醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、 普通生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)供醫(yī)學(xué)八年制使用華中科技大學(xué)生命與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心目錄實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用方法2實(shí)驗(yàn)二 動物細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察5實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞器的光鏡切片觀察7實(shí)驗(yàn)四 動物細(xì)胞培養(yǎng)9實(shí)驗(yàn)五 ABO血型鑒定與交叉配血16實(shí)驗(yàn)六 血涂片的制作與讀片19實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本的制備與形態(tài)觀察23實(shí)驗(yàn)八 蝗蟲精巢減數(shù)分裂壓片標(biāo)本的制備與觀察27實(shí)驗(yàn)九 人外周血染色體制備30實(shí)驗(yàn)十 正常人非顯帶染色體的核型分析32實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)普通臺式顯微鏡的結(jié)構(gòu)、各部分的功能和使用方法。2. 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。3. 了解幾種特殊光學(xué)顯微鏡的工作原理及其

2、使用光學(xué)顯微鏡的使用( 一 ) 顯微鏡的結(jié)構(gòu)及使用方法 光學(xué)顯微鏡，簡稱光鏡 (microscope) ，是生物醫(yī)學(xué)研究及臨床工作中常用的儀器，每個(gè)學(xué)生都必須熟悉它的結(jié)構(gòu)和性能，掌握其使用方法。 1 光學(xué)顯微鏡的主要構(gòu)造 顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機(jī)械部分、照明部分和光學(xué)部分 ( 圖 1-1) 。 (1) 機(jī)械部分 鏡座：亦稱鏡腳，是顯微鏡的基座，用以支持整個(gè)顯微鏡。 鏡柱：是鏡座向上直立的短柱，用以支持其他部分。 鏡臂：是鏡柱向上彎曲的部分，適于手握。有些顯微鏡鏡柱與鏡臂之間有傾斜關(guān)節(jié)。 鏡筒：連在鏡臂前方的鏡筒部分，一般長度為16 cm 。有直筒和斜筒兩種，前者鏡筒上下可調(diào)節(jié)，后者鏡筒是

3、固定的調(diào)節(jié)器：是裝在鏡臂上的大小兩種螺旋，轉(zhuǎn)動時(shí)可使鏡臺升降或使鏡筒上下移動以調(diào)節(jié)焦距。       粗調(diào)節(jié)器 ( 粗螺旋 ) 轉(zhuǎn)動時(shí)可使鏡臺或鏡筒在垂直方向以較快速度和較大距離進(jìn)行上下升降，調(diào)節(jié)物鏡與標(biāo)本的距離。通常在低倍鏡下，先用粗調(diào)節(jié)器找到物像。      細(xì)調(diào)節(jié)器 ( 細(xì)螺旋 ) 形狀較小，通常在粗調(diào)節(jié)器的下方或外側(cè)，轉(zhuǎn)動時(shí)可使鏡臺或鏡筒緩慢地上下移動，以精細(xì)調(diào)節(jié)焦距，得到清晰的物像。 旋轉(zhuǎn)器 ( 鏡頭轉(zhuǎn)換器 ) ：裝在鏡筒的下端，呈盤狀，下面有3 4個(gè)物鏡孔供裝置不同放載物臺 ( 鏡臺 ) ：用以放玻片樣

4、本，中間有一通光圓孔，稱為鏡臺孔，由此孔可透入集光器傳入的光線。 標(biāo)本移動器：裝于載物臺上，用于前后左右移動玻片標(biāo)本。移動器上有標(biāo)尺，可以測定標(biāo)本大小。 (2) 照明部分 反光鏡 (mirror) ：是一個(gè)一面平一面凹的雙面鏡，裝在鏡柱基部的前方，可向任意方向轉(zhuǎn)動，其作用是改變光源射出的光線方向，送至聚光鏡中心，再經(jīng)鏡臺孔照明標(biāo)本。反光鏡的凹面聚光作用較強(qiáng)，通常在光線較弱時(shí)使用；在光線強(qiáng)而均勻時(shí)，宜用平面鏡。 有些顯微鏡采用電光源代替反光鏡，使用時(shí)接上電源，在打開電源前，光照亮度旋至最小位置，然后打開電源，旋轉(zhuǎn)亮度旋扭調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度至適宜為止。關(guān)閉電源前，應(yīng)先將光照亮度旋至最小位置。 聚光器 (

5、 又名集光器， condenser) ：位于載物臺下方的聚光器架上，由聚光鏡和虹彩光闌組成。      聚光鏡 由一片或數(shù)片透鏡組成，其作用相當(dāng)于一凸透鏡，起會聚光線的作用，一般可通過裝在鏡柱旁的聚光器調(diào)節(jié)螺旋的轉(zhuǎn)動而上下移動，上升時(shí)視野中光亮度增加，下降時(shí)光亮度變?nèi)?、虹彩光闌 ( 又名光圈， diaphragm) 在聚光鏡下方，由十幾張活動的金屬薄片組成。其外側(cè)伸出一柄，推動此柄可隨意調(diào)節(jié)開孔的大小，以調(diào)節(jié)光量。 (3) 光學(xué)部分 目鏡 (ocular) ：位于鏡筒上方，常用的有5×，6×，8×，10×，12&#

6、215;，15×，數(shù)字越大，放大倍率越高，可根據(jù)需要挑選使用。一般裝在鏡筒上的是10 ×目鏡。 物鏡 (objective) ：裝在鏡筒下端的旋轉(zhuǎn)器上，一般有3 4個(gè)物鏡。其中最短的刻有“4 ×”或“10×”符號的為低倍鏡，較長的刻有“40×”符號的為高倍鏡；最長的刻有“100×”符號的為油鏡。 在物鏡上，還有鏡口率 (NA) 的標(biāo)志。鏡口率反映該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨力越高。物鏡的工作距離是指顯微鏡處于工作狀態(tài) ( 物像調(diào)節(jié)清楚 ) 時(shí)，物鏡的下表面與蓋玻片 ( 蓋玻片的厚度一般為 0.17mm ) 上表面

7、之問的距離。物鏡的放大倍數(shù)愈大，它的工作距離愈小。顯微鏡的放大倍數(shù)是物鏡的放大倍數(shù)與目鏡的放大倍數(shù)的乘積，如：物鏡為10×，目鏡為10×，其放大倍數(shù)就為l00 。 2 光學(xué)顯微鏡的使用方法 (1) 低倍鏡的使用方法 檢查：用右手握鏡臂，從鏡箱中將顯微鏡取出，左手托鏡座，平穩(wěn)地放到實(shí)驗(yàn)桌上。使用前應(yīng)先檢查一下顯微鏡各部分結(jié)構(gòu)是否完整，如發(fā)現(xiàn)有缺損或性能不良，要立即報(bào)告教師，請求處理。 準(zhǔn)備：將顯微鏡放于自己座位面前實(shí)驗(yàn)桌上稍偏左側(cè)，鏡臺向前鏡筒向后，旋轉(zhuǎn)粗調(diào)節(jié)器使鏡臺遠(yuǎn)離物鏡，旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡對準(zhǔn)鏡臺孔，這時(shí)可聽到轉(zhuǎn)換器邊上固定扣碰上而發(fā)出的聲音，或手上感到一種阻力，

