淀粉酶菌株的選育、發(fā)酵工藝的研究和酶的純化

1、淀粉酶菌株的選育、發(fā)酵工藝的研究和酶的純化摘要：淀粉酶是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一，為了提高淀粉酶的生產(chǎn)水平，首先通過淀粉培養(yǎng)基從土壤中篩選出產(chǎn)淀粉酶的活性菌株，對菌株初步鑒定后進(jìn)行紫外線誘變，篩選出產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的突變菌株，再用正交試驗(yàn)的方法對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)最后采用硫酸銨沉淀法初步純化發(fā)酵得到的淀粉酶并對酶活性進(jìn)行了測定。關(guān)鍵詞：淀粉酶；分離篩選；紫外線誘變；優(yōu)化；提純1、 引言淀粉酶是能夠分解淀粉糖苷鍵的一類酶的總稱，包括-淀粉酶、-淀粉酶、糖化酶和異淀粉酶，是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多，特

2、點(diǎn)各異，在造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域具有廣闊的用途。我國是傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，發(fā)展淀粉深加工工業(yè)是解決當(dāng)前淀粉生產(chǎn)積壓的好出路，而幾乎所有淀粉深加工工業(yè)的基礎(chǔ)都是以淀粉質(zhì)原料的水解作為第一步，因此淀粉質(zhì)原料的液化情況直接關(guān)系到產(chǎn)品后期的加工工藝和產(chǎn)品的質(zhì)量。所以，改進(jìn)淀粉液化工藝也是降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品市場競爭能力的一種重要手段。顯然，改進(jìn)淀粉液化工藝首要任務(wù)就是提高淀粉酶的生產(chǎn)水平。那如何提高淀粉酶的生產(chǎn)水平呢？我們知道，現(xiàn)在淀粉酶主要來源于植物和微生物，并通過發(fā)酵完成生產(chǎn)，因此篩選出高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌是淀粉酶生

3、產(chǎn)的頭等大事。本文試圖從土壤中分離出產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌，通過紫外線誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化來得到高產(chǎn)、穩(wěn)定的淀粉酶產(chǎn)生菌株，并對發(fā)酵得到的淀粉酶進(jìn)行初步提純，以達(dá)到加深對發(fā)酵工程上游技術(shù)中菌種選育的認(rèn)識(shí)、掌握紫外線誘變育種的原理和方法、了解發(fā)酵條件對產(chǎn)物形成的影響、熟悉發(fā)酵條件的優(yōu)化方法、掌握分光光度法測液化型淀粉酶活力的基本原理和方法、掌握初步純化淀粉酶的方法的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、 材料與方法2. 1 實(shí)驗(yàn)材料211 樣品：貴師大綜合樓附近的土壤212 培養(yǎng)基和試劑：淀粉培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨（斜面）、牛肉膏蛋白胨（液體）種子培養(yǎng)基、淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基、生理鹽水、碘液、2可溶性淀粉、硫酸銨、乙酸溶液、磷

4、酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)糊精溶液213 儀器設(shè)備：全自動(dòng)高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、移液管、PH試紙、吸耳球、玻璃棒、量筒、試管、試管架、酒精燈、電子天平、三角燒瓶、洗瓶、接種針、接種環(huán)、直尺、記號(hào)筆等。2. 2 實(shí)驗(yàn)方法221 細(xì)菌的分離與初步鑒定：將土壤系列稀釋，把10-3 、 10-4、10-5分別涂布到淀粉培養(yǎng)基上，27倒置培養(yǎng)2天，將長出的菌落接入斜面。將細(xì)菌從斜面接種到淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，用碘液染色，記錄透明圈大小和菌落直徑，計(jì)算D/d值。保菌供下次實(shí)驗(yàn)用。222 紫外線誘變育種：取活化后的菌種配成菌懸液、稀釋；倒淀粉培

5、養(yǎng)基平板，將菌懸液涂布其表面；用紫外線處理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每個(gè)處理2次重復(fù)；放到黑暗中倒置培養(yǎng)，37培養(yǎng)48h，分別計(jì)數(shù)誘變組和對照組平板上的菌落數(shù)，并計(jì)算致死率；加入碘液，分別測量誘變組和對照組菌落的透明圈直徑和菌落直徑，計(jì)算D/d值；將D/d值最大的菌種保存到斜面培養(yǎng)基上。223 生產(chǎn)菌株搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化2231 培養(yǎng)基初始pH值和裝液量對產(chǎn)酶的影響：用1mol/L鹽酸或1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，使培養(yǎng)基的pH值為5.0、7.0、9.0，分裝至250mL三角瓶中，每瓶25mL，滅菌，冷卻后編號(hào)1、2、3，再接種，37下恒溫?fù)u床培養(yǎng)4

