第4章第1節(jié)_葉綠素?zé)晒鈪?shù)及意義-v2

1、第四章 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)應(yīng)用第一節(jié) 葉綠素?zé)晒鈪?shù)及其意義韓志國(guó)，呂中賢（澤泉開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，上海澤泉科技有限公司，上海，200333）葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)作為光合作用的經(jīng)典測(cè)量方法，已經(jīng)成為藻類生理生態(tài)研究領(lǐng)域功能最強(qiáng)大、使用最廣泛的技術(shù)之一。由于常溫常壓下葉綠素?zé)晒庵饕獊?lái)源于光系統(tǒng) II 的葉綠素 a，而光系統(tǒng) II 處于整個(gè)光合作用過(guò)程的最上游，因此包括光反應(yīng)和暗反應(yīng)在內(nèi)的多數(shù)光合過(guò)程的變化都會(huì)反饋給光系統(tǒng) II，進(jìn)而引起葉綠素 a 熒光的變化，也就是說(shuō)幾乎所有光合作用過(guò)程的變化都可通過(guò)葉綠素?zé)晒夥从吵鰜?lái)。與其它測(cè)量方法相比，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)還具有不需破碎細(xì)胞、簡(jiǎn)便、快捷、可靠等特性，因此在國(guó)際上得到

2、了廣泛的應(yīng)用。1 葉綠素?zé)晒獾膩?lái)源藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素分子既可以直接捕獲光能，也可以間接獲取其它捕光色素（如類胡蘿卜素）傳遞來(lái)的能量。葉綠素分子得到能量后，會(huì)從基態(tài)（低能態(tài)）躍遷到激發(fā)態(tài)（高能態(tài)）。根據(jù)吸收的能量多少，葉綠素分子可以躍遷到不同能級(jí)的激發(fā)態(tài)。若葉綠素分子吸收藍(lán)光，則躍遷到較高激發(fā)態(tài)；若葉綠素分析吸收紅光，則躍遷到最低激發(fā)態(tài)。處于較高激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，會(huì)在幾百飛秒（fs，1 fs=1015 s）內(nèi)通過(guò)振動(dòng)弛豫向周圍環(huán)境輻射熱量，回到最低激發(fā)態(tài)（圖 1）。而最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以穩(wěn)定存在幾納秒（ns，1 ns=109 s）。A較高激發(fā)態(tài)B熱耗散吸收藍(lán)光吸收紅光最低激發(fā)態(tài)能量

3、熒光基態(tài)藍(lán)波長(zhǎng)紅吸收熒光圖 1葉綠素吸收光能后能級(jí)變化（A）和對(duì)應(yīng)的吸收光譜（B）（引自韓博平 et al., 2003）處于最低激發(fā)態(tài)的葉綠素分子可以通過(guò)幾種途徑（圖 2）釋放能量回到基態(tài)(韓博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）將能量在一系列葉綠素分子之間傳遞，最后傳遞給反應(yīng)中心葉綠素 a，用于進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)；2）以熱的形式將能量耗散掉，即非輻射能量耗散（熱耗散）；3）放出熒光。這三個(gè)途徑相互競(jìng)爭(zhēng)、此消彼長(zhǎng)，往往是具有最大速率的途徑處于支配地位。一般而言，葉綠素?zé)晒獍l(fā)生在納秒級(jí)，而光化學(xué)反應(yīng)發(fā)射在皮秒級(jí)（ps，1 ps=1012 s），因此在正常生理狀態(tài)下

4、（室溫下），捕光色素吸收的能量主要用于進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng)，熒光只占約 3%5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。在活體細(xì)胞內(nèi)，由于激發(fā)能從葉綠素 b 到葉綠素 a 的傳遞幾乎達(dá)到 100的效率，因此基本檢測(cè)不到葉綠素 b 熒光。在常溫常壓下，光系統(tǒng) I 的葉綠素 a 發(fā)出的熒光很弱，基本可以忽略不計(jì)，對(duì)光系統(tǒng) I 葉綠素 a 熒光的研究要在 77 K 的低溫下進(jìn)行。因此，當(dāng)我們談到活體葉綠素?zé)晒鈺r(shí)，其實(shí)指的是來(lái)自光系統(tǒng) II 的葉綠素 a 發(fā)出的熒光。1第四章 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)應(yīng)用圖 2 激發(fā)能的三種去激途徑（引自韓博平 et al., 2003）L

