，而使高倍鏡不能轉(zhuǎn)換

21、到位的情況。此時(shí)不能硬轉(zhuǎn)，應(yīng)檢查玻片是否 放反、玻片是否過厚以及物鏡是否松動(dòng)等情況。 (4) 油鏡的使用：由于油鏡頭放大倍數(shù)高于高倍鏡，與上述同樣原理，油鏡 頭觀察視野小于高倍鏡，所以用高倍鏡找到所需觀察的標(biāo)本物像，并將 需要進(jìn)一步放大的部位移至視野中央。將聚光器上升至較高位置并將光 圈開至最大（油鏡所需光線較強(qiáng)）。轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，移開高倍鏡，在玻 片標(biāo)本上需觀察的部位滴一滴香柏油作為介質(zhì)，然后在眼睛的注視下， 使油鏡轉(zhuǎn)至工作狀態(tài)，此時(shí)油鏡的下端應(yīng)正好浸在油滴中或與油滴接觸。 雙眼注視目鏡的同時(shí)小心而緩慢地轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)螺旋，直至視野中出現(xiàn)清晰 的物像。操作時(shí)不要過度轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)螺旋，以免鏡頭下降壓碎標(biāo)

22、本或損壞 鏡頭。在觀察時(shí)，如需同老師或同學(xué)討論視野中的某一結(jié)構(gòu)，可用推進(jìn) 器將該結(jié)構(gòu)移至指針尖端處；如果鏡中未裝指針，可將視野看成一個(gè)周 緣帶有刻度的鐘面，說明該結(jié)構(gòu)位于鐘面的幾點(diǎn)鐘位置（如3點(diǎn)、6點(diǎn)、 9點(diǎn)、12點(diǎn)等）。油鏡使用結(jié)束后，必須及時(shí)將鏡頭上的油擦拭干凈。擦 試前，應(yīng)將鏡筒升高約1 cm并將油鏡頭轉(zhuǎn)離通光孔；擦試時(shí)，先用擦鏡 紙蘸少許二甲苯擦2次，再用干凈的擦鏡紙擦1次。至于玻片上的油， 如果是有蓋玻片的永久制片，可直接用上述擦油鏡頭的方法擦凈；如果 是無蓋玻片的標(biāo)本，則用拉紙法除去載玻片上的油，即先把一小片擦鏡 紙蓋在油滴上，再往紙上滴幾滴二甲苯，立即將紙往外上方提拉23 次。如

23、未擦凈，應(yīng)重復(fù)上述過程。 （5）顯微鏡使用后的放置方法：微鏡使用結(jié)束后應(yīng)及時(shí)復(fù)原，使其處于非工 作狀態(tài)：先下降載物臺(tái)，取下標(biāo)本片，物鏡轉(zhuǎn)離通光孔；然后，上升載 物臺(tái)，使物鏡與載物臺(tái)相接近；關(guān)閉光源，下降聚光器，關(guān)閉光圈。最 后，將顯微鏡罩上防塵罩，放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)正中央。（二）普通顯微鏡使用中應(yīng)強(qiáng)化的幾個(gè)部分 1. 顯微鏡的能力 顯微鏡的能力濕質(zhì)量和性能的標(biāo)志，它包括分辨力、放大力、焦點(diǎn)深度和視場(chǎng)寬度等，其中最重要的是分辨力。各種能力都有一定的界限，既相互作用，相互制約，如總放大率超過物鏡的數(shù)值孔徑的1000倍時(shí)，微細(xì)結(jié)構(gòu)即分辨不清，為空放大；低于500倍時(shí)由于放大率過低液分辨不清。所以，使用時(shí)應(yīng)統(tǒng)

