自己翻譯的羅氏tunel檢測細(xì)胞凋亡試劑盒說明書

1、羅氏tunel檢測細(xì)胞凋亡試劑盒說明書注意：Label溶液含有甲次碑酸鹽和二氯化鉆，嚴(yán)禁吸入和食入。反應(yīng)懸浮物收集于密閉、不易碎、有明確標(biāo)識的容器中，按有毒廢物處理。試劑盒組成:小瓶/蓋子標(biāo)簽內(nèi)容物1藍(lán)色酶溶液大腸桿菌重組牛胸腺末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶，在 storage buffer 中10 x conc.5X 50ul2紫色標(biāo)記溶液在reaction buffer中的核昔酸混合物 1 x conc.5X 550ul3黃色轉(zhuǎn)化-POD抗熒光素抗體，綿羊 Fab片段，連接有辣根過氧化物酶Ready-to-use3.5ml需要自己配置的其他物品：除上表所列試劑外，還需準(zhǔn)備以下溶液。下表列出每步所需物

2、品概覽:步驟設(shè)備試劑樣品準(zhǔn)備section 3.2黏附細(xì)胞，細(xì)胞涂片和細(xì)胞離心涂片準(zhǔn)備section3.2.1冰凍組織 section3.2.2.2Washing buffer:磷酸緩沖液 PBS*Bloking buffer封閉緩沖液：溶于甲醇的 3%H2O2Fixation solution固定劑：溶于 PBS的4%多聚甲醛， ph7.4,新鮮配制Permeabilisation solution滲透溶液：溶于 0.1%檸檬酸鈉 的 0.1%Triton X-100，新鮮配制(6) 固定劑石蠟包埋組織section3.2.2.1二甲苯和乙醇(濃度：95%, 90%, 80%, 70%,溶于

3、雙蒸水中)Washing buffer: PBS*蛋白酶K* ,不含核酸酶，工作濃度：10-20ug/ml ,溶于10mM Tris/HCL 中，ph7.4-8替代處理方案滲透溶液：(0.1%Triton 1) X-100 ,溶于 0.1%檸檬酸鈉的，新鮮配制胃蛋白酶* (0.25%-0.5%，溶于鹽酸中，ph2)或胰蛋白酶*, 0.01N HCL，不含核酸酶米0.1M檸檬酸緩沖液，ph6,微波照射標(biāo)記步驟section3.3陽性對照section3.3.1微球菌核酸酶或DNase I,重組，級別 1*黏附細(xì)胞，細(xì)胞涂片和細(xì)胞離心涂片和組織section3.3.2Parafilm石蠟封口膜或蓋

4、片濕盒Washing buffer: PBS*Difficult tissue 困難組織塑料容器微波濕盒Citrate buffer 檸檬酸鹽緩沖液，0.1M , ph6.0Washing buffer: PBS*Tris-HCL , 0.1M ph7.5，含 3% 的 BSA* 和 20%正常牛血清信號轉(zhuǎn)換 section3.4濕盒Parafilm石蠟封口膜或蓋片Washing buffer: PBS*DAB Metal Enhanced Substrate Set*DAB 金屬增強底物 *或POD底物替代物光鏡鏡檢封固劑產(chǎn)品概述：特異性：TUNEL反應(yīng)優(yōu)先標(biāo)記凋亡產(chǎn)生的 制細(xì)胞生長的藥物或

5、放射線產(chǎn)生的實驗干擾：假陰性：在某些型式的凋亡細(xì)胞中DNA鏈斷裂，從而辨別凋亡與壞死、以及由抑 primary DNA 鏈斷裂DNA鏈斷裂可能缺失或不完全?？臻g位阻，如細(xì)胞外元件可能阻止 TdT到達(dá)DNA斷裂處。兩種情況均能產(chǎn)生假陰性。 假陽性：在壞死晚期,可能產(chǎn)生大量的DNA片段DNA鏈斷裂也可能在具有高增殖和代謝活動的細(xì)胞中出現(xiàn)。兩種情況均能產(chǎn)生 假陽性。為確認(rèn)細(xì)胞死亡的凋亡型式，應(yīng)認(rèn)真進(jìn)行每種細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢查 凋亡過程中產(chǎn)生的形態(tài)學(xué)改變尤其特征形式，因此，對于可以結(jié)果進(jìn)行解釋時， 細(xì)胞形態(tài)評估是一項重要的參數(shù)樣本：細(xì)胞離心涂片和細(xì)胞涂片在chamber slides上培養(yǎng)的黏附細(xì)胞冰凍或