5、HC，捕光色素蛋白復(fù)合體。2 葉綠素?zé)晒獾难芯繗v史在 19 世紀(jì)就有了關(guān)于葉綠素?zé)晒猬F(xiàn)象的記載。最初是在 1834 年由歐洲傳教士 Brewster 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)強(qiáng)光穿過(guò)月桂葉子的乙醇提取液時(shí)，溶液的顏色由綠色變成了紅色。1852 年 Stokes 認(rèn)識(shí)到這是一種光發(fā)射現(xiàn)象，并創(chuàng)造了“fluorescence”一詞。1931 年，德國(guó)科學(xué)家 Kautsky 和 Hirsch 用肉眼觀察并記錄了葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象，明確指出暗適應(yīng)處理的葉片照光后的誘導(dǎo)過(guò)程中，葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度的變化與 CO2 固定呈相反的關(guān)系(Kautsky and Hirsch, 1931; Govindjee, 1995)，此后的

6、10 余年中，Kautsky 和他的學(xué)生 Franck 就這一現(xiàn)象作了系統(tǒng)的研究(Kautsky and Franck, 1943)。在 Kautsky 研究的基礎(chǔ)上，后人進(jìn)一步對(duì)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象進(jìn)行了廣泛而深入的研究，并逐步形成了光合作用熒光誘導(dǎo)理論，被廣泛應(yīng)用于光合作用研究。由于 Kautsky 的杰出貢獻(xiàn)，葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象也被稱為 Kautsky 效應(yīng)（Kautsky Effect）。從 1960 年代到 1980 年代早期，葉綠素?zé)晒膺@一生物物理學(xué)的技術(shù)被廣泛用于光合作用基礎(chǔ)研究，很多重要發(fā)現(xiàn)都與這一技術(shù)有關(guān)，如光合作用存在兩個(gè)光反應(yīng)的提出(Duysens and Sweers,

7、1963)就是采用的這一技術(shù)應(yīng)用的典型代表。但在那個(gè)年代，所有的葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量都只能在完全遮蔽環(huán)境光的“黑匣子”里進(jìn)行，這大大限制了葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在植物脅迫生理學(xué)、生理生態(tài)學(xué)和植物病理學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間中，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究的使用中存在一個(gè)鴻溝。盡管如此，情況還是在逐步好轉(zhuǎn)。這是因?yàn)殡m然葉綠素?zé)晒庑盘?hào)雖然復(fù)雜，但確實(shí)提供了可靠的、定量的信息，并且可以由越來(lái)越小型化的儀器來(lái)進(jìn)行測(cè)量。1980 年代中期，德國(guó)烏茲堡大學(xué)的 Schreiber 提出了葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量的飽和脈沖理論，并發(fā)明了脈沖-振幅-調(diào)制（Pulse-Amplitude-Modulation）葉綠素?zé)晒?/p>

8、儀(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986)，也就是今天大名鼎鼎的調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x PAM。Schreiber 早年師從 Kautsky 的學(xué)生 Franck，在后者的指導(dǎo)下很早就開(kāi)始進(jìn)行葉綠素?zé)晒庋芯?Schreiber et al., 1971; Gielen et al., 2007)，并在 1975 年就設(shè)計(jì)出了科研界第一款便攜式葉綠素?zé)晒鈨x(Schreiber et al., 1975)。但受限于光電技術(shù)的發(fā)展，當(dāng)時(shí)這款熒光儀只能測(cè)量葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線，不能進(jìn)行深入的淬滅分析，直到 PAM 的出現(xiàn)才解決了這個(gè)問(wèn)題。調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x PAM 和調(diào)

9、制葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量技術(shù)在葉綠素?zé)晒獾难芯繗v史上具有里程碑意義。它采用了調(diào)制技術(shù)進(jìn)行測(cè)量，從而可以在有環(huán)境光照（甚至是很強(qiáng)的太陽(yáng)光）的情況下記錄葉綠素?zé)晒庑盘?hào)；2第四章 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)應(yīng)用它采用了飽和脈沖技術(shù)，使得光化學(xué)淬滅和非光化學(xué)淬滅的測(cè)量成為可能。PAM 面世后，很快就替代了傳統(tǒng)的光合放氧和 CO2 同化技術(shù)，成為使用最廣泛的光合活性測(cè)量技術(shù)。早期的調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，到了 1990 年代發(fā)展到可以非常方便的在野外現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量。早期的儀器采用光電二極管作為檢測(cè)器，只能測(cè)量葉片或細(xì)胞濃度很高的藻液，后來(lái)采用光電倍增管后可以直接檢測(cè)大洋海水的葉綠素?zé)晒?。隨著技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)出現(xiàn)了