8、說明物鏡的光軸已正對鏡筒的中心。 對光：打開光圈，將聚光器上升。雙眼同時(shí)張開，以左眼向目鏡內(nèi)觀察 ( 如為雙筒顯微鏡，用雙眼觀察，下同 ) ，調(diào)節(jié)反光鏡的方向，使光線射入鏡筒中，直到求得明亮而均勻的視野為止；或打開電源，調(diào)節(jié)光照亮度旋鈕，直到光亮度最適宜為止。 置片和調(diào)整焦距：將玻片標(biāo)本置于鏡臺上，注意使有蓋玻片的一面朝上，利用標(biāo)本移動器將玻片夾住，然后將玻片稍加調(diào)節(jié)，使標(biāo)本對準(zhǔn)鏡臺孔。從側(cè)面注視低倍鏡，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡臺慢慢上升，至物鏡距標(biāo)本半厘米處為止，再以左眼自目鏡中觀察，左手轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使鏡臺徐徐下降，直到視野中出現(xiàn)標(biāo)本的物像為止；再轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器，使鏡臺微微上下，調(diào)節(jié)距離，使物像清晰

9、。 (2) 高倍鏡的使用方法 依上法先用低倍鏡找到物像后，將欲觀察的標(biāo)本部分移到視野中央。 眼睛從側(cè)面注視物鏡，用手轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使高倍物鏡對準(zhǔn)標(biāo)本 ( 如果操作正確，此時(shí)物鏡與標(biāo)本之間距離正好，不會碰到 ) 。 眼睛向目鏡內(nèi)看，同時(shí)只需輕輕轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器使鏡臺微微升降，即得到清晰的物像。 (3) 油鏡的使用方法 同高倍鏡的使用方法 在玻片標(biāo)本上需要觀察的部分加上少許香柏油，然后轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使油鏡對準(zhǔn)標(biāo)本。調(diào)節(jié)油鏡至油鏡的前端浸在香柏油內(nèi)，從目鏡觀察，同時(shí)轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器，至視野出現(xiàn)清楚物像為止。油鏡的放大倍數(shù)大，觀察時(shí)要用較強(qiáng)的光線。 觀察以后，用粗調(diào)節(jié)器使鏡臺下降 ( 鏡筒上升 ) ，用擦

10、鏡紙將鏡頭、玻片標(biāo)本上的香柏油擦去，可用少許二甲苯，但不能用力擦，以免損壞鏡頭和標(biāo)本。水分較多的臨時(shí)制片，使用油鏡觀察時(shí)，應(yīng)事先吸盡水分。 3 使用光學(xué)顯微鏡的注意事項(xiàng) (1) 取顯微鏡時(shí)必須右手握鏡臂，左手托鏡座，平貼胸前。切勿一手斜提，前后搖擺，以防碰撞和零件跌落。 (2) 擦拭顯微鏡的光學(xué)玻璃部分，必須用擦鏡紙，切忌用其他硬質(zhì)紙張或布等擦拭，以免造成鏡面劃痕。 (3) 切忌用水、酒精或其他藥品浸潤鏡臺或鏡頭。一旦沾染應(yīng)立即進(jìn)行處理，以免污染或腐蝕鏡頭。 (4) 放置玻片標(biāo)本時(shí)，應(yīng)將有蓋玻片的一面向上，否則會壓壞標(biāo)本和物鏡。 (5) 觀察時(shí)應(yīng)兩眼同時(shí)張開，用左眼觀察，用右眼注視繪圖。左手調(diào)

11、節(jié)粗、細(xì)調(diào)節(jié)器，右手調(diào)節(jié)標(biāo)本移動器和繪圖。實(shí)驗(yàn)完畢后，將顯微鏡擦拭干凈。物鏡不要與鏡臺相對，關(guān)閉光圈，適當(dāng)下降聚光器，將反光鏡直立，送回原處。 實(shí)驗(yàn)二 動物細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察幾種細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)二、實(shí)驗(yàn)用品顯微鏡三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容細(xì)胞的基本形態(tài)觀察（一）原理細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)事很多細(xì)胞的共同點(diǎn)，在分化程度較高的細(xì)胞更為明顯，這種合理性是生物漫長進(jìn)化過程所形成點(diǎn)。例如：具有收縮機(jī)能的肌細(xì)胞伸展為細(xì)長型；具有感受刺激和傳導(dǎo)沖動機(jī)能的神經(jīng)細(xì)胞有長短不一點(diǎn)樹枝狀突起；游離點(diǎn)血細(xì)胞為圓形/橢圓形或圓餅形。不論細(xì)胞的形態(tài)如何,細(xì)胞的結(jié)構(gòu)一般分為三大部分:細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。但也有例外，如

12、哺乳類紅細(xì)胞成熟時(shí)細(xì)胞核消失。（二）觀察方法與結(jié)果1.制備豬脊髓壓片觀察脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞。在顯微鏡下觀察，染色較深的小細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。染色為藍(lán)紫色的、大的、有多個(gè)突起的細(xì)胞是脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞，胞體呈三角形或星形，中央有一個(gè)圓形細(xì)胞核，內(nèi)有一個(gè)核仁。2.雞血涂片點(diǎn)制備與觀察取一滴雞血液，靠近一端滴在載玻片上，將另一載玻片點(diǎn)一端呈45°角緊貼在血滴點(diǎn)前緣，均勻用力向前推，使血液在載玻片上形成均勻的薄層，晾干，加瑞氏染液23滴，使覆蓋整個(gè)血膜，固定0.51min，滴加等量或稍多點(diǎn)新鮮蒸餾水，與染料混勻染色510min，用清水沖去染液，待自然干燥后或用吸水紙吸干，即可進(jìn)行鏡檢。顯

13、微鏡下可見雞血細(xì)胞為橢圓形，有核。白細(xì)胞數(shù)量少，為圓形。3.觀察平滑肌分離裝片低倍鏡下觀察平滑肌分離裝片，可見染成紫紅色呈紡錘形點(diǎn)肌細(xì)胞，細(xì)胞核為橢圓形，位于細(xì)胞的中央，著色很深，在細(xì)胞質(zhì)中有淡紅色的肌原纖維。低倍鏡觀察 油鏡下作業(yè)1. 思考題 為什么使用高倍鏡或油鏡必須從低倍鏡到高倍鏡或從低倍鏡到油鏡的順序進(jìn)行? 如果高倍鏡下找不到物象，應(yīng)從哪些方面找原因，如何解決?2.繪圖截取40×或者油鏡100×下雞紅細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的圖。實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞器的光鏡切片觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察細(xì)胞器中光學(xué)顯微鏡下的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容兩種細(xì)胞器的光鏡切片高爾基復(fù)合體的觀察脊神經(jīng)節(jié)