6、福爾馬林固定、石蠟包埋樣本分析時間：2-3小時，除外培養(yǎng)、固定和滲透檢測次數(shù)：一個試劑盒 50T試劑盒存儲/穩(wěn)定性：未開封試劑盒儲存于 -15-25 C可穩(wěn)定至標(biāo)簽上標(biāo)明的效期。試劑儲存和穩(wěn)定性TUNEL反應(yīng)混合物TUNEL反應(yīng)混合物應(yīng)在用前臨時配制，不能儲存TUNEL反應(yīng)混合物用前應(yīng)置于冰上轉(zhuǎn)化-POD一旦融化轉(zhuǎn)化-POD溶液后，應(yīng)儲存于 2-8 C (最長穩(wěn)定6個 月)注意：禁止冰凍結(jié)冰優(yōu)點:優(yōu)點特點靈敏在單個細(xì)胞水平檢測細(xì)胞凋亡的早期間斷特異對壞死來說，優(yōu)先標(biāo)記凋亡快速分析時間短(2-3h)簡便試劑穩(wěn)定、優(yōu)化，沒有稀釋步驟靈活適合于固定細(xì)胞核組織，允許堆積、貯存和轉(zhuǎn)運樣本雙染可以鑒定細(xì)胞

7、凋亡的類型和階段Function-tested 功能檢查對于大量的批號來說，每一批號均進(jìn)行了功能檢測步驟和所需材料:1流程圖：Cryo | j reservedtissue sectionsParaffin-embeddedtissue sectionsAdherent cellscell smears andcytospinpreparstUons2樣品準(zhǔn)備2.1黏附細(xì)胞、細(xì)胞涂片和細(xì)胞離心涂片需準(zhǔn)備的其他試劑： Washing buffer:磷酸鹽緩沖液（PBS）Blocking buffer封閉溶液：甲醇稀釋的3% H2O2Fixation solution固定溶液：PBS配制的4%多聚

8、甲醛，ph 7.4,新鮮配制 Permeabilisation solution 滲透液：0.1%Triton1 X-100 溶于 0.1%檸檬酸鈉 溶液中，新鮮配制步驟：下表描述了細(xì)胞固定、內(nèi)源性過氧化物酶封閉和細(xì)胞滲透過程。注意：固定和滲透另外兩個細(xì)胞樣本用于銀杏和陽性對照步驟操作1用新鮮配制的固定液固定風(fēng)干的細(xì)胞樣本，1h, 15-25 C2用PBS沖洗玻片3用封閉液孵育，10min , 15-25 C4用PBS沖洗玻片5用滲透液孵育，2min,置于冰上2-8C6按3.3操作2.2組織部分2.2.1福爾馬林-包埋組織福爾馬林包埋組織的預(yù)處理：可按 4種不同的方式預(yù)處理。如用蛋白酶K,不含

9、核酸酶，濃度、孵育時間和溫度應(yīng)按組織類型優(yōu)化 注意：只用羅氏應(yīng)用科學(xué)的蛋白酶K ,因其經(jīng)檢測不含核酸酶，核酸酶可導(dǎo)致假陽性。另外3中替代方法在下表中描述（step 2）需準(zhǔn)備的其他試劑：二甲苯和乙醇（濃度：95%, 90%, 80%, 70%,溶于雙蒸水中）Washing buffer: PBS 蛋白酶K,不含核酸酶，工作濃度：10-20ug/ml ,溶于10mM Tris/HCL 中，ph7.4-8 替代處理方案滲透溶液：0.1%Triton" X-100,溶于0.1%檸檬酸鈉的，新鮮配制胃蛋白酶*（0.25%-0.5%，溶于鹽酸中，ph2）或胰蛋白酶*, 0.01N HCL ,

10、不含核酸酶米0.1M檸檬酸緩沖液，ph6,微波照射步驟：下表描述了用蛋白酶K （不含核酸酶）和 3中替代方法預(yù)處理福爾馬林 -包埋組織的方法注意：加入額外的組織用于陰性和陽性對照步驟操作1按照標(biāo)準(zhǔn)操作脫蠟和再水化組織（e.g. 60C加熱，二甲苯浸洗，一系列梯度酒精和雙蒸水再水化2用蛋白酶K工作液于21-37C中孵育15-30min替代方法操作1.滲透液孵育8 min2.胃蛋白酶或胰蛋白酶37 C孵育 15-60min3.微波射線將玻片置于含有 200ml 0.1 M檸檬酸鹽緩沖液，ph6.0 的塑料容器中350 W微波放射 5 min3用PBS沖洗兩次4按3.3操作2.2.2冰凍組織處理（略

