分子生物學(xué)-05-基因功能研究方法

1、分子生物學(xué)研究法分子生物學(xué)技術(shù)體系n一一. 基本技術(shù)基本技術(shù)n二二. 基因基因(狹義狹義)及產(chǎn)物及產(chǎn)物 分子檢測技術(shù)分子檢測技術(shù)n三三. 基因基因(狹義狹義)及產(chǎn)物及產(chǎn)物 獲取技術(shù)獲取技術(shù)n四四. 基因基因 (廣義廣義) 功能研究技術(shù)功能研究技術(shù)一一. 基本技術(shù)基本技術(shù)1. 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳2. SDS-PAGE 電泳電泳3.PCR技術(shù)技術(shù)4.細(xì)菌轉(zhuǎn)化細(xì)菌轉(zhuǎn)化1.瓊脂糖凝膠電泳n1、原理：、原理：n2、用途：、用途：瓊脂糖凝膠電泳的原理 1. DNA電泳遷移電泳遷移：電荷效應(yīng)分子篩效益電荷效應(yīng)分子篩效益 （1）DNA帶負(fù)電，電場中，向正極移動； （2）決定移動速度三因素：DNA大小

2、，電荷數(shù)，構(gòu)型； ( 3) 線性DNA分子移動速度與其分子質(zhì)量的對數(shù)成反比； （分子量越大，跑得越慢） 2、檢測原理、檢測原理： （1）溴化乙錠（EB）可插入雙鏈DNA分子中，在紫外光照射下，發(fā)射熒光。瓊脂糖凝膠電泳用途n1. DNA分子量測定（距離分子量）n2. 基因，克隆的鑒定（通過1完成）n3、不同長度的基因片斷的分離n4、DNA濃度的測定 （熒光的強(qiáng)度與DNA含量成正比）n加標(biāo)準(zhǔn)分子量加標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA Marker,測定分子量測定分子量n加標(biāo)準(zhǔn)濃度的加標(biāo)準(zhǔn)濃度的DNA，測定濃度，測定濃度2. SDS-PAGE 電泳1、原理2、用途SDS-PAGE 電泳原理n1.SDS(帶負(fù)電帶負(fù)電)

3、和還原劑破壞蛋白的高級結(jié)構(gòu)和還原劑破壞蛋白的高級結(jié)構(gòu), 同時同時SDS與蛋白定量結(jié)合與蛋白定量結(jié)合, 消除蛋白之間的電消除蛋白之間的電荷差異荷差異,使得使得蛋白的遷移率主要依賴分子量蛋白的遷移率主要依賴分子量 ( (分分子小跑得快子小跑得快) .) .n2.2.不連續(xù)電泳不連續(xù)電泳: : 上層為濃縮膠上層為濃縮膠, ,可將樣品壓縮到可將樣品壓縮到同一起跑線同一起跑線, , 下層為分離膠下層為分離膠; ; 可獲得更高的分可獲得更高的分辨率辨率. .n3.3.考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色. .SDS-PAGE 電泳用途n1.蛋白分子量的測定n2.蛋白濃度的測定n3.蛋白的鑒定(通過1來實現(xiàn)

4、)3. PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 技術(shù) 5 3 3 5 PCR的基本原理的基本原理變性、復(fù)性、半保留復(fù)制變性、復(fù)性、半保留復(fù)制 PCR三步曲三步曲n變性變性 9097n退火退火 4555n延伸延伸 72變性延伸退火90 9540 6070 75PCR4. 細(xì)菌轉(zhuǎn)化n通常情況下，外源基因無法進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)；n當(dāng)用電擊法，或CaCl2，或RuCl等方法處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源基因進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。n感受態(tài)細(xì)胞的活性較低，處理需溫柔。二二. 基因基因(狹義狹義)及產(chǎn)物及產(chǎn)物 分子檢測技術(shù)分子檢測技術(shù) -定性定性, 定量定量, 定位定位1. DNA (分子量和序列分子量和序列 )

5、(1)(酶切)電泳; (2) PCR; (3)Southern blot; (4) 染色體原位雜交 (5)測序; 2. RNA (序列序列)(1)RT-PCR (2) Northern blot (3) RNA原位雜交 (4) DNA芯片技術(shù) ;(5)基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE)3. 蛋白蛋白(分子量分子量, 結(jié)合特性結(jié)合特性, 酶學(xué)特性酶學(xué)特性)(1)SDS-PAGE; (2)質(zhì)譜技術(shù); (3)Western blot; (4) ELISA; (5)蛋白芯片技術(shù); (6)免疫組化 (7) EMSA; (8)免疫共沉淀技術(shù) CoIP; (9)蛋白質(zhì)磷酸化分析Southern blot名稱名