14、以硝酸鈷固定，再經(jīng)硝酸銀染液浸染制成永久制片。 高爾基復(fù)合體能與硝酸銀作用，并具有還原能力，使硝酸銀呈現(xiàn)棕黑色沉淀顏色反應(yīng)，因而顯示高爾基復(fù)合體的形態(tài)和位置。 方法： 低倍鏡觀察：尋找圓形或橢圓形的被染成黃色或淡黃色的細(xì)胞； 轉(zhuǎn)換高倍鏡：中央透亮區(qū)為核所在位置，核周圍棕褐色扭曲呈線狀、顆粒狀結(jié)構(gòu)即為高爾基復(fù)合體。 線粒體的觀察原理 肝、腎組織細(xì)胞富含線粒體，以重鉻酸鉀固定，再經(jīng)鐵蘇木精染色，制成永久制片。 線粒體有雙層膜結(jié)構(gòu)，蛋白、磷脂含量很高，有大量羧基和磷酸基等陰離子基團(tuán)，含陽離子的鐵蘇木精易與其結(jié)合，使線粒體顯示蘭色反應(yīng)。 方法低倍鏡觀察：可見許多被染成深蘭色的細(xì)胞，選擇顏色清晰，密集程

15、度較低的區(qū)域； 轉(zhuǎn)換高倍鏡：細(xì)胞核為1 - 2圓形的不著色的區(qū)域（有深蘭色的核仁），核周圍分布有許多深蘭色顆?；驐U狀小體，即線粒體。 附：生物學(xué)實(shí)驗(yàn)繪圖方法與要求繪圖時(shí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告點(diǎn)一種重要形式，其基本要求如下：1.準(zhǔn)備好3H鉛筆、橡皮、刀、尺子及繪圖紙，將繪圖紙放在觀察物的右邊，紙下不要墊書或紙張。2.繪圖時(shí)，特別注意觀察物的形狀、各部分點(diǎn)位置、比例和毗鄰關(guān)系。3.圖點(diǎn)位置、大小要適宜，圖占報(bào)告紙左上方2/3點(diǎn)面積，并考慮注字點(diǎn)位置。4.觀察清楚后，選擇典型的細(xì)胞或者組織，左眼看顯微鏡，右眼配合左眼，先用鉛筆在紙上輕輕描出輪廓，使形態(tài)正確，然后再用清晰的線條繪出，線條粗細(xì)要均勻不要重復(fù)。5

16、.用圓點(diǎn)表示明暗和立體感，點(diǎn)的點(diǎn)大小要均勻，不能涂陰影。6.圖繪好后，要在圖點(diǎn)右側(cè)注明各部分結(jié)構(gòu)名稱，引線要直而平行，長短適度，各引線不能交叉，各線右端上下對齊，注字要用正楷，不能潦草，要自左向右寫。7.每一個(gè)圖下面要注明圖的點(diǎn)名稱、放大倍數(shù)。8.繪圖紙上所有注字（包括姓名、實(shí)驗(yàn)日期、題目等）均用鉛筆書寫，不能用其他筆寫。作業(yè).繪圖截取40×或者油鏡100×下高爾基體和線粒體實(shí)驗(yàn)四 動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是用無菌操作的方法將動物體內(nèi)的組織(或器官)取出，模擬動物體內(nèi)的生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)。使其不斷地生長、繁殖，人們借以觀察細(xì)胞的生長、繁殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞衰老等過程的生命

17、現(xiàn)象。細(xì)胞培養(yǎng)的突出優(yōu)點(diǎn)，一是便于研究各種物理、化學(xué)等外界因素對細(xì)胞生長發(fā)育和分化等的影響；二是細(xì)胞培養(yǎng)便于人們對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(如細(xì)胞骨架等)、細(xì)胞生長及發(fā)育等過程的觀察。因而細(xì)胞培養(yǎng)是探索和指示細(xì)胞生命活動規(guī)律的種簡便易行的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，同時(shí)我們也不可忽略的另一個(gè)因素，那就是它脫離了生物機(jī)體后的些變化。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)目前已廣泛地被應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。如分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫痛學(xué)及病毒學(xué)等清洗與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解細(xì)胞原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)的基本操作方法；2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌操作技術(shù)；3.學(xué)習(xí)倒置顯微鏡的使用及培養(yǎng)細(xì)胞的觀察。二、實(shí)驗(yàn)原理清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一步

18、，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對清潔和無菌的要求程度很高。細(xì)胞養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。清洗后的玻璃器皿，不僅要求干凈透明，無油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。如有毒的化學(xué)物質(zhì)，也可能影響細(xì)胞生長。滅菌手段的選擇十分重要，對不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對，即使達(dá)到了無菌卻使被滅菌藥品喪失了營養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。以下在每種滅菌步驟中都介紹其使用范圍。三、實(shí)驗(yàn)材料、用品材料：無臭氧型紫外燈，微孔濾膜(直徑25)：孔徑為0.22m，微孔濾膜(直徑90)：孔徑為0.22 m，過濾器(直徑25)。藥品：70或75酒

19、精，0.1新潔爾滅，煤酚皂溶液(來蘇兒水)，0.5過氧乙酸，乳酸，37甲醛，高錳酸鉀，NaOH，鹽酸，重鉻酸鉀，濃硫酸(工業(yè))，DEPC水體積分?jǐn)?shù)0.1的焦炭酸二乙酯。儀器：超凈臺，干燥箱，高壓鍋，過濾器，過濾泵。四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)清洗1.新玻璃器皿的清洗先用自來水刷洗，再浸泡5稀鹽酸以中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和其他有害物質(zhì)。2.使用過的玻璃器皿的清洗(1)使用過的培養(yǎng)用品應(yīng)立即浸入清水，避免干涸難洗。(2)用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液過夜。(4)從酸性洗液撈出后自來水沖洗1015次去除殘余酸液，蒸餾水涮洗3次，倒置烘干。 (5)包裝(牛皮紙或一般紙)。

20、(6)高壓(15磅20 min)或干熱(1702 h)滅菌。(7)貯存?zhèn)溆谩?3.膠塞的處理 (1)新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2NaOH煮沸l(wèi)0-20 min。 (2)自來水清洗10次。 (3)再用1稀鹽酸浸泡30 min。 (4)自來水清洗10次，蒸餾水涮洗3次。晾干，高壓滅菌。舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸和清洗數(shù)次，過蒸餾水，晾干，包裝并高壓滅菌后，便可使用。（二）消毒1.物理消毒法 (1)紫外線消毒 用于消毒空氣、操作臺面和一些不能用干熱、濕熱滅菌的培養(yǎng)器皿，如塑料培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。這是常使用的消毒方法之一。 (2)干熱滅菌 主要用于玻璃器皿的滅菌。將用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿放

21、人干燥箱內(nèi)，加熱至160，保溫90120 min。用于RNA提取實(shí)驗(yàn)的用品則需180，保溫58 h。 (3)濕熱滅菌 此方法也稱為高壓蒸汽滅菌，是最有效的一種滅菌方法。主要應(yīng)用范圍是布類、橡膠制品(如膠塞)、金屬器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加熱后不發(fā)生沉淀的無機(jī)溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手動高壓滅菌鍋操作如下： 首先查看高壓鍋內(nèi)的水是否充足，放人物品蓋好蓋。加熱高壓鍋。將放氣閥打開，放氣510 min，以排除鍋內(nèi)的冷空氣。 待鍋內(nèi)水沸騰后，落下放氣閥繼續(xù)升溫升壓，玻璃器皿等用15磅(121)30 min，膠塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 )20 mi