10、葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)量技術(shù)、水下原位葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量技術(shù)、顯微葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量技術(shù)、無(wú)線遠(yuǎn)程葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量技術(shù)和利用葉綠素對(duì)浮游植物進(jìn)行分類的技術(shù)等，這些技術(shù)均在藻類學(xué)界得到了廣泛的應(yīng)用。3 調(diào)制葉綠素?zé)晒庠頌榱烁玫睦斫庹{(diào)制葉綠素?zé)晒?，首先要知道“熒光?qiáng)度（intensity）”和“熒光產(chǎn)量（yield）”的區(qū)別。“熒光強(qiáng)度”的高低依賴于激發(fā)光的強(qiáng)度和儀器的信號(hào)放大倍數(shù)，其變化可以達(dá)到幾個(gè)數(shù)量級(jí)的幅度。而“熒光產(chǎn)量”可以理解為固定儀器設(shè)置下的熒光強(qiáng)度，其變化不會(huì)超過(guò) 5-6 倍，是真正包含了光合作用信息的參數(shù)。例如針對(duì)一個(gè)暗適應(yīng)處理后的樣品，照射 0.5 µmol m-2 s-1 的測(cè)量

11、光后，其熒光產(chǎn)量是非常穩(wěn)定的。假設(shè)此時(shí)儀器的增益設(shè)置為 1，熒光強(qiáng)度為 300 mV；當(dāng)儀器的增益設(shè)置改為 3 后，熒光強(qiáng)度變?yōu)?900 mV。但實(shí)際上由于激發(fā)光恒定，樣品發(fā)出的熒光產(chǎn)量是恒定的，只是在不同的信號(hào)放大倍數(shù)下檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度不同而已。理想的熒光儀必須能在不改變樣品狀態(tài)的情況下（即非破壞性）進(jìn)行生理活性測(cè)量，需要滿足如下幾條要求(Schreiber, 1986; Schreiber et al., 1986; Schreiber, 2004)：1）測(cè)量光必須足夠低，只激發(fā)色素的本底熒光而不引起光合作用，這樣才能獲得暗適應(yīng)后的最小熒光 Fo；2）測(cè)量光由一系列微秒級(jí)的光脈沖組成，這些

12、短光脈沖可以不同的頻率給出。在很低的頻率下，即使單個(gè)微秒級(jí)光脈沖的強(qiáng)度比較高，也不會(huì)引起光合作用；3）用反應(yīng)迅速、線性范圍大的光電二極管（或光電倍增管）來(lái)檢測(cè)這些由微秒級(jí)測(cè)量光脈沖激發(fā)的微秒級(jí)熒光脈沖；4）熒光脈沖信號(hào)首先由交流耦合放大器放大，然后進(jìn)一步經(jīng)選擇性鎖相放大器處理，只放大和調(diào)制測(cè)量光同頻率的熒光信號(hào)，可以有效屏蔽環(huán)境中本身就存在的與葉綠素?zé)晒馔ㄩL(zhǎng)的背景噪音（這就好比選擇調(diào)頻收音機(jī)的某個(gè)頻道，就可以在浩如煙海的無(wú)線電波噪音中獲得選擇性接收您需要的無(wú)線電波，采用調(diào)制技術(shù)，可以在大量的環(huán)境光背景噪音中選擇性測(cè)量葉綠素 a 發(fā)出的熒光）；5）當(dāng)打開(kāi)光化光或飽和脈沖時(shí)，可以自動(dòng)提高測(cè)量光頻

13、率，以提高信號(hào)采點(diǎn)率，有效記錄一些比較快速的熒光動(dòng)力學(xué)變化（如熒光快速上升動(dòng)力學(xué)）。調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x有兩大核心技術(shù)，一個(gè)是上文提到的光調(diào)制技術(shù)，有了它才能使得我們?cè)谟协h(huán)境光的情況下測(cè)量葉綠素?zé)晒?；另一個(gè)就是飽和脈沖技術(shù)。所謂飽和脈沖技術(shù)，就是提供一個(gè)瞬間的強(qiáng)光脈沖，來(lái)暫時(shí)打斷光系統(tǒng) II 電子傳遞過(guò)程。我們已經(jīng)知道，光合機(jī)構(gòu)吸收的光能有三條去激途徑：光化學(xué)反應(yīng)（Photochemistry, P）、葉綠素?zé)晒猓‵luroescence, F）和熱耗散（Dissipation, D）。根據(jù)能量守恒原理，假設(shè)吸收的光能為常數(shù) 1，得到 1=P+F+D。葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量可以測(cè)量出來(lái)，而我們希望得出 P

