分子克隆——主要步驟

1、筆記3 （分子克隆2要步驟）創(chuàng)作：歐陽(yáng)總時(shí)間:2021.02. 13分子克隆可以分為以下幾個(gè)步驟（1）帶有目的基因的DNA片段的獲得（2） 重組DNA分子的構(gòu)建（3） 重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選（4） 特定重組克隆的鑒別分離制備待克隆的DNA片段將靶DNA片段與載體在體外進(jìn)行連接重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞篩選、鑒定陽(yáng)性重組子重組子的擴(kuò)增。7?帶有目的基因的DNA片段的獲得：可以用扛£上£dna,再配合使用其他實(shí)驗(yàn)手段得到待定的DNA片段，可以用組成的DNA片段，可以應(yīng)mRNA做模板，用反律介成互補(bǔ)DNA,即cDNA,也可以應(yīng)化學(xué)合 成的方法玄接合成一段DNA o2

2、?重組DNA分子的構(gòu)建：重組DNA分子中包括兩部分， 一部分是外源DNA,即 目 的DNA片段，另一部分是載體DNA。用作載體的，有質(zhì) 粒、 噬菌體或病毒DNA。它們的基本特征是能夠獨(dú)立復(fù)制。如果用同一種限制性?xún)?nèi)切酶切割這兩種 DNA,則它們的末端完全相 同，由于有互補(bǔ)的單鏈末端序列存在，在連接酶的作用下，就可以形成重組DNA分子。在沒(méi)有互補(bǔ)單鏈末端的情況下， 也可以用酶學(xué)方法造成一個(gè)互補(bǔ)單鏈末端之后再進(jìn)行連接。3?重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選：重組DNA分子必須進(jìn)入宿主細(xì)胞中，才能得到擴(kuò)增和表達(dá).這個(gè)過(guò)程叫做 轉(zhuǎn)化。大腸桿菌是目前使用最廣泛的 宿主細(xì) 胞。除此以外.其他細(xì)菌、酵母、哺

3、乳動(dòng)物細(xì)胞等也可作為宿主細(xì)胞，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要加以選擇。在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，不同的單個(gè)細(xì)胞（在平板上表現(xiàn)為單個(gè)菌落，亦稱(chēng)克?。┲锌赡芎胁煌闹亟M質(zhì)?；蚍侵亟M質(zhì)粒，因此必須進(jìn)行篩選，以便確定哪些是重組克隆。篩選可以使用抗菌素抗性或其他方法，依載體的性質(zhì)而定。4 ?特定重組克隆的鑒別: 由于重組克隆往往是較多的，而在某一克隆實(shí)驗(yàn)中,們感興趣的目的克隆只有一個(gè)或幾個(gè)，所以需要進(jìn)一步鑒別。使用的方法匚要仃 核酸雜交法和免疫化學(xué)法。1I，找出了目的克隆之后，還需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的，進(jìn)一步弄清目的克隆中外源 DNA片段上的基因的結(jié)構(gòu)和功育匕主要有酶切圖譜的制定，基因在DNA片段上的精確定位，確定是否有內(nèi)含子，DNA序列分析，離體