22、n。調(diào)節(jié)火力大小保持該壓力。停止加熱，待壓力自然下降至0再打開放氣閥排汽，開蓋，取出高壓滅菌的物品烘干。 (4)濾過除菌 用于培養(yǎng)用液和各種不能高壓滅菌的溶液的滅菌。采用金屬濾器和小型的塑料濾器，配上可以更換的微孔濾膜，極大地方便了操作。濾器型號按直徑大小劃分。如過濾量大的培養(yǎng)用液常用較大型號的金屬濾器(直徑90 mm、100 mm、142 mm等)，配以過濾泵使用。過濾量較小的液體常用注射器推動的塑料小濾器(直徑20 mm、25 mm等)。濾膜孔徑有0.60m、0.45m、0.35 m、0.22 m、0.10m等，以0.22 m除菌最為保險(xiǎn)，但對于較粘稠難濾過的液體，仍需選用孔徑較大的濾膜。

23、在過濾器上裝上微孔濾膜，孔徑為0.22m。用布包好，濕熱滅菌后使用。 2.化學(xué)消毒法 常用的消毒液有如下幾種：(1)70(或75)酒精：超凈臺里常備70酒精棉球(衛(wèi)生級酒精)，用于手和一些金屬器械或工作臺面的消毒。(2)0.1新潔爾滅：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超凈臺面的清潔。超凈臺旁應(yīng)常備盛有0.1新潔爾滅溶液的容器及紗布。 (3)來蘇兒水(煤酚皂溶液)：主要用于無菌室桌椅、墻壁、地面的消毒和清洗，以及空氣噴撒消毒，特別是污染細(xì)胞的消毒處理。使用濃度請按瓶上說明。 (4)0.5過氧乙酸：是強(qiáng)效消毒劑，10 min即可將芽孢菌殺死。用于各種物品的表面消毒，用噴撒和擦拭方式進(jìn)行。 (5)乳

24、酸蒸氣：將乳酸放入坩鍋內(nèi)用酒精燈或電爐加熱至沸騰為止。將門窗緊閉13 d?？蓪⒖諝庵衅〉奈⑸餁⑺?。 (6)37甲醛加高錳酸鉀：使用前先緊閉門窗。將37甲醛用酒精燈或電爐加熱至沸騰后斷電或滅火。用一張紙盛好適量的高錳酸鉀，迅速放人已加熱好的甲醛中形成蒸氣。13 d后方可達(dá)到消毒空氣的目的。 3.煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事項(xiàng)1.清洗玻璃制品時(shí)，浸酸之后一定要用自來水沖洗1015次。因?yàn)闅埓娴南匆簩?xì)胞粘附有很大影響。清洗塑料制品時(shí)要用棉花或柔軟紗布擦洗。千萬不要用硬毛刷，否則損害塑料表面后細(xì)胞不易貼壁。Tip和Tube一定要用超聲清洗處理后逐個(gè)清洗

25、。如沒有洗凈會影響下一次使用的效果。 2.干熱滅菌時(shí)，應(yīng)在白天使用烤箱，并不斷觀察，以免發(fā)生意外。當(dāng)溫度超過100時(shí)，不能再打開烤箱門。器皿烤完后，待溫度降至100之下才能開烤箱門。金屬器械和橡膠、塑料制品不能使用干熱滅菌方法。. 3.高壓滅菌后器皿務(wù)必晾干或烘干，以防包裝紙潮濕發(fā)霉。4.牛血清、大部分培養(yǎng)基、胰酶和一些生物制劑是有機(jī)溶液，均不能高壓(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，異硫氰酸胍，MOPS等)。5.濾過除菌時(shí)，濾器在使用前先裝好濾膜(有時(shí)可在上面加一層定性濾紙)，包好，經(jīng)高壓滅菌后才能使用。濾過酶類制劑時(shí)應(yīng)待濾器溫度降至室溫下再進(jìn)行。過濾時(shí)壓力不宜過大，壓力數(shù)字以2為宜。壓力太大時(shí)

26、微孔濾膜可能破裂，或使某些微生物變形而通過濾膜。裝濾膜時(shí)位置要準(zhǔn)確。另外濾器包裝時(shí)，螺釘不要擰得太緊，以防高壓蒸汽不能進(jìn)入，待高壓滅菌之后，再擰緊使用。 6.使用化學(xué)消毒法時(shí)，配制75酒精應(yīng)用衛(wèi)生級，不要用化學(xué)純、分析純和優(yōu)質(zhì)純酒精。來蘇兒水不能用于皮膚消毒，它對皮膚有刺激性。空氣消毒時(shí)，所有的物品要事先準(zhǔn)備齊全并使消毒者有較方便的退出途徑。因?yàn)榧兹┗蛉樗峒訜岷蠓懦龅恼魵鈱θ说慕悄ず秃粑郎掀び袊?yán)重的刺激和傷害作用。 六、思考題1.哪些物品適合于高壓滅菌，并說明理由。2.紫外線消毒的適用范圍和目的是什么?II、原代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解細(xì)胞原代培養(yǎng)基本操作方法；2.掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程

27、中的無菌操作技術(shù)；3.學(xué)習(xí)倒置顯微鏡的使用及培養(yǎng)細(xì)胞的觀察。二、實(shí)驗(yàn)原理動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶將它分散成單個(gè)細(xì)胞后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。三、實(shí)驗(yàn)用品1、器材解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架、標(biāo)記筆、解剖板等。2、試劑磷酸鹽緩沖液(PBS)、無鈣、鎂溶液、細(xì)胞消化液：0.

28、5胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料乳鼠四、實(shí)驗(yàn)方法操作步驟方法一：胰酶消化法1. 洗手，用酒精擦手。2. 點(diǎn)燃酒精燈，將所需用品擺放整齊，方便自己操作。3. 取一只乳鼠，浸入75%乙醇中23s，然后取出來，放在滅菌好的培養(yǎng)皿中。4. 取材：取出無菌的手術(shù)器械，如果乳鼠還沒有死亡，用鑷子夾其頭部處死乳鼠。用鑷子提起腹部皮膚，用解剖剪充分剪開腹腔，將肝臟組織取下來，放入一個(gè)滅菌好的青霉素瓶中，用無菌吸管吸取3mlHanks液清洗23次，直至去掉血污為止。5. 消化：將洗凈的組織塊移入干凈的無菌的青霉素瓶中，將剪刀伸入瓶內(nèi)反復(fù)剪切組織塊，直至剪到0.51mm3大小的塊狀為止。加入2ml0