24、籌考慮。 2. 光路的合軸調(diào)整 （1）聚光器的調(diào)中； （2）物鏡和目鏡的選用于組合； （3）光闌及其使用。（三）暗視場(chǎng)顯微鏡的構(gòu)造、原理和使用方法 1. 原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 暗視野顯微鏡是利用丁達(dá)爾現(xiàn)象原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)一束光線透過黑暗的房間,從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵“通路”,這種現(xiàn)象即丁達(dá)爾效應(yīng)。暗視野顯微鏡在普通的光學(xué)顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后,由于該聚光器內(nèi)部拋物面結(jié)構(gòu)的遮擋,照射在待檢物體表面的光線不能直接進(jìn)入物鏡和目鏡,僅散射光能通過,因而視野是黑暗的。暗視野顯微鏡由于不將透明光射入直接觀察系統(tǒng)，無物體時(shí)，視野暗黑，不可能觀察到任何物體；當(dāng)有物體時(shí)，以物體衍射

25、回的光與散射光等在暗的背景中明亮可見。在暗視野觀察物體，照明光大部分被折回，由于物體(標(biāo)本)所在的位置結(jié)構(gòu)，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的變化。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)主要是使用中央遮光板或暗視野聚光器。使光線改變途徑，傾斜地照射在觀察的標(biāo)本上，標(biāo)本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內(nèi)，因而整個(gè)視野是黑暗的。在暗視野中所觀察到的是被檢物體的衍射光圖像并非物體的本身，所以只能看到物體的存在和運(yùn)動(dòng)，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。但被檢物體為非均質(zhì)時(shí)，并大于12波長，則各級(jí)衍射光線同時(shí)進(jìn)入物鏡，在某種程度上可觀察物體的構(gòu)造。一般暗視野顯微鏡雖看不清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)，但卻可分辨0.004 µm以上的

26、微粒的存在和運(yùn)動(dòng)，這是普通顯微鏡(最大的分辨力為0.2 µm)所不具有的特性，可用以觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)微粒的運(yùn)動(dòng)等,如圖1-4及1-5。 暗視野顯微鏡基本結(jié)構(gòu)是將普通顯微鏡光學(xué)組加上擋光片。普通顯微鏡只要聚光器是可以拆卸的，支架的口徑適于安裝暗視野聚光器，即可改裝成暗視野顯微鏡。在無暗視野聚光器時(shí)，可用厚黑紙片制作一個(gè)中央遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方的濾光片框上，也能得到暗視野效果。擋光片是用來擋住光源中間的光線，讓光線只能從周圍射入標(biāo)本，大小約和光圈大小相同。不同倍率用不同的光圈，所以要制作不同的擋光片。 圖1-4 圖1-5 2. 使用方法:a. 把暗視野聚光器裝在顯微

27、鏡的聚光器支架上。b. 選用強(qiáng)的光源，但又要防止直射光線進(jìn)入物鏡，所以一般用顯微鏡燈照明。 c. 在聚光器和標(biāo)本片之間要加一滴香柏油，目的是不使照明光線于聚光鏡上面進(jìn)行全反射，達(dá)不到被檢物體，而得不到暗視野照明。d. 升降集光器，將集光鏡的焦點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)被檢物體，即以圓錐光束的頂點(diǎn)照射被檢物。 如果聚光器能水平移動(dòng)并附有中心調(diào)節(jié)裝置，則應(yīng)首先進(jìn)行中心調(diào)節(jié)，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴(yán)格位于一直線上。e. 選用與聚光器相應(yīng)的物鏡，調(diào)節(jié)焦距(操作方法與普通顯微鏡相同)，找到所需觀察的物像。 3. 實(shí)用范圍和實(shí)際應(yīng)用 暗視野顯微鏡常用來觀察未染色的透明樣品。這些樣品因?yàn)榫哂泻椭車h(huán)境相似的折射率，不易在

28、一般明視野之下看的清楚，于是利用暗視野提高樣品本身與背景之間的對(duì)比。這種顯微鏡能見到小至4200nm的微粒子，只能看到物體的存在、運(yùn)動(dòng)和表面特征，不能辨清物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)。 臨床上，暗視野顯微鏡常用于檢查蒼白的螺旋體。這是一種病原體檢查，對(duì)早期梅毒的診斷有十分重要的意義。 4. 暗場(chǎng)顯微鏡的要求 要求載玻片和蓋玻片必須無瑕疵和灰塵，物鏡前透鏡必須清潔無塵，蓋玻 片和載玻片的厚度必須絕對(duì)符合要求。 5. 觀察 觀察暗視野顯微鏡下的活細(xì)胞。在黑暗的背景里，可見細(xì)胞、細(xì)胞核和細(xì)胞器的衍射光圖像。4、 實(shí)驗(yàn)建議 1. 使用顯微鏡之前，應(yīng)熟悉顯微鏡的各部分名稱及使用方法。 2. 新鮮標(biāo)本觀察時(shí)，須加蓋玻片