14、 和 D 兩個(gè)參數(shù)。根據(jù)基本的數(shù)學(xué)原理，一個(gè)等式有兩個(gè)未知數(shù)是無(wú)解的。此時(shí)如果給出一個(gè)飽和脈沖，暫時(shí)打斷光化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，則 P=0，這個(gè)等式就可以求解了。由此可知，飽和脈沖技術(shù)的基本作用就是打斷光合作用，用于求出光化學(xué)反應(yīng)和熱耗散分別用去了多少能量。早期，科研人員只能通過(guò)人為加入農(nóng)藥敵草?。―CMU）來(lái)阻斷光系統(tǒng) II 的電子傳遞過(guò)程，從而獲得最大熒光 Fm，而這是不可逆的。后來(lái)，Schreiber 在“光強(qiáng)倍增”技術(shù)(Bradbury and Baker, 1981; Quick and Horton, 1984)的基礎(chǔ)上提出了“飽和脈沖”技術(shù)(Schreiber et al., 1986)

15、。飽和脈沖技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)在于，它是暫時(shí)阻斷光系統(tǒng) II 的電子傳遞過(guò)程，由于持續(xù)時(shí)間很短（一般 0.2-1.5 s），因此飽和脈 沖關(guān)閉后光合電子傳遞會(huì)在極端的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)。所以說(shuō)這是一種可逆的過(guò)程，正是有了飽和脈沖技術(shù)，我們才能不破3第四章 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)應(yīng)用壞樣品的完整性就獲得其光合生理參數(shù)。4 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線和典型參數(shù)從 Kautsky 發(fā)現(xiàn)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)現(xiàn)象并提出其與光合作用的關(guān)系后，80 多年來(lái)利用葉綠素?zé)晒庋芯抗夂献饔貌捎玫淖钪饕夹g(shù)就是熒光誘導(dǎo)曲線。那么什么是葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線呢？測(cè)量葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線能獲得哪些生物信息呢？所謂葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)，就是將樣品在黑暗的狀態(tài)下適應(yīng)一

16、段時(shí)間，然后照射光化光，觀察樣品的光合機(jī)構(gòu)從暗轉(zhuǎn)到光下的響應(yīng)過(guò)程。為什么要暗適應(yīng)呢？在光合電子傳遞鏈上有一個(gè)叫做質(zhì)體醌（PQ）的載體，是整個(gè)電子傳遞過(guò)程的限速步驟，可以通俗的稱之為電子門。在光合膜上 PQ 的數(shù)量與捕光色素吸收的光子數(shù)（微摩爾級(jí)）相比是微不足道的。因此光合作用進(jìn)行時(shí)，光系統(tǒng) II 釋放出的電子總是有部分會(huì)累積在電子門 PQ 處，這部分處于還原態(tài)（累積電子）的電子門就處于關(guān)閉態(tài)，或者說(shuō)光系統(tǒng) II 的反應(yīng)中心處于關(guān)閉態(tài)。在暗適應(yīng)過(guò)程中，光系統(tǒng) II 無(wú)法獲得光能激發(fā)，因此不會(huì)繼續(xù)釋放電子，累積在 PQ 處的電子會(huì)繼續(xù)往光系統(tǒng) I 傳遞，直到所有電子都傳遞完畢。當(dāng) PQ 處不再累積

17、電子后，暗適應(yīng)就足夠了。暗適應(yīng)結(jié)束后，就可以照光進(jìn)行熒光誘導(dǎo)了。那么采用什么光進(jìn)行誘導(dǎo)呢？只要能夠引起光合作用的光也就是波長(zhǎng)在 400-700 nm 的可見(jiàn)光，都可以進(jìn)行熒光誘導(dǎo)，我們給它一個(gè)專業(yè)術(shù)語(yǔ)叫做光化光（Actinic Light），也有人翻譯為作用光。在光合作用領(lǐng)域，400-700 nm 的光也被稱為光合有效輻射（Photosynthetic Active Radiation, PAR）。光化光可以為人工光，如來(lái)自日光燈、鹵素?zé)艋虬l(fā)光二極管的光，也可以為自然光（直接或間接的太陽(yáng)光）。但為了使我們的實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性，多數(shù)熒光誘導(dǎo)的測(cè)量會(huì)采用儀器提供的恒定光強(qiáng)的人工光（新型儀器多以光強(qiáng)穩(wěn)