29、.25%胰蛋白酶，輕輕晃動，去掉胰酶溶液，重新加入3ml胰酶溶液，蓋好蓋子，放在37水浴中消化2030min，注意每間隔5min振搖一次。視組織塊變得疏松，顏色略變白時(shí)隨即從水浴中取出，放入超凈臺內(nèi)，用吸管反復(fù)吹打，使大部分組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，加入12ml培養(yǎng)液終止胰酶消化，靜止片刻，讓未被消化完的組織自然沉降，然后用吸管將細(xì)胞懸液移入無菌青霉素瓶中，蓋好蓋子。6. 離心：將青霉素瓶做好標(biāo)記，平衡后以1000r/min離心8min。在超凈臺內(nèi)棄上清，加入3ml培養(yǎng)液，吹打混勻后，取1滴去鏡檢，適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞密度。7. 細(xì)胞培養(yǎng)：取1ml細(xì)胞懸液至一干凈的培養(yǎng)皿中，再添加12ml培養(yǎng)液，

30、蓋上蓋子后，輕輕搖勻，置37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8. 觀察：每天對培養(yǎng)的細(xì)胞做常規(guī)檢查，觀察的主要內(nèi)容是：污染與否、細(xì)胞生長狀態(tài)和pH（培養(yǎng)液顏色變化）等情況。如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變?yōu)闄幟庶S又顯渾濁，表明可能被污染，細(xì)胞也就不易貼壁生長而逐漸死亡。如培養(yǎng)液顏色為橘紅色，一般說明細(xì)胞生長狀態(tài)良好。接種24h后，可見到許多細(xì)胞貼壁（由圓形懸浮狀態(tài)的細(xì)胞延展成扁平狀）。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞生長繁殖數(shù)量增加，培養(yǎng)液會逐漸變?yōu)辄S色，這時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。方法二：14步驟同胰酶消化法5.將洗凈的組織塊移入消毒的青霉素瓶中，用眼科剪刀剪切成0.5mm的小塊，然后加入12滴培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻。用吸管分次吸取組織漿塊，放

31、入培養(yǎng)瓶壁上散開，然后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使貼服組織面朝上，加入34ml培養(yǎng)液，加蓋，做標(biāo)記后，放置一段時(shí)間后，待組織小塊略干燥能牢固貼于瓶壁時(shí)，再慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶（動作一定要輕，減少振動，防止組織塊脫落），使組織塊浸泡在培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)。6.觀察：同胰酶消化法。III.傳代細(xì)胞培養(yǎng)與觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私鈧鞔?xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況。二、實(shí)驗(yàn)原理傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。這種培養(yǎng)，第一步也是制備細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞長成致密單層時(shí)，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破壞。所以般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸鹽

32、)的混合物，做為消化液。細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。三、實(shí)驗(yàn)用品1、器材解剖剪、解剖鑷、眼科剪(尖頭、彎頭)、眼科鑷(尖頭、彎頭)、培養(yǎng)皿、量筒、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、培養(yǎng)瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均須徹底清洗、烤干、包裝好，9.9xl04Pa(15磅)滅菌30min備用。此外，還有顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、酒精燈、酒精棉球、碘酒棉球、試管架

33、、標(biāo)記筆、解剖板等。2、試劑磷酸鹽緩沖液(PBS)無鈣、鎂溶液細(xì)胞消化液：0.5胰蛋白酶和0.4%EDTADMEM液3、材料雞胚細(xì)胞四、實(shí)驗(yàn)方法在做傳代細(xì)胞培養(yǎng)之前，首先將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞是否已長成致密單層，如已長成單層，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。1.營養(yǎng)液配制:EMEM液                         

34、0;      90%犢牛血清                                10%雙抗(1萬單位m1)           

35、0;   加至約100單位m1 7.4NaHCO3                    調(diào)pH至6.87.0 2.換液:在酒精燈旁打開瓶塞，倒去瓶中的細(xì)胞營養(yǎng)液。3.消化與分裝在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，輕輕搖動，將溶液倒出。重復(fù)上述動作。加入適量消化液（0.02%EDTA或0.04EDTA1ml十o.5胰蛋白酶液0.2ml）以蓋滿細(xì)胞為宜，置于室溫，停留12min后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶

36、，肉眼觀察細(xì)胞單層是否出現(xiàn)縫隙(針孔大小的空隙)，如出現(xiàn)縫隙，即可倒去消化液；如末出現(xiàn)縫隙，則可將瓶翻回，繼續(xù)進(jìn)行消化，直到出現(xiàn)縫隙為讓。此時(shí)，可倒去消化液，加入新配制的營養(yǎng)液20m1。然后用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的營養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞層至瓶壁細(xì)胞全部脫落下來為止。此時(shí)，可繼續(xù)輕輕地吹打細(xì)胞懸液，以使細(xì)胞散開。隨之進(jìn)行分裝。4.培養(yǎng)分裝好的細(xì)胞瓶上，做好標(biāo)志，注明細(xì)胞代號、日期。置于培養(yǎng)架上，輕搖使細(xì)胞均勻分布，以免堆積成團(tuán)。然后置于37培養(yǎng)。5.觀察(1)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的幾個(gè)問題；細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察，觀察的重點(diǎn)如下：A.首先要觀察培養(yǎng)細(xì)胞是否污染。主要觀察培養(yǎng)液顏色的變化及混

37、濁度B.觀察培養(yǎng)姬顏色變化及細(xì)胞是否生長。C.如細(xì)胞已生長，則要觀察細(xì)胞的形態(tài)特征并判斷其所處的生長階段。觀察時(shí)可參照(2)的描述進(jìn)行。D.觀察完畢，可用臺盤藍(lán)染液對細(xì)胞進(jìn)行染色。以確定死、活細(xì)胞的比例。(2)細(xì)胞的生長階段及其形態(tài)特征傳代培養(yǎng)的細(xì)胞需逐日進(jìn)行觀察，注意細(xì)胞有無污染，培養(yǎng)液顏色的變化及細(xì)胞生長的情況。般中層培養(yǎng)的細(xì)胞，從培養(yǎng)開始，經(jīng)過生長、繁殖、衰老及死亡的全過程。它是一個(gè)連續(xù)的生長過程，但為了觀察及描述，人為地將其分為5個(gè)時(shí)期，但各期間無明顯絕對界限?，F(xiàn)分別描述如下：A.游離期：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，由于細(xì)胞原生質(zhì)的收縮相表面張力以及細(xì)胞膜的彈性。所以，此時(shí)細(xì)胞多為圓

38、形，折光率高，此期可延續(xù)數(shù)小時(shí)。B.吸附期(貼壁)：由于細(xì)胞的附壁持性，細(xì)胞懸液靜置培養(yǎng)一段時(shí)間(約78h)后，便附著在瓶壁上(此期不同細(xì)胞所需時(shí)間不同)。在顯微鏡下觀察時(shí)可見瓶壁上有各種形態(tài)的細(xì)胞，如圓形、扁形、短菱形。細(xì)胞的特點(diǎn)，大多立體感強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，透明。C.繁殖期：培養(yǎng)l2h以后直到72h，細(xì)胞進(jìn)入繁殖期，加速了細(xì)胞生長和分裂。此期包括由幾個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞島(即由少數(shù)細(xì)胞緊密聚集而呈現(xiàn)的孤立細(xì)胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到細(xì)胞鋪滿整個(gè)瓶壁(即所謂形成細(xì)胞單層)的過程。此期細(xì)胞形態(tài)為多角形(呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞的特征)。細(xì)胞特點(diǎn)：透明，顆粒較少，細(xì)胞間界限清楚，并可隱約見到細(xì)胞核。根據(jù)