29、，以免標(biāo)本因蒸發(fā)而干燥變形或污染侵蝕物鏡， 同時(shí)可使標(biāo)本表面勻平，光線得以集中，有利于觀察。 3. 進(jìn)行顯微鏡操作的任何時(shí)段都禁止用手觸摸鏡頭, 也不要將鏡頭碰到蓋玻片。5、 實(shí)驗(yàn)報(bào)告及作業(yè) 1. 比較普通光鏡與暗視野顯微鏡下洋蔥表皮及細(xì)胞觀察結(jié)果的差異。 2. 使用暗視野顯微鏡照明時(shí)，為什么必須在聚光器與載玻片之間進(jìn)行油浸？ 3. 實(shí)驗(yàn)體會(huì)。實(shí)驗(yàn)二 熒光和相差顯微鏡及其使用 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解相差顯微鏡、熒光顯微鏡的構(gòu)造和原理，并掌握它們使用方法。二、實(shí)驗(yàn)用品1. 材料與標(biāo)本：載玻片、蓋玻片、擦鏡紙、熒光染料、洋蔥、輪葉黑藻。2. 器材：光學(xué)顯微鏡，相差顯微鏡，熒光顯微鏡。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

30、（一）相差顯微鏡的構(gòu)造、原理及使用方法 1. 原理 相差顯微鏡是荷蘭科學(xué)家Zernike于1935年發(fā)明的，用于觀察未染色標(biāo)本的顯微鏡。活細(xì)胞和未染色的生物標(biāo)本，因細(xì)胞各部細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同，光波通過時(shí)，波長和振幅并不發(fā)生變化，僅相位發(fā)生變化(振幅差)，這種振幅差人眼無法觀察。而相差顯微鏡通過改變這種相位差，并利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹顏碛^察活細(xì)胞和未染色的標(biāo)本。相差顯微鏡和普通顯微鏡的區(qū)別是:用環(huán)狀光闌代替可變光闌， 用帶相板的物鏡代替普通物鏡，并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。 相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位指在某一時(shí)間上，光的波動(dòng)所達(dá)

31、到的位置。一般由于被檢物體（如不染色的細(xì)胞）所能產(chǎn)生的相差太小，肉眼很難分辨， 只有在變相差為振幅差（明暗差）之后才能被區(qū)分。相差決定于光波所通過介質(zhì)的折射率之差及其厚度，等于折射率與厚度的乘積之差（即光程之差）。而相差顯微鏡就是利用被檢物的光程之差進(jìn)行鏡檢的。相差顯微鏡與普通光鏡的不同之處在于它有四個(gè)特殊結(jié)構(gòu)：相差物鏡、具有環(huán)狀光闌的轉(zhuǎn)盤聚光器、合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡和綠色的濾光片。生物學(xué)中使用的多為明反差相差顯微鏡。 原理是利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度）的差別，經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)的顯微鏡。主要用于觀察

32、活細(xì)胞或不染色的組織切片，有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4（波長），如果再增加或減少1/4，則光程差變?yōu)?/2，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。在構(gòu)造上，相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡4個(gè)特殊之處： 環(huán)形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標(biāo)本上。 相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位

33、推遲1/4。分為兩種：a.A+相板：將直射光推遲1/4，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮，形成亮反差（或稱負(fù)反差）。b.B+相板：將衍射光推遲1/4，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。 合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡：用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。 2. 操作：（演示） 將燈室光圈和聚光鏡光圈都開至最大。 首先將聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)至“0”位.物鏡用20x相差物鏡，將待觀察標(biāo)本放置 載物臺(tái)上，正確利用精調(diào)節(jié)輪使之獲得清晰圖像。 取下目鏡,換上中心調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡. 握住望遠(yuǎn)鏡身, 轉(zhuǎn)動(dòng)鏡身上的黑帽以伸 長望遠(yuǎn)鏡,直至獲得一清晰的相板影