6、8h（搖瓶裝液量分別30、40、50），最后測定發(fā)酵液酶活。 編號(hào)處理項(xiàng)1號(hào)2號(hào)3號(hào)PH579裝液量304050A66010-110-22.2.3.2 培養(yǎng)基碳源對產(chǎn)酶的影響：在不含可溶性淀粉的培養(yǎng)基中，分別加入0.5的各種碳源（可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖），以硝酸銨作為唯一氮源，進(jìn)行碳源對產(chǎn)酶的影響的發(fā)酵試驗(yàn)。 處理 結(jié)果可溶性淀粉葡萄糖蔗糖A66010-110-22.2.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：通過三因素兩水平的正交試驗(yàn)對高產(chǎn)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，建立高產(chǎn)菌株的最佳搖瓶發(fā)酵條件。因素處理接種量淀粉含量蛋白胨含量處理一35g/L5g/L處理二310g/L10g/L處理三55g/L10g/L處理四

7、510g/L5g/L224 淀粉酶的初步提純及酶活性的測定2.2.4.1 淀粉酶的初步提純：收集發(fā)酵液，3000r/min離心10min，去除菌體，在上清液中加入65飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4鹽析2h，然后5000r/min離心20min，得到初步純化的淀粉酶。2.2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和酶活性的測定：將可溶性淀粉稀釋成0.2、0.5、1、1.5和2的稀釋液，按下表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和酶活性的測定。管號(hào)12345671727374淀粉稀釋液/mL2（0）2（0.2）2（0.5）2（1）2（1.5）2（2）2（2）2（2）2（2）2（2）緩沖液/mL111111111140水浴保

8、溫5min蒸餾水/mL1111110000粗酶液/mL000000111140水浴保溫30min，然后加入0.5mol/L乙酸10 mL，混均吸取反應(yīng)液1 mL碘液/mL10101010101010101010A660（平均值）（71、72、73、74中加入的粗酶液，即為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中處理一、處理二、處理三、處理四所得的淀粉酶液）注：前6組的數(shù)據(jù)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以淀粉濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線；后4組的數(shù)據(jù)用于酶活性的測定：測得吸光度后，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的淀粉濃度，求出被消耗的淀粉量，這里的酶活即為每毫升粗酶液于40，PH6.0的條件下，每小時(shí)液化可溶性淀粉的毫克數(shù)【m

9、g可溶性淀粉/mL·h】。3、 結(jié)果與分析3. 1 菌落的形態(tài)特征菌落在以淀粉為唯一碳源的分離培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)48 h形成白色圓形菌落，菌落背面乳白色，邊緣不光滑，形態(tài)規(guī)則，質(zhì)地較密，有透明圈，無沉淀。3. 2 計(jì)算D/d值321 分離篩選時(shí)，大部分菌落水解圈都粘連在一起，無法準(zhǔn)確測得D/d值，只得到少部分?jǐn)?shù)據(jù):單菌落透明圈直徑/mm(D)菌落直徑/mm(d)D/d4.03.01.314.07.12.0表A 透明圈直徑和菌落直徑及比值 分析：無法準(zhǔn)確測得D/d值，可能是所采土樣中產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌含量較多，涂平板之前稀釋倍數(shù)不夠?qū)е聠尉溥^于密集，水解圈粘連；也可能是實(shí)驗(yàn)操作不當(dāng)所致。

10、322 紫外誘變后，得到單菌落的透明圈直徑和菌落直徑及比值：單菌落透明圈直徑/mm(D)菌落直徑/mm(d)D/d4.83.01.66.45.51.214.87.42.016.04.93.311.84.52.69.84.02.525.05.05.08.84.02.214.07.81.8分析：通過結(jié)果，可看出經(jīng)過紫外誘變后，有的菌株產(chǎn)酶活能力有所提高，有的減小，篩選產(chǎn)酶活能力最高的菌株，保存供后續(xù)試驗(yàn)使用。我們挑號(hào)菌，將其保存到斜面培養(yǎng)基上供后續(xù)試驗(yàn)使用。3. 3 計(jì)算菌株紫外誘變的致死率對菌株分別用紫外線處理，得到下表：誘變時(shí)間/min菌落數(shù)/個(gè)致死率(平均值)09800210-130663.