39、細(xì)胞所占瓶壁有效面積的百分率，又可將其生長狀況分為四級。以“十”的多少表示如下：十：細(xì)胞占瓶壁有效面積(也就是細(xì)胞能生長的瓶壁面積)的25以內(nèi)有新生細(xì)胞。一般要觀察35個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞生長狀況，然后加以綜合分析判斷。十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的2575以內(nèi)具新生細(xì)胞。十十十：細(xì)胞占瓶壁有效面積的7595具新生細(xì)胞。細(xì)胞排列致密。但仍有空隙。十十十十：細(xì)胞占瓶壁95以上，細(xì)胞已長滿或接近長滿單層，細(xì)胞致密，透明度好。從十十一十十十十為細(xì)胞的對數(shù)增長期(或稱為指數(shù)增長期)。D.維持期：當(dāng)細(xì)胞形成良好單層后，細(xì)胞的生長與分裂都減緩，并逐漸停止生長，這種現(xiàn)象被稱為細(xì)胞生長的接觸抑制。此時(shí)細(xì)胞界限逐漸模糊，

40、細(xì)胞內(nèi)顆粒逐漸增多，且透明度降低，立體感較差。由于代謝產(chǎn)物的不斷積累，維持液逐漸變酸。此時(shí)營養(yǎng)液已變?yōu)槌赛S色或黃色。E.衰退期：由于溶液中營養(yǎng)的減少和日齡的增長，以及代謝產(chǎn)物的累積等因素，此時(shí)細(xì)胞間可出現(xiàn)空隙，細(xì)胞中顆粒進(jìn)一步增多，透明度更低，立體感很差。若將細(xì)胞經(jīng)固定染色處理后，可見細(xì)胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，細(xì)胞皺縮，逐漸死亡，從瓶壁上脫落下來。五、思 考 題1.簡述細(xì)胞原代與傳代培養(yǎng)的操作程序及注意事項(xiàng)。3.細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么?3.簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長階段。實(shí)驗(yàn)五 ABO血型鑒定與交叉配血一、實(shí)驗(yàn)原理與目的血型就是紅細(xì)胞膜上特異抗原的類型。在ABO血型

41、系統(tǒng)中，紅細(xì)胞膜上抗原分A和B兩種抗原，而血清抗體分抗A和抗B兩種抗體。A抗原加抗A抗體或B抗原加抗B抗體，則產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。血型鑒定是將受試者的紅細(xì)胞加入標(biāo)準(zhǔn)A型血清（含有抗B抗體）與標(biāo)準(zhǔn)B型血清（含有抗A抗體）中，觀察有無凝集現(xiàn)象，從而測知受試者紅細(xì)胞膜上有無A或/和B抗原。在ABO血型系統(tǒng)，根據(jù)紅細(xì)胞膜上是否含A、B抗原而分為A、B、AB、O四型。（見下表）ABO血型中的抗原和抗體血 型紅細(xì)胞膜上所含的抗原血清中所含的抗體O無A和B抗A和抗BAA抗BBB抗AABA和B無抗A和抗B     交叉配血是將受血者的紅細(xì)胞與血清分別同供血者的血清與紅細(xì)胞混合，觀察有無

42、凝集現(xiàn)象。輸血時(shí)，一般主要考慮供血者的紅細(xì)胞不要被受血者的血清所凝集；其次才考慮受血者的紅細(xì)胞不被供血者的血清所凝集。前者叫交叉配血試驗(yàn)的主側(cè)（也叫直接配血），后者叫交叉配血的次側(cè)（也叫間接配血）。只有主側(cè)和次側(cè)均無凝集，稱為“配血相合”，才能進(jìn)行輸血；如果主側(cè)凝集，稱為“配血不合”或“配血禁忌”，絕對不能輸血；如果主側(cè)不凝集，而次側(cè)凝集，可以認(rèn)為“基本相合”，但輸血要特別謹(jǐn)慎，不宜過快過多，密切注視有無輸血反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)的目的是學(xué)習(xí)ABO血型鑒定的原理、方法以及交叉配血方法。二、實(shí)驗(yàn)對象學(xué)生三、實(shí)驗(yàn)器材和藥品1儀器 顯微鏡，離心機(jī)。2器械 采血針，消毒注射器，雙凹玻片，小試管，竹簽，棉球，臘筆

43、。3藥品 標(biāo)準(zhǔn)A血清，標(biāo)準(zhǔn)B血清，生理鹽水，75酒精，碘酒。四、實(shí)驗(yàn)步驟和觀察指標(biāo)交叉配血示意圖（一） ABO血型鑒定1. 玻片法（1） 取雙凹玻片一塊，用干凈紗布輕拭使之潔凈，在玻片兩端用臘筆標(biāo)明A及B，并分別各滴入A及B標(biāo)準(zhǔn)血清一滴。（2） 細(xì)胞懸液制備 從指尖或耳垂取血一滴，加入含1ml生理鹽水的小試管內(nèi)，混勻，即得約5紅細(xì)胞懸液。采血時(shí)應(yīng)注意先用75酒精消毒指尖或耳垂。（3） 用滴管吸取紅細(xì)胞懸液，分別各滴一滴于玻片兩端的血清上，注意勿使滴管與血清相接觸。（4） 竹簽兩頭分別混合，攪勻。（5） 1030min后觀察結(jié)果。如有凝集反應(yīng)可見到呈紅色點(diǎn)狀或小片狀凝集塊浮起。先用肉眼看有無凝集

44、現(xiàn)象，肉眼不易分辨時(shí)，則在低倍顯微鏡下觀察，如有凝集反應(yīng)，可見紅細(xì)胞聚集成團(tuán)。（6） 判斷血型 根據(jù)被試者紅細(xì)胞是否被A，B型標(biāo)準(zhǔn)血清所凝集，判斷其血型。玻片法鑒定ABO血型2. 試管法（1）取試管2只，分別標(biāo)明A，B字樣，分別加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)血清2滴，各管加入受試者的紅細(xì)胞懸液12滴搖勻。（2）將上述二試管用1000轉(zhuǎn)/分離心1min。（3）取出小試管，輕彈底部，如沉淀物呈團(tuán)塊狀浮起為凝集，呈散在煙霧狀上浮進(jìn)而恢復(fù)原混懸狀為無凝集。（二） 交叉配血1. 玻片法 （1）用碘酒，75%酒精棉球消毒皮膚后，用消毒干燥注射器抽取受血者及供血者靜脈血各2ml，各用一滴制備紅細(xì)胞懸液，分別標(biāo)明供血者與受血者

