蛋白酶體抑制劑PS341對(duì)多發(fā)性骨髓瘤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多種細(xì)胞因子表達(dá)的影響

1、蛋白酶體抑制劑PS-341對(duì)多發(fā)性骨髓瘤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多種細(xì)胞因子表達(dá)的影響 作者：林如峰，陸化，劉澎，沈文怡，張建富，吳雨潔，費(fèi)小明，李建勇【摘要】 為了探討蛋白酶體抑制劑PS-341(bortezomib，velcade)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）細(xì)胞因子分泌的影響，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)11例MM患者M(jìn)SC，細(xì)胞數(shù)達(dá)5-10×105時(shí)以終濃度50 nmol/L的PS-341作用4小時(shí)，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)IL-6、IL-1、SCF細(xì)胞因子表達(dá)。結(jié)果表明： PS-341作用后MM病人MSC細(xì)胞因子的表達(dá)有顯著下

2、降，IL-6、IL-1、SCF的表達(dá)與對(duì)照組比較，其顯著性檢驗(yàn)結(jié)果分別為P<0.05、P<0.01、P<0.05，其中 IL-1尤為明顯；難治復(fù)發(fā)組與緩解組比較，IL-1的表達(dá)有顯著差異，完全緩解（CR）組IL-1表達(dá)受抑制更明顯，IL-6、SCF兩組間表達(dá)無(wú)明顯差異；PS-341治療的1例患者M(jìn)SC在PS-341作用后IL-1未見(jiàn)表達(dá)；IL-1的表達(dá)與否對(duì)IL-6、SCF的表達(dá)無(wú)影響。結(jié)論： 蛋白酶體抑制劑PS-341下調(diào)MM患者M(jìn)SC IL-6、IL-1、SCF細(xì)胞因子的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 多發(fā)性骨髓瘤2 / 16Effects of Protea

3、some Inhibitor PS-341 on the Multiple Cytokine Expressions of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow in Patients with Multiple MyelomaAbstract To explore the effects of proteasome inhibitor PS-341 on the cytokine expressions of mesenchymal stem cells (MSC) in patients with multiple myeloma（MM），MSCs

4、 of 11 patients were cultured in medium of RPMI 1640 containing 10% FBS. When cells grew to 5×105-1×106，cells were exposed to 50 nmol/L PS-341 for 4 hours，then harvested. The expressions of IL-6，IL-1 and SCF were detected by RT-PCR. The results indicated that after treatment with PS-341 th

5、e expressions of IL-6，IL-1 and SCF of MSCs decreased markedly，especially that of IL-1，compared with control (P<0.05、P<0.01、P<0.05，respectively). There were obviously differences of IL-1 expression between refractory/relapsed group and complete remission（CR）group and IL-1 express

6、ion was inhibited more seriously in CR group，whereas there were no significant differences of IL-6 and SCF expression between two groups；IL-1 expression of patients treated with PS-341 was not detected；there were not effects of IL-1 expression on expressions of IL-6 and SCF. It is concluded that pro

7、teasome inhibitor PS-341 downregulated the expressions of IL-6，IL-1 and SCF of MSCs in patients with MM .Key words proteasome inhibitor PS-341；multiple myeloma；mesenchymal stem cell；interlukin-6；interlukin-1；stem cell factor 實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，骨髓微環(huán)境對(duì)多發(fā)性骨髓瘤（MM）細(xì)胞的生存、增殖有重要作用1。針對(duì)骨髓微環(huán)境的靶向治療已成為MM治療研究的熱點(diǎn)之一，并取得了良好的效果。