6、稱檢測對象檢測對象探針探針檢測原理檢測原理處理過程處理過程用途用途Southern blotDNA標(biāo)記單鏈核酸核酸復(fù)性中堿基配對專一性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因檢測（拷貝數(shù)）Northern blotRNA標(biāo)記單鏈核酸核酸復(fù)性中堿基配對專一性變性瓊脂糖電泳后轉(zhuǎn)膜基因表達(dá)的檢測（表達(dá)量）Western blot蛋白抗體抗原抗體特異性結(jié)合SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白的檢測DNA檢測檢測Southern blotSouthern blot原位雜交技術(shù)原位雜交技術(shù)n通過標(biāo)記的核酸探針通過標(biāo)記的核酸探針, 在組織在組織,細(xì)胞細(xì)胞,間期核及間期核及染色體上對核酸進(jìn)行定位和相對定量研究的染色體上對核酸進(jìn)

7、行定位和相對定量研究的一種手段一種手段.n(1) RNA原位雜交-組織切片中,該基因的表達(dá)產(chǎn)物(mRNA)在細(xì)胞水平上作出定性定量分析.-區(qū)別 免疫組化(蛋白) (2) 染色體原位雜交-eg. 熒光原位雜交(FISH), 確定DNA序列染色體上的位置. DNA / RNA 檢測檢測雙脫氧法測序雙脫氧法測序(Dudeoxy sequence analyses)雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測序雙脫氧法又稱末端終止法，用于單鏈測序1.原理： Atkinson發(fā)現(xiàn)用 DNA pol 合成DNA時如在反 應(yīng)物中加入一定量的 2,3ddTTP 時，因ddT 的3碳原子不含OH,故DNA不能延伸。 19

8、82年Sanger 利用此原理建立了雙脫氧測序法。原理和加減法相似，但不再是加一種dNTP或減一種dNTP,而是加入某一種雙脫氧核苷，來終止聚合反應(yīng)。用此法測得G4含5577bp.DNA檢測檢測Northern blotRNA檢測檢測生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù) n生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固格體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。DNA / RNA / Protein 檢測檢測主要特點主要特點 n高通量、微型化和自動化高通量、微型化和自動化。芯片上

9、集成的成千上萬的密集排列的分子微陣列，能夠在短時間內(nèi)分析大量的生物分子，使人們快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的生物信息，效率是傳統(tǒng)檢測手段的成百上千倍。但目前的成本較高，重復(fù)性較差。生物芯片分類生物芯片分類 (1) -用途1 . 樣品制備芯片2. 生化反應(yīng)芯片（如PCR芯片）3. 檢測芯片 （如基因芯片，蛋白芯片）4. 芯片實驗室 （是生物芯片技術(shù)發(fā)展的最終目標(biāo)。它將樣品的制備、生化反應(yīng)到檢測分析的整個過程集約化形成微型分析系統(tǒng)）。 生物芯片分類生物芯片分類 (2) -制造技術(shù) 微孔板/微陣列芯片DNA微點陣(陣列)芯片 此類芯片的共同特點是,將多達(dá)成千上萬種探針分子按照一定順序排列在固相基片(多數(shù)采用

10、玻片)上組成密集的微點陣(Microarray)或陣列(Array),利用核酸雜交原理對靶核酸進(jìn)行檢測分析。蛋白質(zhì)微點陣(陣列)芯片 將大量純化的蛋白分子按一定的排列規(guī)律連接于玻片上,形成密集的微點陣(陣列),進(jìn)行高通量的生物活性檢測、蛋白質(zhì) 靶標(biāo)分子(蛋白質(zhì)、抗體、)相互作用研究。微流路芯片流過式芯片微流路(Microfluidic)芯片的共同特點是采用半導(dǎo)體微加工技術(shù)和(或)微電子工藝在芯片上構(gòu)建微流路系統(tǒng)(由儲液池、微反應(yīng)室、微通道、微電極、微電路中的一種或幾種組成),加載生物樣品和反應(yīng)液后,在壓力泵或電場的作用下形成微流路,于芯片上進(jìn)行一種或連續(xù)多種的反應(yīng),達(dá)到對樣品的高通量快速分析的

