熒光原位雜交

1、單擊添加署名或公司信息 FISH原理原理以熒光素直接標(biāo)記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補(bǔ)的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強(qiáng)度下退火形成穩(wěn)定的異源雙鏈DNA，通過熒光標(biāo)記顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。 FISH發(fā)展發(fā)展1969年，同位素標(biāo)記的DNA探針；1974年，染色體顯帶技術(shù)與原位雜交結(jié)合；1981年，熒光素標(biāo)記的cDNA探針；90年代后，多色探針出現(xiàn)。 探針的發(fā)展放射性標(biāo)記：很難滿足靈敏度和分辨率這兩個(gè)原位雜交成功的條件，靈敏度要求放射性標(biāo)記具有高中輻射能（P32），檔標(biāo)記物能量過高時(shí)，會因?yàn)樾盘柹⑸鋵?dǎo)致分辨率過低；如果使用低輻射能的放射性標(biāo)記物（

2、3H）可以得到較高分辨率，但由于靈敏度低而需要長時(shí)間曝光，并由此導(dǎo)致北京過高而難以分辨出真正信號。非放射性標(biāo)記：常用的有生物素與熒光素。生物素一般通過連接到 dUTP 等核苷三磷酸上，這種經(jīng)修飾的核苷三磷酸再通過酶促反應(yīng)摻入到探針中；熒光素核苷三磷酸可在DNA聚合酶作用下?lián)饺氲教结樦腥?，常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（FITC）、羧基熒光素（FAM）、四氯-6-羧基熒光素（TET）、吲哚二羧氰（Cy3，Cy5）等 探針制備探針制備 所謂核酸探針即是指一段用放射性核素或其他標(biāo)記物（如酶與熒光素等）標(biāo)記的與目的基因互補(bǔ)的 DNA 片段或單鏈 DNA 或 RNA。根據(jù)其來源可分為“cDNA探針、基因組

3、探針、寡核苷酸探針與 RNA 探針”。 1.“cDNA1.“cDNA探針探針” 以 mRNA 為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成一條與 mRNA 互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）用堿除去mRNA2.“.“基因組探針基因組探針”是把染色體DNA通過超聲擊斷或以限制性內(nèi)切酶不完全水解獲得許多染色體DNA隨機(jī)片段擇長度約15-20kb（千對堿基）的DNA片段重組到噬菌體中經(jīng)體外包裝轉(zhuǎn)染大腸桿菌篩選出含目的基因的大腸桿菌擴(kuò)增后提取質(zhì)粒 酶切分離目的基因。 3.“.“寡核苷酸探針寡核苷酸探針”為人工合成的DNA片段，一般長約20-50個(gè)bp（堿基）。可根據(jù)已知DNA或RNA序列合成精確互補(bǔ)的DNA探針；如不知核酸序

4、列，可依據(jù)其蛋白產(chǎn)物的氨基酸順序推導(dǎo)出核酸序列合成DNA探針。由于DNA自動(dòng)合成儀的出現(xiàn)使探針的合成十分方便。 4.“RNA.“RNA探針探針”制備的技術(shù)路線為：將一段含完整或部分基因的DNA片段插入重組質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)以內(nèi)切酶在插入片段中某一適當(dāng)部位或在插入片段下游的某一部位消化重組質(zhì)粒使之成為線性DNA在相應(yīng)的DNA依賴性RNA聚合酶催化下，以含目的基因的DNA片段為模板合成RNA探針。由于RNA探針為單鏈，雜交時(shí)不存在第二條鏈的競爭，所以其敏感性較經(jīng)缺口平移標(biāo)記的DNA探針要高。 探針的非放射性標(biāo)記探針的非放射性標(biāo)記 間接標(biāo)記：間接標(biāo)記：是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交 后再用聯(lián)有熒光素

5、的抗生物素抗體檢測。（可（可將檢測信號放大，監(jiān)測到小至將檢測信號放大，監(jiān)測到小至00 b00 b的靶序的靶序列）列） 直接標(biāo)記：直接標(biāo)記：是通過熒光素直接與探針核苷酸或 磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)摻入熒光素核苷三磷酸標(biāo)記探針。（檢（檢測步驟簡單，但不能將信號放大，不如間接標(biāo)測步驟簡單，但不能將信號放大，不如間接標(biāo)記的探針靈敏）記的探針靈敏） 切口平移法： 切口平移標(biāo)記法先由胰DNA酶I在DNA雙鏈上隨機(jī)切口，大腸桿菌 DNA聚合酶I 作用以切口處開始，以另一條DNA鏈為模板，以4種三磷酸脫氧核苷酸為原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修復(fù)加入標(biāo)記核苷酸同時(shí)進(jìn)行，切口平行推移，可

6、均一標(biāo)記DNA鏈。（引物延伸法）本法與切口平移法相似，都是利用DNA聚合酶來合成與模板互補(bǔ)的新的DNA鏈。由于DNA聚合必須從具有3-OH的末端開始合成，因此與切口平移不同，引物延伸法需要一段與模序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸作引物，將它與模板雜交，以提供3-OH端。 探針類型探針類型1、染色體單一序列探針，包括各類人工染色體探針，如酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體，主要用以識別染色體的易位、缺失和擴(kuò)增。2、染色體涂染探針，包括通過流式分選或顯微切割獲得的全染色體或染色體臂以及特異性區(qū)帶的涂染探針，用以檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。3、染色體重復(fù)序列探針，主要是指著絲粒-衛(wèi)星 DNA 重復(fù)序列探針和端粒重復(fù)序

7、列探針，用以檢測染色體數(shù)目異常。 染色體涂染探針：判斷易位染色體染色體涂染探針：判斷易位染色體 8號染色體探針號染色體探針 -衛(wèi)星DNA是唯一一個(gè)存在于所有人類染色體著絲粒區(qū)域的著絲粒DNA（centromere DNA，CEN-DNA）家族，由171bp的單體為單位組成的高度串聯(lián)重復(fù)片段，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次，跨越長達(dá)100kb的著絲粒DNA區(qū)域，其雜交將產(chǎn)生很強(qiáng)的雜交信號。因此常被選為著絲粒探針的來源。 FISH技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì)、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用；3、實(shí)驗(yàn)周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準(zhǔn)確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng)；5、多色FISH通過在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。 Applications of FISH基因組結(jié)構(gòu)研究；基因組結(jié)構(gòu)研究；染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析；染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析；病毒感染分析；病毒感染分析；人類產(chǎn)前診斷；人類產(chǎn)前診