8、間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是構(gòu)成骨髓微環(huán)境的重要成員，分泌的細(xì)胞因子在MM細(xì)胞的歸巢、生存、增殖和耐藥中起重要作用2，3。PS-341（bortezomib，velcade）是二類靶向治療藥物，通過(guò)作用骨髓瘤細(xì)胞和微環(huán)境抑制瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡，對(duì)難治復(fù)發(fā)和耐藥病人也有效4。本研究旨在探討PS-341在治療MM時(shí)對(duì)MSC有何影響以及了解MSC是否參與了PS-341對(duì)MM骨髓微環(huán)境的靶向治療機(jī)制。材料和方法標(biāo)本來(lái)源及主要試劑骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)自住院或門(mén)診MM患者骨髓，實(shí)驗(yàn)組共11例，其中CR 3例，難治6例（包括1例PS-341治療后患者），復(fù)發(fā)2例，生理鹽水替代藥物干預(yù)的患者標(biāo)本設(shè)為對(duì)照組，共10

9、例。PS-341購(gòu)自Millenuim Pharniaceuticals，Inc，USA，淋巴細(xì)胞分離液（比重為1.077）為上海生化二廠生產(chǎn)，RPMI 1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自HyClone公司，RNA抽提液Tripure為Roche生產(chǎn)，IL-6、IL-1、SCF及-actin引物為上海生物工程技術(shù)有限公司合成。MSC的采集、分離與培養(yǎng)無(wú)菌抽取骨髓15-20 ml，肝素抗凝，1×PBS 11稀釋后緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液中，800×g離心30分鐘，取中間單個(gè)核細(xì)胞層置于另一離心管中，PBS洗滌2次，RPMI 1640培養(yǎng)液吹打細(xì)胞成懸液，種植于含1

10、0% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于5% CO2、 37培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，以后3-4天換液1次，待細(xì)胞數(shù)達(dá)5×105-1×106時(shí)進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組不加藥物干預(yù)，只加等量生理鹽水；實(shí)驗(yàn)組11例加PS-341，用0.9%生理鹽水溶解蛋白酶體抑制劑PS-341，以終濃度50 nmol/L作用于MSC 4小時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化離心并制成細(xì)胞懸液1 ml，方法參見(jiàn)文獻(xiàn)5。細(xì)胞總RNA提取細(xì)胞懸液置于EP管離心，棄上清，Tripure充分裂解細(xì)胞，按該試劑提供的提取步驟抽提RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)濃度并行RNA電泳。

11、RT-PCR按Premega公司提供操作步驟進(jìn)行?？俁NA 1 g，oligo(dT)1 l，70預(yù)熱5分鐘后冰水浴5分鐘，加AMV酶10 U，25 mmol/L Mg2+ 2 l，10×buffer 5 l，加DEPC水至總體積25 l，42水浴1小時(shí)，95水浴5分鐘，冰水浴5分鐘，-20保存。cDNA 25 l，10 mol/L上下游引物各2.0 l，10 mmol/l dNTP 1 l，DNA聚合酶5 U，25 mmol/L Mg2+ 2 l，10×buffer 5 l，各細(xì)胞因子的反應(yīng)條件及引物序列見(jiàn)表1和表2。取PCR產(chǎn)物5 l 1.5%瓊脂糖凝膠電泳35分鐘，紫

12、外光下觀察結(jié)果、拍照并行灰度分析。PCR的條件及引物的序列分別見(jiàn)表1和表2。Tabel 1. PCR conditions for detection of -actin IL-6，IL-1 and SCF in MSC from patients of MM（略）Tabel 2. Primer sequences used in RT-PCR to detect cytokine expressions in MSC from patients with MM（略）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±SD）表示，所得數(shù)據(jù)用SPSS 12.0 for windons 軟

13、件分析，t檢驗(yàn)，P0.05為差異有顯著意義。結(jié)果PS-341對(duì)MM患者M(jìn)SC的 IL-6、IL-1、SCF細(xì)胞因子的表達(dá)均有顯著影響，與未經(jīng)PS-341作用的對(duì)照組比，3種細(xì)胞因子的表達(dá)都明顯下降，IL-6、IL-1、SCF細(xì)胞因子的表達(dá)與對(duì)照組比較P值分別是P<0.05、P<0.01、P<0.05。電泳圖及灰度分析結(jié)果分別見(jiàn)附圖和表3。其中以IL-1表達(dá)下降最為明顯（P<0.01），2例標(biāo)本未見(jiàn)目的條帶（1例為完全緩解患者，1例為PS-341治療過(guò)的患者）；與難治復(fù)發(fā)組比較，完全緩解病人MSC IL-1表達(dá)顯著下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；1例接