11、目的。微電子芯片PCR芯片毛細(xì)管電泳芯片毛細(xì)管層析芯片多功能集成芯片蛋白質(zhì)分析微流路芯片基因表達(dá)系列分析技術(shù)（基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE)n以測序為基礎(chǔ)的定量分析全基因組表達(dá)以測序為基礎(chǔ)的定量分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類模式的技術(shù)，能夠直接讀出任何一種類型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息；型細(xì)胞或組織的基因表達(dá)信息；n理論依據(jù)：堿基的核酸片段可理論依據(jù)：堿基的核酸片段可代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異序列（序列標(biāo)代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的特異序列（序列標(biāo)簽）簽）n某序列標(biāo)簽占總標(biāo)簽數(shù)的比例對應(yīng)編碼某序列標(biāo)簽占總標(biāo)簽數(shù)的比例對應(yīng)編碼基因的表達(dá)頻率基因的表達(dá)頻率RNA檢測檢測MS質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)

12、n質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比(m/z)的差異來分析蛋白質(zhì)和多肽的分子量和對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，磷酸化蛋白質(zhì)分析、糖基化蛋白質(zhì)分析等, 也能檢測核酸的SNP。 Protein / DNA 檢測檢測MALDI-TOF 和 ESI-MSnMALDI基質(zhì)輔助激光解吸離子化是將樣品均勻包埋在固體基質(zhì)中，基質(zhì)吸收激光提供的能量而蒸發(fā)，攜帶部分樣品分子進(jìn)入氣相，并將一部分能量傳遞給樣品分子使其離子化，這種質(zhì)譜儀的特點是可分析分子量分子量較大的分子較大的分子，對雜質(zhì)的忍耐性較好。nESI-電噴霧質(zhì)譜儀，通過樣品溶液在毛細(xì)管噴霧口形成液滴，在強(qiáng)電場和熱的干燥氣的共同作用下，液滴逐漸被

13、氣化，同時也被質(zhì)子化；噴霧口與離子聚焦傳輸區(qū)之間的壓力差推動質(zhì)子化樣品進(jìn)入質(zhì)量分析器進(jìn)行檢測。MALDI-TOF MS 分析分析21-aa 肽肽 (理論分子量理論分子量 2404) Western blotProtein 檢測檢測ELISAProtein 檢測檢測EMSAn凝膠阻滯試驗(electrophoretic mobility shift assay)n體外分析DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù).n原理: 非變性電泳中, 核酸蛋白結(jié)合后,泳動速度變慢.DNA與與Protein 相互作用檢測相互作用檢測免疫共沉淀技術(shù) (CoIP)n蛋白蛋白-蛋白相互作用蛋白相互作用n常驗證酵

14、母雙雜交的結(jié)果常驗證酵母雙雜交的結(jié)果Protein-protein 相互作用的檢測相互作用的檢測蛋白質(zhì)磷酸化分析n蛋白磷酸化是一種重要的細(xì)胞信號調(diào)控方式n一般在絲氨酸, 蘇氨酸和酪氨酸上磷酸化.n蛋白激酶-磷酸化; 蛋白質(zhì)磷酸酯酶-去磷酸化.n 一般通過雙向電泳和質(zhì)譜分析.n也可通過磷酸化抗體Western blot檢測Protein檢測檢測三三. 基因基因(狹義狹義)及產(chǎn)物及產(chǎn)物 獲取技術(shù)獲取技術(shù)1.已知基因已知基因(1)酶切, PCR或RT-PCR獲得基因;(2)通過常規(guī)分離純化技術(shù)或通過基因工程進(jìn)行克隆和表達(dá)基因產(chǎn)物.2.未知新基因未知新基因(1)RACE 技術(shù)(2) cDNA文庫(3)

15、酵母雙雜交(4)酵母單雜交(5)噬菌體展示技術(shù)(6)cDNA差示顯示法(7)雙向電泳+質(zhì)譜+數(shù)據(jù)庫技術(shù)一一.重重組組DNA技技術(shù)術(shù)概概論論3.1 RACE 技術(shù)nRapid amplification of cDNA ends已知基因一端序列, 快速獲取另一端序列.n5 RACE (獲取5序列) 3 RACE (獲取3序列)n需要合成引物接頭(單鏈DNA), 用RNA ligase將基因(RNA)與引物(DNA)連接.5 RACE3 RACE (非mRNA擴(kuò)增)n合成兩條互補(bǔ)的引物, 序列任意.及一條序列特異的引物n互補(bǔ)引物中一條5標(biāo)記 Pi, 通過RNA ligase 將其與RNA連接.2.