18、定的發(fā)光二極管為主）來(lái)誘導(dǎo)。只有保證測(cè)量條件一致，才能對(duì)不同材料或不同處理的樣品進(jìn)行直接比較。圖 3 葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線（韓志國(guó) and 呂中賢，未發(fā)表數(shù)據(jù)）SP，飽和脈沖（Saturation Pulse）；AL，光化光（Actinic Light）。Fo，最小熒光；Fm，最大熒光。整個(gè)測(cè)量過(guò)程中調(diào)制測(cè)量光需要一直打開(kāi)。圖 3 是一條典型的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線，其測(cè)量步驟如下：1） 樣品首先暗適應(yīng)處理一段時(shí)間，以便累積在 PQ 處的所有電子都被傳走，光系統(tǒng) II 的所有反應(yīng)中心都處于開(kāi)放態(tài)。然后打開(kāi)測(cè)量光（Measuring Light, ML），記錄暗適應(yīng)后的最小熒光 Fo。測(cè)量光很弱（一般

19、小于 1 mol m-2 s-1），只激發(fā)色素的本底熒光但不足以引起任何的光合作用。4第四章 葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)應(yīng)用2） 緊接著打開(kāi)一個(gè)持續(xù)時(shí)間僅有 0.2-1.5 s 的飽和脈沖（Saturation Pulse，SP），測(cè)量暗適應(yīng)后的最大熒光 Fm。飽和脈沖打開(kāi)后，由光系統(tǒng) II 處釋放的電子迅速將 PQ 全部還原（電子門全部關(guān)閉），光化學(xué)反應(yīng)被打斷，光能全部轉(zhuǎn)化為葉綠素?zé)晒夂蜔崃?，熒光迅速達(dá)到最大值 Fm。飽和脈沖的強(qiáng)度非常強(qiáng)，高等植物一般要求達(dá)到 8000-10000 mol m-2 s-1，藻類一般大于 4000mol m-2 s-1 即可。3） 飽和脈沖關(guān)閉后熒光迅速回到 Fo 附近，

20、然后打開(kāi)光化光（Actinic Light，AL），記錄葉綠素?zé)晒鈴暮诎缔D(zhuǎn)到光照的響應(yīng)過(guò)程。如上所述，光合作用進(jìn)行時(shí)，總是有部分電子門處于關(guān)閉態(tài)。這部分處于關(guān)閉態(tài)的電子門本應(yīng)用于光合作用的能量就轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔帷ｏ柡兔}沖關(guān)閉后，電子門迅速全部打開(kāi)。此時(shí)打開(kāi)光化光，光系統(tǒng) II 瞬間釋放出大量電子，導(dǎo)致許多電子門被關(guān)閉，因此實(shí)時(shí)熒光迅速上升。此時(shí)，光合器官會(huì)迅速啟動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)適應(yīng)這種光照狀態(tài)，光系統(tǒng) I 逐漸從 PQ 處獲取電子。在恒定的光化光強(qiáng)度下，PS II 釋放的電子數(shù)是恒定的，因此隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，處于關(guān)閉態(tài)的電子門越來(lái)越少，熒光逐漸下降并達(dá)到穩(wěn)態(tài)。此時(shí)，處于關(guān)閉態(tài)的電子門數(shù)量達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，也就是說(shuō)光系統(tǒng) II 和光系統(tǒng) I 達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡。4） 等熒光曲線達(dá)到穩(wěn)態(tài)后關(guān)閉光化光，并結(jié)束整個(gè)測(cè)量過(guò)程。有時(shí)，為了精確的獲得 Fo這個(gè)參數(shù)，會(huì)在關(guān)閉光化光的同時(shí)打開(kāi)一個(gè)持續(xù)幾秒的遠(yuǎn)紅光（Far-red Light, FL）（圖 3 中未示出），以加快電子從 PQ 向光系統(tǒng) I 的傳遞。根據(jù)圖 3 中的 Fo 和 Fm，可以計(jì)算出光系統(tǒng)