14、受過(guò)PS-341治療的患者其MSC在PS-341干預(yù)后未見(jiàn)IL-1表達(dá)，與治療前比較明顯受抑制。實(shí)驗(yàn)組IL-6、SCF細(xì)胞因子的表達(dá)較對(duì)照組低，有顯著差異，完全緩解、難治復(fù)發(fā)患者間無(wú)明顯差別。IL-1表達(dá)陰性的標(biāo)本與陽(yáng)性標(biāo)本比較，IL-6、SCF的表達(dá)無(wú)顯著差異。Tabel 3. Results of PCR product electrophoresis analysed by software of Labworks 4.0（略）討論多發(fā)性骨髓瘤（MM）是異常漿細(xì)胞單克隆惡性增生性疾病，目前無(wú)法治愈。對(duì)MM發(fā)病機(jī)制的深入研究認(rèn)識(shí)到，MM細(xì)胞賴以生存的骨髓微環(huán)境在疾病的發(fā)生、發(fā)展中有著相當(dāng)重

15、要的地位，針對(duì)骨髓微環(huán)境的靶向治療已成為MM治療的新的重要手段，這種療法對(duì)難治、復(fù)發(fā)及耐藥的患者具有良好的效果6.7。代表第一類靶位治療藥物的沙利度胺通過(guò)抑制骨髓血管新生和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等作用進(jìn)一步改善了MM的預(yù)后，有力證明了干預(yù)骨髓微環(huán)境可能成為治愈MM的途徑之一8。 蛋白酶體抑制劑PS-341代表了骨髓微環(huán)境靶位治療的第二類藥物，取得了良好的抗腫瘤效果。研究表明，PS-341可作用于MM細(xì)胞和骨髓微環(huán)境，通過(guò)抑制泛素-蛋白酶體途徑抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-B的活性和穩(wěn)定細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，從而抑制骨髓瘤細(xì)胞黏附和細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)瘤細(xì)胞凋亡9，其中抑制IL-6的分泌是PS-341靶位治療MM的重要機(jī)制。目

16、前PS-341作用機(jī)制的研究主要集中在蛋白酶體依賴的信號(hào)通路和對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接影響10，而對(duì)與細(xì)胞的歸巢、生存、增殖、凋亡及耐藥等生物學(xué)特性有重要關(guān)系的MSC的研究未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)查明MSC在PS-341治療MM中的作用進(jìn)一步了解PS-341的作用機(jī)制，以利于臨床應(yīng)用。 我們以終濃度50 nmol/L的PS-341(bortezomib)作用MSC 4小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1、SCF細(xì)胞因子的表達(dá)明顯降低。這些因子都已被實(shí)驗(yàn)證實(shí)是MM疾病發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子。實(shí)驗(yàn)觀察到對(duì)IL-1表達(dá)的抑制尤為明顯，完全緩解及用PS-341治療過(guò)的MM患者再用PS-341干預(yù)后，其MSC幾乎不表達(dá)

17、IL-1。IL-1是骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的重要調(diào)節(jié)因子，可刺激MSC分泌IL-6和多種黏附分子，促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖、耐藥和抗凋亡，并有獨(dú)特的破骨細(xì)胞作用，95%以上的MM細(xì)胞可檢測(cè)到此因子表達(dá)。研究者們認(rèn)為這是區(qū)別其他漿細(xì)胞病的重要指標(biāo)11，12；實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)IL-1抗體能有效抑制MM細(xì)胞的增殖11。我們的研究發(fā)現(xiàn)，PS-341對(duì)MSC IL-1的抑制十分明顯，鑒于IL-1在MM疾病中的重要作用，可以認(rèn)為抑制MSC IL-1的分泌是PS-341有效抗MM的重要機(jī)制之一。骨質(zhì)損害是MM的臨床特征之一，是疾病預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，而IL-1是與之關(guān)系最密切的細(xì)胞因子11，所以PS-341有可能有效治療M