45、。余下血分別注入干凈小試管，也標(biāo)明供血者與受血者，待其凝固后析出血清備用。（2）左兩凹玻片左側(cè)標(biāo)上“主”（即主側(cè)）；右側(cè)標(biāo)上“次”（即次側(cè)）。主側(cè)滴入供血者紅細(xì)胞懸液一滴和受血者血清一滴；次則滴入受血者紅細(xì)胞懸液一滴和供血者血清一滴。 分別用竹簽混勻。（3） 1530min后，觀察結(jié)果。如兩側(cè)均無凝集現(xiàn)象，可多量輸血；如主側(cè)無凝集而次側(cè)有凝集只可考慮少量輸血；如主側(cè)凝集則不能輸血。2.試管法取二試管，分別注明“主”、“次”字樣，管內(nèi)所加內(nèi)容物同玻片法，混勻后1000rpm離心1min，取出觀察結(jié)果。 注意事項(xiàng)1.所用雙凹玻片的試管實(shí)驗(yàn)前必須清洗干凈，以免出現(xiàn)假凝集現(xiàn)象。2.A及B標(biāo)準(zhǔn)血清絕對不

46、能相混，所用滴管上貼橡皮膏標(biāo)明A及B、紅細(xì)胞懸液滴管頭不能接觸標(biāo)準(zhǔn)血清液面，竹簽一端去混勻一側(cè)就不能去接觸另一側(cè)。思考題1.在無標(biāo)準(zhǔn)血清情況下已如某人為A或B型，能否用其血去檢查未知血型？如何作？2.交叉配血時(shí)為何主側(cè)不凝集而次側(cè)凝集時(shí)，可以少量輸血？還需注意些什么？實(shí)驗(yàn)六 血涂片的制作與讀片一涂片（一）血液涂片的制作（1）需載玻片2張，分別稱為玻片1和玻片2（推片）。（2）用玻片1一端接約3mm直徑的血滴，將此玻片1保持水平。（3）取另一邊緣平整的載玻片2（推片），將其前端放在血滴前，與片1保持30°角并稍向后移與血滴接觸，即見血液沿片2（推片）下緣散開，使血液展開并充滿整個(gè)推片的

47、寬度。（4）立刻將推片與載玻片呈30°角，邊輕壓推片邊將血液按下圖的箭頭方向推動涂抹，至血液鋪完血膜為止。（5）揮動片1使血膜吹干，用蠟筆將血膜邊緣圈畫備染色。（6）每只動物涂片一張。（7）一張良好的血片，要求厚薄適宜，頭、體、尾分明。（8）置30min1h后較利于觀察紅細(xì)胞的形態(tài)。注意事項(xiàng)：如標(biāo)本本身太短，可觀察的部分會受局限，故以在離開載玻片另一端2cm地方涂抹為宜。載玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹貧血病人的血液時(shí)，將推片稍豎起（不是30°而是35°40°左右），以較快的速度推比較好，而對紅細(xì)胞增高的病人則相反。如用力過

48、猛白細(xì)胞容易破損。二染色血液涂片的染色（1）將待染涂片平放于染色架上。（2）用滴管將染液滴于涂片上，覆蓋整張涂片，放置13分鐘。（3）加入等量的磷酸緩沖液或蒸餾水，與染液混勻，可以用滴管從一端吸入，另一端放出，混勻?yàn)橹梗蛴米靵砘剌p輕吹之，使之混勻，室溫下染色510分鐘（白細(xì)胞數(shù)多或骨髓標(biāo)本時(shí)間應(yīng)長一些，如2030min）。（4）染色結(jié)束時(shí)，先用蒸餾水或緩沖液洗將涂片上的染液直接沖掉。（5）再將片子用自來水溫和沖洗，至血液膜呈淡紅色。（6）甩干或晾干玻片。（7）封片。血涂片的觀察方法1肉眼觀察在觀察染色標(biāo)本時(shí)，首先用肉眼對顏色進(jìn)行觀察。如果是正常的末梢血液則呈粉紅色，白血病時(shí)白細(xì)胞高度增加或骨

49、髓瘤的高球蛋白血癥等情況下，血涂片會帶有藍(lán)色，此時(shí)應(yīng)意識到為異常標(biāo)本。2高倍鏡下觀察首先觀察血涂片制備和染色是否良好、細(xì)胞分布是否均勻，同時(shí)可估計(jì)白細(xì)胞數(shù)量增減情況。最后對血涂片的體尾交界的區(qū)域進(jìn)行觀察，選擇細(xì)胞分布均勻不重疊、標(biāo)本不太厚容易觀察的地方進(jìn)行油鏡觀察。3油鏡下觀察 邊移動視野邊觀察下列各項(xiàng)：1）染色是否良好：如果血涂片染色確實(shí)不好，應(yīng)重新染色。2）觀察紅細(xì)胞形態(tài)：（1）有無人為造成的變形，此外有時(shí)載玻片上的堿性物質(zhì)的溶出（玻璃效應(yīng)）會導(dǎo)致紅細(xì)胞呈嚴(yán)重的棘形紅細(xì)胞。如固定不良（固定液中含有水分時(shí)）會導(dǎo)致呈面包圈形紅細(xì)胞，從而無法觀察紅細(xì)胞的形態(tài)。（2）大小如何，是大細(xì)胞還是小細(xì)胞，

50、有無紅細(xì)胞大小不一。（3）形態(tài)如何，注意有無畸形紅細(xì)胞、球形紅細(xì)胞、橢圓新紅細(xì)胞、靶形紅細(xì)胞、口形紅細(xì)胞（唇形紅細(xì)胞）、中心淡染色紅細(xì)胞、棘形紅細(xì)胞、膽狀紅細(xì)胞、皺縮紅細(xì)胞、淚滴狀紅細(xì)胞、破碎紅細(xì)胞及鐮狀紅細(xì)胞等。（4）是否有染色性的變化，有無嗜多色性紅細(xì)胞，中心淡染紅細(xì)胞。（5）紅細(xì)胞內(nèi)有無異常。觀察是否有嗜堿性點(diǎn)彩、豪-喬小體、卡波環(huán)狀體紅細(xì)胞、幼紅細(xì)胞、帕彭海姆氏小體和瘧原蟲的出現(xiàn)。（6）有關(guān)大小不一，畸形和嗜多色性，可分為輕度±、中度+、高度三個(gè)級別。3）觀察白細(xì)胞形態(tài)（1）與紅細(xì)胞比較，判斷白細(xì)胞數(shù)是否正常，是否增加或減少。紅細(xì)胞數(shù)/白細(xì)胞數(shù)約為500：1。（2）有關(guān)白細(xì)胞

51、的種類，要觀察大量的白細(xì)胞后才可判斷是否異常，然后計(jì)算白細(xì)胞的百分率。在日常檢查中，一般只計(jì)算100個(gè)，但是發(fā)現(xiàn)異?；虬准?xì)胞有增加時(shí)，盡量增加到200個(gè)。計(jì)算的白細(xì)胞數(shù)越多，白細(xì)胞百分率的可信度越高。4）觀察血小板形態(tài)（1）通過與紅細(xì)胞的比較，判斷血小板數(shù)量是否正常，是增加或減少。正常情況下每1520個(gè)紅細(xì)胞中有1個(gè)血小板。（2）注意大小的變化。（3）觀察未加抗凝劑而直接從毛細(xì)血管采集的標(biāo)本時(shí)，要注意血小板的凝集性（觀察由若干血小板凝集的現(xiàn)象。如果呈散在狀，則懷疑為血小板無力癥）。（4）觀察有無寄生蟲，當(dāng)白細(xì)胞減低或白細(xì)胞分類中單核細(xì)胞增多時(shí)，應(yīng)注意觀察紅細(xì)胞內(nèi)有無瘧原蟲。 各種典型血細(xì)胞的照