34、相(黑環(huán))。 將聚光鏡上的相差選擇轉(zhuǎn)盤調(diào)至“20”位, 使之與使用的20x物鏡相一致. 此時(shí)可見到另一個(gè)亮環(huán)。這是轉(zhuǎn)盤上相環(huán)的影像, 用相環(huán)中心調(diào)節(jié)鈕使亮 環(huán)和黑環(huán)重合。 取下中心調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡, 換上目鏡, 即可得到標(biāo)本(動(dòng)物細(xì)胞,自己做樣品片) 的相差鏡像。 用滴管吸取活細(xì)胞懸液滴在載玻片上,將蓋玻片封好, 避免產(chǎn)生氣泡。 觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。 3. 在進(jìn)行顯微鏡操作的任何時(shí)段都禁止用手觸摸鏡頭, 也不要將鏡頭碰到蓋玻 片。（二）熒光顯微鏡的構(gòu)造、原理和使用方法 1. 原理落射光激發(fā)的熒光法（incident-light fluorescence Epi-FL) 是近代顯微 鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的

35、一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡(jiǎn)便，效率高，50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光，而釋放的熒光也會(huì)有特定的波 長，因而 用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細(xì)菌和螺旋體，受紫外光 激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光

36、法。某些物質(zhì)自身不會(huì)吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。 熒光顯微鏡就其光路來分有兩種： 透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。 落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微

37、鏡，與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器，它與光鈾呈45度角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片雙色束分離器阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。 2. 熒光顯微鏡使用方法 打開燈源，超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮 點(diǎn)。 透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激

38、發(fā)濾片，在 物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所 要求的激發(fā)濾片雙色束分離器阻斷濾片的插塊。 3. 用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其 位于整個(gè)照明光斑的中央。 4. 放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀 察，以免引起眼的損傷；用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無熒光的特殊油鏡；高 壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定， 影響汞燈壽命。 5. 觀察：在示教臺(tái)上的熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，可見經(jīng)0.01的丫啶橙 熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠

39、色和橙紅色)。 6. 熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求： 載玻片 載玻片厚度應(yīng)在0.81.2 mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方 面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發(fā)熒 光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。 蓋玻片 蓋玻片厚度在0.17 mm左右，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光，也可用干涉蓋玻片， 這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如 氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發(fā)光，這種反射的激發(fā) 光女可激發(fā)標(biāo)本。 標(biāo)本 組織切片或其他標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物 鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外，細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋，影響

40、判斷。 封裱劑 封裱劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.59.5時(shí) 較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/L pH9.09.5的碳酸鹽緩沖 液的等量混合液作封裱劑。 鏡油 一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須使用鏡油，最好使用特制 的無熒光鏡油，也可用上述甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低， 對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。 7. 使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)： 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。 應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈515 min， 待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。 防止紫外

41、線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。 檢查時(shí)間每次以12 h為宜，超過90 min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降， 熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射35 min后，熒光也明顯減弱；所以，最多不 得超過23 h。 熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱 時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再 用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。 標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑 料袋中4 保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。 8. 熒光圖像的記錄方法 熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)

42、特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計(jì)，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30 s，熒光亮度降低50 %。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一

43、般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。標(biāo)本的制作方法樣品須經(jīng)過石蠟包埋切片，然后用鐵礬蘇木精染色，普通光鏡觀察效果還可以4、 實(shí)驗(yàn)建議1. 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡廠家說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。2. 觀察對(duì)象必須是可自發(fā)熒光或已被熒光染料染色的標(biāo)本。3. 應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈515 min， 待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。4. 載玻片、蓋玻片及鏡油應(yīng)不含自發(fā)熒光雜質(zhì)，載玻片的厚度應(yīng)在0.81.2 mm 之間，太厚可吸收較多的光，并且不能使激發(fā)光在標(biāo)本平面上聚焦。載玻片 必須光潔，厚度均勻，無油漬或劃痕。蓋玻片厚