18、M的骨質(zhì)損害，改善疾病的預(yù)后，值得臨床進(jìn)一步研究。與難治復(fù)發(fā)病人比較，完全緩解以及用PS-341治療過(guò)的MM患者，其MSC IL-1的表達(dá)受PS-341的抑制更為明顯，這間接證明了IL-1與MM疾病進(jìn)展關(guān)系密切，因此有必要對(duì)PS-341治療殘留疾病的效果進(jìn)行更多探討。實(shí)驗(yàn)觀察到，接受PS-341治療后的MSC用PS-341再次作用后未見(jiàn)IL-表達(dá)，這提示PS-341對(duì)IL-1的藥理作用可能有累加性，但由于例數(shù)少，無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。 IL-6被認(rèn)為是與MM細(xì)胞生物學(xué)特性關(guān)系最密切的細(xì)胞因子，下調(diào)IL-6的表達(dá)是靶位治療MM的基礎(chǔ)。文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道PS-341可抑制MM細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞IL-6的表達(dá)13，我們

19、的研究表明，PS-341抑制 MSC IL-6的表達(dá)并不依賴MM細(xì)胞與BMSC之間的相互作用，CR組和難治復(fù)發(fā)組無(wú)顯著差異。文獻(xiàn)報(bào)道IL-1可促進(jìn)IL-6的分泌11，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSC IL-1表達(dá)水平的高低不影響IL-6及SCF細(xì)胞因子的表達(dá)，這是否與PS-341對(duì)MSC作用機(jī)制的不同以及MSC本身特異性有關(guān)，值得實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。SCF與瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡有關(guān)3，我們發(fā)現(xiàn)PS-341對(duì)SCF也有明顯抑制作用，這可部分解釋MM患者接受PS-341治療后出現(xiàn)全血細(xì)胞減少的臨床表現(xiàn)。可見(jiàn)PS-341除了作用于蛋白酶體以外，MM患者M(jìn)SC亦為其治療的重要靶點(diǎn)之一，多位點(diǎn)的治療機(jī)制為PS-341有

20、效抗MM提供依據(jù)和可能，對(duì)其作用機(jī)制的逐步闡明有助于更有效運(yùn)用PS-341治療MM。 總之，PS-341明顯抑制MSC細(xì)胞因子的表達(dá)，是PS-341有效治療MM的機(jī)制之一。對(duì)難治復(fù)發(fā)的患者也有明顯效果。我們實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)了影響MSC細(xì)胞因子的表達(dá)是PS-341靶向治療MM的機(jī)制之一，但MSC具體如何參與PS-341靶向治療MM目前還不清楚，其作用機(jī)制可能更為復(fù)雜豐富，有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Lauta VM. A review of the cytokine network in multiple myeloma: diagnostic，prognostic，and therapeuti

21、c implications. Cancer，2003；97：2440-24522沈文怡.骨髓微環(huán)境與多發(fā)性骨髓瘤（綜述）. 白血病·淋巴瘤，2004；13：183-1853Wallace SR，Oken MM，Lunetta KL，et al. Abnormalities of bone marrow mesenchymal cells in multiple myeloma patients. Cancer，2001；91:1219-12304Rajkumar SV，Richardson PG，Hideshima T，et al. Proteasome inhibition as

22、 a novel therapeutic target in human cancer. J Clin Oncol，2005；23:630-6395Landowski TH，Megli CJ，Nullmeyer KD，et al. Mitochondrial-mediated disregulation of Ca2+ is a critical determinant of Velcade (PS-341/bortezomib) cytotoxicity in myeloma cell lines. Cancer Res，2005；65:3828-38366沈文怡，陸化，唐宇宏等. 多發(fā)性骨髓瘤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多種細(xì)胞因子的異常表達(dá). 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005；25:239-2427Richardson PG，Mitsiades CS，Hideshima T，et al. Novel biological therapies for the treatment of multiple myeloma. Best Pract Res Clin Haemat