52、片（油鏡下）1血小板 2紅細(xì)胞 3正常白細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1數(shù)碼拍照（1）依次在低倍（×10）、高倍（×40）、油鏡（×100）下觀察紅細(xì)胞、白細(xì)胞以及血小板正常與異常的變化。（2）用數(shù)碼相機(jī)拍攝不同倍數(shù)下的細(xì)胞照片。（3）輸入電腦，比較分析各組間的差異。紅細(xì)胞呈桔紅色，白細(xì)胞核紫色，嗜酸顆粒細(xì)胞鮮紅色，嗜堿顆粒細(xì)胞藍(lán)紫色，中性顆粒細(xì)胞紫或紫紅色，淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞漿藍(lán)灰色，血小板紫色。2注意事項(xiàng)：1染色涂片水沖洗后，應(yīng)在空氣中自然干燥或風(fēng)干，不可用火烤干。2染液量要充足，勿使染液蒸發(fā)干燥。3細(xì)胞染色過淺或過深，待標(biāo)本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色數(shù)秒或數(shù)分鐘。

53、4保存過久的細(xì)胞涂片，細(xì)胞染色會退色，可重新染色。5新鮮涂片應(yīng)立即染色。作業(yè)繪圖：紅細(xì)胞及各種白細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞有絲分裂標(biāo)本的制備與形態(tài)觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^標(biāo)本制備和觀察了解生物體細(xì)胞的無絲分裂、有絲分裂形態(tài)特征及生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂過程。二、實(shí)驗(yàn)用品 1、材料和標(biāo)本 洋蔥根尖壓片。 2、器材和儀器 顯微鏡、擦鏡紙、解剖針、眼科鑷子、載玻片、蓋玻片、吸水紙、培養(yǎng)皿、冰箱。 3、試劑 70乙醇、改良堿性品紅染液。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 細(xì)胞分裂對生物的個(gè)體發(fā)育和生存，對種族綿延有著十分重要的意義，高等生物體內(nèi)細(xì)胞的分裂方式有三種：無絲分裂、有絲分裂和減數(shù)分裂。 一、動物細(xì)胞無絲分裂的觀察一蛙血涂片 (一)

54、原理 無絲分裂不僅是原核生物增殖的方式，而且雷馬克(Remak)于1841年最早在雞胚血細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，因?yàn)榇诉^程沒有出現(xiàn)紡錘絲和染色體的變化，故稱無絲分裂(Ami tosis)。其后無絲分裂又在各種動植物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，尤其在分裂旺盛的細(xì)胞中更多見，但遺傳物質(zhì)平均分配否?及其分裂的機(jī)制尚不十分清楚。 蛙紅細(xì)胞體積較大、數(shù)多，而且有核，是觀察無絲分裂的較好材料。 (二)觀察與結(jié)果 在高倍鏡下，可見到處于不同階段分裂過程中的蛙紅細(xì)胞，核仁先行分裂，向核的兩端移動，細(xì)胞核伸長呈桿狀；進(jìn)而，在核的中部從一面或兩面向內(nèi)凹陷，使核成腎形或啞鈴形改變；最后，從細(xì)胞中部直接收縮成兩個(gè)相似的子細(xì)胞；子細(xì)胞較成

55、熟的紅細(xì)胞小。 二、細(xì)胞有絲分裂的觀察一馬蛔蟲子宮切片、洋蔥根尖壓片 (一)原理 細(xì)胞有絲分裂(Mitosis)的現(xiàn)象是分別由弗勒明(Flemming，1882)在動物細(xì)胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。有絲分裂過程包括一系列復(fù)雜的核變化，染包體和紡錘體的出現(xiàn)，以及它們平均分配到每個(gè)子細(xì)胞的過程。 馬蛔蟲受精卵細(xì)胞中只有6條染色體，而洋蔥體細(xì)胞的染色體為16條，因?yàn)樗鼈兌季哂腥旧w數(shù)目少的特點(diǎn)，所以便于觀察和分析。 (二)觀察 1動物細(xì)胞有絲分裂的觀察馬蛔蟲子宮切片取馬蛔蟲的子宮切片標(biāo)本，先在低倍鏡下觀察，可見馬蛔蟲子宮腔內(nèi)有許多橢圓形的受精卵細(xì)胞，它們均處

56、在不同的細(xì)胞時(shí)相。每個(gè)卵細(xì)胞都包在卵殼之中，卵殼與卵細(xì)胞之間的腔，叫卵殼腔。細(xì)胞膜的外面或卵殼的內(nèi)面可見有極體附著。尋找和觀察處于分裂間期和有絲分裂不同時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)變化，并轉(zhuǎn)換高倍鏡仔細(xì)觀察。馬蛔蟲受精卵的有絲分裂間期(Interphase) 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有兩個(gè)近圓形的細(xì)胞核，一為雌原核，另一為雄原核。兩個(gè)原核形態(tài)相似不易分辨，核內(nèi)染色質(zhì)分布比較均勻，核膜、核仁清楚，細(xì)胞核附近可見中心粒存在。 分裂期(Mitosis) 前期(Prophase)雌、雄原核相互趨近,染色質(zhì)逐漸濃縮變粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色體相互混合，兩個(gè)中心粒分別向細(xì)胞兩極移動，紡錘體開始形成。 中期(Metaphase)

57、染色體聚集排列在細(xì)胞的中央形成赤道板，由于細(xì)胞切面不同，此期有側(cè)面觀和極面觀的兩種不同現(xiàn)象，側(cè)面觀染色體排列在細(xì)胞中央，兩極各有一個(gè)中心體，中心體之間的紡錘絲與染色體著絲點(diǎn)相連；極面觀由于染色體平排于赤道面上，六條染色體清晰可數(shù)，此時(shí)的染色體已縱裂為二，但尚未分離。洋蔥根尖細(xì)胞有絲分裂 后期(Anaphase)紡錘絲變短，縱裂后的染色體被分離為兩組，分別移向細(xì)胞兩極，細(xì)胞膜開始凹陷。 末期(Telophase)移向兩極的染色體恢復(fù)染色質(zhì)狀態(tài)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，最后細(xì)胞膜橫縊，兩個(gè)子細(xì)胞形成。 2植物細(xì)胞有絲分裂的觀察洋蔥根尖切片將洋蔥根尖切片標(biāo)本先在低倍鏡下觀察，尋找生長區(qū)，這部分的細(xì)胞分裂旺盛，大多處于分裂狀態(tài)，細(xì)胞形狀呈方形。換高倍鏡仔細(xì)觀察不同分裂時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)特征與動物細(xì)胞有絲分裂特征比較，找出植物細(xì)胞有絲分裂的特點(diǎn)和兩者的區(qū)別。3. 制備蠶豆根尖臨時(shí)壓片水解：取出根尖放在1N HCl中60水解8min，蒸餾水水洗3次。 染色