44、度應(yīng)在0.17 mm左右。5. 防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。6. 選用效果最好的濾光片組。7. 檢查時(shí)間每次以12 h為宜，超過90 min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降， 熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射35 min后，熒光也明顯減弱；所以，最多 不得超過23 h。8. 熒光標(biāo)本一般不能長久保存，若持續(xù)長時(shí)間照射（尤其是紫外線）易很快褪 色。因此，如有條件則應(yīng)先照相存檔，再仔細(xì)觀察標(biāo)本。9. 熒光顯微鏡光源壽命有限，啟動(dòng)高壓汞燈后，不得在15 min內(nèi)將其關(guān)閉， 一經(jīng)關(guān)閉，必須待汞燈冷卻后方可再開啟。嚴(yán)禁頻繁開閉，否則，會(huì)大大降 低汞燈的壽命。標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)

45、光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電 扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待 燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。 10. 標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯 塑料袋中4 保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。  11. 若暫不觀察標(biāo)本時(shí)，可拉過阻光光簾阻擋光線。這樣，既可避免對(duì)標(biāo)本不 必要的長時(shí)間照射，又減少了開閉汞燈的頻率和次數(shù)。 12. 熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“一”無或可見微弱熒光。 “+”僅能見明確可見的熒光?！?”可見有明亮的熒光?！?”可 見耀眼的熒光。 13. 較長時(shí)間觀察熒光標(biāo)本時(shí)，一定要戴能阻

46、擋紫外光的護(hù)目鏡，加強(qiáng)對(duì)眼睛 的保護(hù)。在未加入阻斷濾光片前不要用眼直接觀察，否則會(huì)損傷眼睛。 14. 激發(fā)光長時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象，因此盡可能縮短觀 察時(shí)間，暫時(shí)不觀察時(shí)，應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。 15. 熒光幾乎都較弱，應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。5、 實(shí)驗(yàn)報(bào)告及作業(yè)1. 比較相差顯微鏡、熒光顯微鏡觀察結(jié)果的差異。2. 為什么相差顯微鏡可以直接觀察活體樣品。3. 實(shí)驗(yàn)體會(huì)。實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)通透性的一般規(guī)律。2. 了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜，可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。各種物質(zhì)

47、出入細(xì)胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶劑，水分子可以按照物質(zhì)濃度梯度從滲透壓低的一側(cè)通過細(xì)胞膜向滲透壓高的一側(cè)擴(kuò)散，這種現(xiàn)象就是滲透。滲透作用是細(xì)胞膜的主要功能之一。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中，水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi)，可使細(xì)胞脹破，血紅蛋白釋放到介質(zhì)中，由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液，這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中，由于紅細(xì)胞膜對(duì)各種溶質(zhì)的通透性不同，膜兩側(cè)的滲透壓平衡會(huì)發(fā)生改變，也會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此，發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時(shí)間長短可作為測(cè)量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選用紅細(xì)胞作為細(xì)胞膜透性的實(shí)驗(yàn)材料，將其放入不同的介質(zhì)溶液中，觀察紅細(xì)胞的變化。三、實(shí)驗(yàn)用品(一) 材料 雞血細(xì)胞(二) 器材 普通顯微鏡、普通離心機(jī)、電子天平、10 mL 試管、10 mL刻度離心管、試管架，2 mL注射器（無需針頭）或5mL移液管、洗耳球、滴管、載玻片、擦鏡紙、記號(hào)筆等。(三) 試劑1. Alsever 溶液葡萄糖 2.05g檸檬酸鈉(Na9C6H5O7.2H2O) 0.89g檸檬酸（C6H6O7.H2O） 0.05g氯化鈉 0.42g蒸餾水 100 mL調(diào)pH至7.2，過濾滅菌或高壓滅菌10 min，置4冰箱保存。2. 0.128 mol/L NaCl溶液。3. 0.05 mol/L NaCl溶液。4. 0.4