11、）3標(biāo)記草案3.1開始之前準(zhǔn)備TUNEL反應(yīng)混合液：每一對管子（小瓶1 :酶溶液，小瓶2:標(biāo)記溶液）足以用于50ul 反應(yīng)體系的10張片子，和2個50ul標(biāo)記溶液的陰性對照。注意：TUNEL反應(yīng)混合液應(yīng)于用前臨時配制，不能儲存。TUNEL反應(yīng)混合液用前置于冰上步驟操作1取100ul標(biāo)記溶液（小瓶 2）用于陰性對照2加入總量50ul的酶溶液（小瓶1）于450ul的標(biāo)記溶液中，以獲得 500 ul TUNEL 反應(yīng)混合液3充分混勻需準(zhǔn)備的其他試劑：微球菌核酸酶或DNase I,重組，級別 1*對照：每次實驗應(yīng)包含兩個陰性對照和一個陽性對照應(yīng)陰性對照孵育固定和滲透的細(xì)胞于50ul/標(biāo)記溶液中（無末端

12、轉(zhuǎn)移酶），替代用TUNEL反應(yīng)混合液孵育陽性對照孵育固定和滲透的細(xì)胞于 微球菌核酸酶或DNase I ,重組，級別 1中（3000U/ml-3U/ml 于 50mM Tris-HCL 中，ph7.5, 10mM MgCL2 , 1mg/ml BSA ）10min , 15-25 C，以誘導(dǎo)在標(biāo)記前 DNA鏈斷裂3.2黏附細(xì)胞、細(xì)胞涂片、細(xì)胞離心涂片和組織標(biāo)記草案需準(zhǔn)備的其他設(shè)備和試劑：Washing buffer: PBS濕盒Parafilm石蠟封口膜或蓋片步驟：參考下表步驟操作1用PBS沖洗兩次2使樣品周圍區(qū)域變干3加入50ul TUNEL反應(yīng)混合液于樣品上注意：陰性對照加入50ul標(biāo)記溶液

13、。確保TUNEL反應(yīng)混合液均勻分布于單層細(xì)胞上，避免蒸發(fā)丟失。孵育時樣品上應(yīng)覆蓋Parafilm石蠟封口膜或蓋片4在濕盒、暗宰 中加蓋孵育 60min , 37 C5用PBS沖洗3次6可在樣品上加入1滴PBS,K光顯微"觀察。激發(fā)光波長450-500 nm，在515-565 nm （綠色）范圍類檢測3.3困難組織標(biāo)記草案（略）3.4信號轉(zhuǎn)換需要準(zhǔn)備的其他設(shè)備和試劑：Washing buffer: PBS濕盒Parafilm石蠟封口膜或蓋片 DABA底物或POD替代底物 光鏡鏡檢封固劑步驟：按照下表操作步驟操作1使樣品周圍區(qū)域變干2加入50 ul轉(zhuǎn)化-POD （小瓶3）于樣品上注意：確

14、保轉(zhuǎn)化-POD溶液均勻分布于單層細(xì)胞上，避免蒸發(fā)丟失。孵育時樣 品上應(yīng)覆蓋Parafilm石蠟封口膜或蓋片3在濕盒中孵育30min , 37 C4用PBS沖洗3次5加入50-100ul DAB底物或POD替代底物6于 15-25 C 孵育 10min7用PBS沖洗3次8用玻璃蓋片封固（e.g.用PBS/甘油），光"檢查 替代方法：光鏡檢查前可復(fù)染4.附件：4.1 Troubleshooting問題步驟/試劑可能原因建議非特異性標(biāo)記包埋組織紫外輻射用于包埋組織的聚合（e.g異丁烯酸鹽導(dǎo)致 DNA鏈斷裂）使用不問的包埋材料或不用的聚合 試劑固定酸性固定劑（e.g.甲安菲他明，Carnoy

15、 ' s固定劑）使用4%多聚甲醛使用福爾馬林或戊二醛TUNEL反應(yīng)TdT濃度太高用TUNEL稀釋緩沖液1:2至1:10稀釋TdT濃度轉(zhuǎn)化步驟內(nèi)源性POD活性細(xì)胞滲透前，浸入3% H2O2甲醇稀釋液10min,封閉內(nèi)源性 POD抗-銀光素-POD非特異性連接用正常抗綿羊血清封閉用含3% BSA的PBS封閉20min減少轉(zhuǎn)化溶液濃度 50%核酸酶某些組織（e.g.平滑肌，組織 準(zhǔn)備后很快出現(xiàn) DNA斷裂）取得器官后立即固定組織 通過肝靜脈灌注固定劑某些酶仍有活性用含有ddUTP和dATP的溶液封閉背景 高固定福爾馬林固定導(dǎo)致含有黑色 素前體的細(xì)胞黃染使用甲醇固定，但同時應(yīng)考慮甲醇 固定可能降低靈敏度TUNEL反應(yīng)對于孚L腺癌，標(biāo)記混合物濃度 太高用TUNEL稀釋緩沖液使