11、310-2414410-112482.310-2223610-12596.710-240810-1599.310-291 00100由此數(shù)據(jù)，可作出紫外線誘變的致死曲線分析：由圖可知，淀粉酶菌株對紫外線比較敏感，而且致死率與誘變劑劑量存在正相關(guān)。當(dāng)紫外線照射時(shí)間為6min時(shí)，致死率為96.7，進(jìn)一步提高照射時(shí)間，則致死率隨之上升，當(dāng)照射10min時(shí)，致死率為100 。一般認(rèn)為，進(jìn)行紫外誘變時(shí)，致死率為95左右時(shí)突變效果最好 。因此，紫外線誘變的最適劑量為6min。3. 4 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化341 培養(yǎng)基初始pH值和裝液量對產(chǎn)酶的影響： 編號(hào)處理項(xiàng)1號(hào)2號(hào)3號(hào)PH579裝液量304050A66

12、010-1無無無10-2無無無分析：未得到數(shù)據(jù)的原因有三點(diǎn)：操作不當(dāng)，可能是取液過程中加錯(cuò)體積，也可能是將試管序號(hào)弄混了；將發(fā)酵液從搖床取出的過程中有少量溢出，導(dǎo)致濃度降低，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；發(fā)酵過程中有雜菌產(chǎn)生，發(fā)酵液被污染了。342 培養(yǎng)基碳源對產(chǎn)酶的影響： 處理 結(jié)果可溶性淀粉葡萄糖蔗糖A66010-100110969064510-2016412681204分析：由上表數(shù)據(jù)可知，培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖時(shí)酶活性最大。從而得出結(jié)論：三種碳源中最佳碳源是葡萄糖。343 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分析：標(biāo)準(zhǔn)曲線的精確度不高，原因主要有三點(diǎn)：淀粉濃度為0.5%時(shí)，A660明顯偏高，可能是稀釋淀粉的時(shí)候操作不當(dāng)所致

13、；在測酶活時(shí)，還未等到分光光度計(jì)穩(wěn)定就開始讀數(shù)，造成測量結(jié)果有誤差；由于操作失誤，忘記每個(gè)試管做平行測量，造成測量結(jié)果不精確。344 正交試驗(yàn)酶活力的測定試管編號(hào)1（對照）71727374A66000.0040.0470.0190.063酶消耗的淀粉濃度（%）01.9991.9301.9531.975酶活力（mg /mL·h）039.9838.6039.0639.50表1 試驗(yàn)號(hào)因素酶活力（mg /mL·h）ABC111139.98212238.60321239.06422139.50表2 試驗(yàn)結(jié)果分析分析：對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，可知最佳培養(yǎng)基配方為A1B1C1，即接

14、種量3%、淀粉含量5g/L、蛋白胨含量5g/L。3. 5 淀粉酶的初步提純正交試驗(yàn)得到酶液分別加入65飽和度的硫酸銨，待硫酸銨充分溶解后于4鹽析2h，然后5000r/min離心20min，去除上清液，再加水稀釋測酶活。試管編號(hào)1（對照）71727374A66000.0150.0970.0490.033酶消耗的淀粉濃度（%）01.9811.8491.9261.952酶活力（mg /mL·h）039.6236.9838.5239.04表3 分析：實(shí)驗(yàn)的目的旨在掌握初步純化淀粉酶的方法和進(jìn)一步掌握分光光度法測液化型淀粉酶活力的基本原理和方法。表3 A660和表1相比，71、72、73均比表

15、1大，74卻比表1小，可能是加水稀釋時(shí)混合不均勻所致。4、 討論本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案具有一定的理論依據(jù)，如果操作得當(dāng)，各方面條件滿足，會(huì)得到產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌高產(chǎn)菌株，及該菌株的最佳搖瓶發(fā)酵條件。但操作過程存在很多缺陷，主要問題有：分離篩選淀粉酶菌株時(shí)，稀釋度不夠?qū)е滤馊φ尺B；在進(jìn)行pH值和裝液量對產(chǎn)酶影響的實(shí)驗(yàn)過程中，取液操作不當(dāng)，將試管序號(hào)都弄混了；發(fā)酵過程中有雜菌產(chǎn)生，發(fā)酵液被污染；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，由于操作失誤，忘記每個(gè)試管做平行測量，造成測量結(jié)果不精確；在測酶活時(shí)，還未等到分光光度計(jì)穩(wěn)定就開始讀數(shù)，造成測量結(jié)果有誤差；由于考慮到時(shí)間的限制，實(shí)驗(yàn)過程中分離時(shí)的復(fù)篩及突變后的復(fù)篩都沒做，若要得到精確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)該操作完善。此外，紫外線誘變育種簡便易行、對條件和設(shè)備要求較低并能較好地提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，故在微生物育種中仍廣泛應(yīng)用 。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)紫外線誘變存在很大的不確定性，為使誘變效率提高，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)對菌株進(jìn)行基因操作和定向改造，會(huì)使菌株選育朝著快捷、高效的方向發(fā)展。以上幾點(diǎn)可以作為今后該實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的幾點(diǎn)建議，及操作過程中應(yīng)注意的問題。附錄（一）、培養(yǎng)基的配制1、淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH 7.22、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，蒸餾水