16、3 cDNA文庫1cDNA: (1) 將mRNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA. (2) 特點: A.穩(wěn)定; B.無內(nèi)含子.二. cDNA文庫: (1) 代表了生物體某一器官或者組織mRNA中所含的全部或絕大部分遺傳信息. (2) 特點: A.不同的生物, 同一生物不同組織, 同一組織不同發(fā)育時間或不同生理狀態(tài)下, cDNA文庫不同; B.建好的cDNA文庫的具體的信息未知,僅提供釣取相關(guān)目的基因的材料. C.每個克隆不一定是全長基因cDNA文庫建庫過程n1.高質(zhì)量mRNA的制備;n2.反轉(zhuǎn)錄生成cDNAn3.與載體分子連接(噬菌體文庫)n4.轉(zhuǎn)染(噬菌體的包裝)說明說明:1.引物引物 oligo dT

17、, 隨機(jī)引物隨機(jī)引物R6 (得到全長得到全長cDNA)2.兩端可加上酶切接頭兩端可加上酶切接頭,便于克便于克隆到載體上隆到載體上.3.合成時合成時,原料用甲基化的原料用甲基化的dCTP. 防止酶切時損傷內(nèi)部序列防止酶切時損傷內(nèi)部序列.4.轉(zhuǎn)化效率要高轉(zhuǎn)化效率要高, 防止少量表達(dá)防止少量表達(dá)的的mRNA未得到克隆未得到克隆.酵母雙雜交法（蛋白蛋白相互作用）n1.篩選與已知蛋白相互作用的蛋白基因n2.真核生物的轉(zhuǎn)錄激活子基本結(jié)構(gòu) 一般有3個功能域（functional domain）nDNA結(jié)合域（DNA-binding domain）DBn轉(zhuǎn)錄激活域（transcription-activati

18、ng domain）-ADn結(jié)合其它蛋白或因子的結(jié)構(gòu)域. “獵物獵物”為一個庫；為一個庫；將不同的將不同的“誘餌誘餌”克隆后，捕獲不同克隆后，捕獲不同的的“獵物獵物”.5 酵母單雜交（核酸-蛋白相互作用）n用于鑒定與特定順式作用元件（DNA序列）作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合域或反之噬菌體展示技術(shù)n蛋白-蛋白相互作用n將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達(dá)，從而使多肽能夠展示在病毒顆粒的表面，展示在噬菌體表面的多肽配體與各種靶分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)通過一種被稱為淘選的體外選擇程序得以快速篩選鑒定。噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建的文庫容量大，可進(jìn)行多次“淘選”富集，十分適用于高通量篩選，因

19、此可以廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用分析等方面的研究，也是進(jìn)行多肽藥物篩選的重要手段。 雙向電泳雙向電泳 n雙向電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)中對蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究的主要分離方法，同時能分離成百上千種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在第一向根據(jù)電荷的不同（等電聚焦），第二向根據(jù)分子量的不同進(jìn)行分離（SDS-PAGE）。分離后對蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，根據(jù)實際分析情況，分別進(jìn)行考馬斯亮蘭染色、銀染或熒光染色。掃描后用相關(guān)軟件（PDQUEST等）進(jìn)行圖譜分析，分析差別點等。雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，還可以進(jìn)一步分析差別點蛋白的特性。四四. 基因基因 (廣義廣義) 功能研究技術(shù)功能研究技術(shù)-調(diào)控元件功能和表達(dá)產(chǎn)物的功能調(diào)控元件功能和表達(dá)產(chǎn)物的功能1.定點突變技術(shù)定點突變技術(shù)2.基因打靶基因打靶3.RNAi技術(shù)技術(shù)4.轉(zhuǎn)基因過表達(dá)技術(shù)轉(zhuǎn)基因過表達(dá)技術(shù)5.報告基因技術(shù)報告基因技術(shù)定點突變n1.研究某個氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),功能的影響;n2.改造DNA調(diào)控序列,修飾表達(dá)載體,引入新的酶切位點.基因功能研究技術(shù)基因功能研究技術(shù)TaKaRa mutation kit基因打靶(g