RGD肽修飾殼聚糖作為種植體表面基因載體的研究綜述

1、RGD肽修飾殼聚糖作為種植體表面基因載體的研究綜述隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展以及口腔修復意識的進步， 現(xiàn)在越來越多的患 者選擇種植修復缺失牙，而骨量不足患者的種植修復因風險大而成為 學者們研究的重點。種植體表面處理的目的是為了促進成骨細胞在種 植體表面更好地成骨1。目前國內(nèi)外學者著力于研究種植體的不同表 面處理方法，如小分子靶向肽修飾殼聚糖作為基因載體、金屬鈦表面 接枝短肽促進成骨細胞的附著與成骨2等。RGD肽是一類含有精氨酸 —甘氨酸—天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp)序列的短肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，可與 11種整合 素特異性結合，促進成骨細胞生長，抑制破骨

2、細胞之間及破骨細胞與 基質(zhì)之間的黏附，從而促進骨組織再生3。將RGD肽組裝到種植體 表面，能明顯促進種植體周圍的新骨形成，增加種植體固位力。種植 體表面RGD組裝方法對其在種植體表面上的應用以及種植體骨整合 均有一定的影響。改善 RGD肽在種植體表面的固定方法是近年來學 者們研究的熱點4。殼聚糖(chitosan, C0是一種新型的非病毒基因載體材料，與 機體的生物相容性好，可生物降解，能有效地濃縮質(zhì)粒DNA(plasmid DNA, pDNA),同時其表面帶有的陽離子還可以和帶有陰離子的DNA有效地結合，從而保護DNA免受DNA酶(DNasel)的降解5。此外， CS具有強的生物黏附作用，毒

3、副作用小，來源豐富，價格低廉，作 為非病毒性基因載體具有獨特的優(yōu)勢。 但是，殼聚糖的低靶向性和低 轉染效率限制了其臨床應用6。為了提高殼聚糖的靶向性以及轉染效率，本研究擬在殼聚糖分子上進行短肽修飾，然后包裹pDNA,形成RGDCS/pDNA復合體，通過鈦表面層層自組裝以及化學偶聯(lián)的方法將 復合體接枝到種植體表面，以達到提高種植體植入后成骨效率的目的。1材料和方法1.1 主要材料和設備CS （分子質(zhì)量5.0×104,脫乙酰度大于等于 90%,浙江金 殼生物化學有限公司），1- （3-二甲基氨基丙基）-3乙基碳化二亞胺 鹽酸鹽1-（ 3-Dimethylamino propyl

4、） -3-ethylcarbodiimide hydrochloride , EDC·HCl（上海共價化學科技有限公司），N羥基琥珀酰亞胺 （N-Hydroxysuccinimide, NHS）（上海延長生化科技發(fā)展有限公司）， RGD肽（無錫亞肽生物科技有限公司），pDNA （華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán) 境學院），瓊脂糖（上海賽百盛基因技術有限公司），上樣緩沖液（loading buffer） （TaKaR公司，日本），DNaseI（TaKaR公司，日本）， 純鈦板（寶雞三線有色金屬材料廠）。FT-IT Nicolet Impact 410 型紅外光譜儀（Nicolet 公司，

5、美國）， Elementar Vario EL I元素分析測定儀（Elementar公司，德國）， BGpower 600電泳儀（北京百晶生物技術有限公司），GelDoc IT TS2 凝膠成像分析系統(tǒng)（UVP公司，美國），Nanoacope原子力顯微鏡 （atomic force microscope, AFM） （Veeco公司，美國），透析袋（MWCO 3500,上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）。1.2 鈦表面物理、生化處理7將商業(yè)純鈦片切割成方形試樣，表面噴砂粗化后行燒結處理，然 后進行混合酸液（98%H2SO4： 30%H2O2為1 ： 1）酸洗2 min,丙酮、 無水乙醇、雙蒸水依次超聲

6、清洗15 min,干燥。80 I 5 mo l·L-1 NaOH溶液羥化畢業(yè)論文網(wǎng)專業(yè)提供代寫論文的服務 www. dylw.nE T歡迎光臨處理24 h, 80雙蒸水陳化24 h,雙蒸水沖洗，干燥。鈦 酸四正丁酯（C16H36TiO4）與異丙醇1 : 3混合，劇烈攪拌（60 I, 4 h）,制備納米級TiO2溶膠。羥化后純鈦浸潤于溶膠反應 10 min, 無水乙醇超聲清洗，雙蒸水再羥化 1 min,干燥。重復3次。反應如 圖1。1.3 RG曲枝 CS形成 RGDCS81.3.1 ?；磻悸?lián)RGDW CS形成RGDCS稱取RGD太20.0 mg, 用 1%HAGNaAc

7、緩沖液（pH 6.0） 2 mL溶解。加入 EDC·HCl 100 mg, NHS 50 mg在4不磁力攪拌，活化12 h。稱取相對分子質(zhì)量 為50×103的CS 20 mg容于適量1%HAc溶液中，攪拌溶解。用 1%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0,得到黃色澄清溶液。在攪拌下，緩慢滴 入活化的RGD溶液中。4不繼續(xù)攪拌24 ho將反應液轉移至透析袋 中，用去離子水透析3 d,每12 h更換一次透析液。透析完畢后，產(chǎn) 物凍干待用。反應如圖1。1.3.2 RGOCS化學結構的表征檢測 采用紅外光譜儀對RGDCS進 行紅外光譜檢測（KBr壓片法），元素分析儀對

8、 CS RGD RGDCS 3 種樣品中元素C、H、N的含量進行測定。1.4 RGE3CS包裝 pDNA1.4.1 復凝聚法制備 RGDCS/pDNAg合體 稱取RGDCS 10.0 mg 溶于 0.2 mol·L-1 HAc-NaAc緩沖液（pH 5.0） 10 mL 中，配制 成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的RGDCS容液。將pDNA配制成0.1 mg·mL-1的溶液。在每一部分實驗中，保持每個樣品中加入 的DNA的質(zhì)量一定，按照不同的N/P （陽離子載體中的氮原子與 DNA 的磷原子的摩爾比例）加入一定量的 RGDCS溶液

9、，N/P為0、1、2、 5、10、20、50。采用 0.2 mol·L-1 HAc-NaAc緩沖?夜（pH 5.0） 將復合體溶液定容至相同體積。分別取 RGDCS溶液與骨形態(tài)發(fā)生蛋 白（bone morphogenetic protein , BMP） 2 質(zhì)粒溶液在 55 冰浴預熱 10 min,迅速將二者混合，通過渦旋儀混勻 1 min,將混合物在室溫 下放置30 min,即得RGDCS/pDNA復合體。反應如圖1。以不經(jīng)RGD 修飾的CS作為對照，在同樣條件下，合成 CS/pDNA復合體。1.4.2 凝膠電泳阻滯試驗檢測 RGDCS對質(zhì)粒的包裹情況 選取不 同N/

10、P比制備樣品，取 16 μL RGDCS/BMP2復合體與4 μL Loading Buffer混合，在120 mV電壓下電泳30 min。紫外燈下觀察 RGDCS對質(zhì)粒的包裹情況。1.4.3 AFM觀察RGDCS/pDNA復合體 取RGDCS/pDNA復合體固 定于云母片上，在輕敲模式下用AFM觀察其形態(tài)，輕敲頻率37 kHz, 掃描速度1.00 Hz,掃描范圍5 μm×5 μm （粗略掃描） 或 2 μm×2 μm （精細掃描）。1.5 RG3CS/pDNA復合體接枝鈦片1.5.1 RGDCS/pDNA復合體接枝鈦片的制備將鈦酸四正丁酯（C16H36TiO4與異丙醇以1 : 3的體積比混合，劇烈攪拌（6