原核誘導(dǎo)表達(dá)

1、 原核誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）一目的：使本實(shí)驗(yàn)室工作人員了解誘導(dǎo)表達(dá)的操作過程，并能實(shí)際動(dòng)手進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)一系列實(shí)驗(yàn)。二適用范圍：本SOP適用于對新基因克隆的表達(dá)，并針對新基因產(chǎn)生的可溶性蛋白。三實(shí)驗(yàn)原理： E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)代謝物基因激活蛋白（CAP）結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)

2、基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá) 。在沒有乳糖存在時(shí)，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，I序列在PI啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子即可被誘導(dǎo)。在這個(gè)操縱子體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)b半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。四、試劑準(zhǔn)備:（一）實(shí)驗(yàn)器材的滅菌：槍頭的滅菌：1mL，200µL，20µL的槍頭

3、放入槍頭盒，用報(bào)紙包?。?層），放入高壓滅菌鍋中滅菌，121，20min。80烘箱中烘干，常溫放置。 螺口管及離心管的滅菌：將螺口管和離心管分別放入鋁制飯盒中（蓋子要擰松，離心管的管蓋打開），放入高壓滅菌鍋中滅菌，121，20min。80烘箱中烘干，常溫放置。50mL離心管的滅菌：將50mL離心管用報(bào)紙包住（2層），放入高壓滅菌鍋中滅菌，121，20min。80烘箱中烘干，常溫放置。（二）LB培養(yǎng)基的配制 液體LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨 10g 氯化鈉 10g 酵母提取物 5g 調(diào)PH值到7.5，高壓滅菌，4保存。 固體LB培養(yǎng)基（1L）：蛋白胨 10g 氯化鈉 10g 酵母提取物 5g 瓊脂

4、粉 15g 高壓滅菌，不燙手的情況下加入抗性，抗性：培養(yǎng)基=1：1000（氨芐，卡那通常濃度），混勻。馬上在無菌操作臺(tái)中倒平板，并開大風(fēng)吹干。用封口膜封住，倒置放于4保存。（三）1M IPTG的配制：經(jīng)過計(jì)算，10g IPTG可以配42ml的1M IPTG。買來的粉末狀的IPTG一般全部配成1M IPTG。1、無菌操作臺(tái)紫外線照射，后通風(fēng)。2、用少量去離子水將IPTG溶解完全，并定容。3、在無菌操作臺(tái)中，用0.22µm的濾器將配好的IPTG濾入滅菌后的1.5ml離心管中，過濾除菌，-20保存。注意事項(xiàng)：在用濾器將IPTG濾入離心管時(shí)，先用針頭吸IPTG，然后將槍頭拔掉，排出氣體，濾頭

5、加入IPTG液，在使針管與濾器相連，保證整個(gè)裝置無氣體進(jìn)入。濾的過程中，手不能碰濾頭。（四）3×SDS-PAGE loading buffer的配制：3×SDS-PAGE loading buffer10ml 1M Tris-Hcl (PH 6.8)1.5mlSDS0.6gBPB(溴酚藍(lán))30mg甘油（丙三醇）3ml去離子水5.5ml1將除BPB以外的藥品完全溶解。SDS常溫下很難溶解，可以在37水浴溶解。完全溶解后，再加入BPB，進(jìn)行溶解。2把溶好的buffer分裝到1.5ml的離心管中，1ml/管，常溫放置。3使用前，每管加入30µL巰基乙醇。注意事項(xiàng)：巰基乙

6、醇為危險(xiǎn)品，加入的過程在通風(fēng)櫥中完成，并且?guī)Ш檬痔?。（五?0×PBS的配制：0.1M PBS（10×PBS）1LNaH2PO4.2H2O2.83gNacl85gNa2HPO4.12H2O28.98g用去離子水將以上藥品進(jìn)行溶解。（溶解的非常慢，可能需要過夜）調(diào)PH值到7.2，用0.4µm的濾膜過濾。常溫保存。工作時(shí)用的是1×PBS。（六）1.5M Tris-Hcl (PH 8.8) 的配制：1.5M Tris-Hcl250mlTris45.425g 1 用200ml去離子水將Tris溶解。2用濃鹽酸調(diào)PH值到8.8。3調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到2

7、50ml。40.4µm的濾膜過濾，常溫保存。注意事項(xiàng)：Tris的緩沖能力很強(qiáng)，調(diào)PH值時(shí)，費(fèi)些時(shí)間，但不要調(diào)過。（七）1M Tris-Hcl (PH 6.8) 的配制：1M Tris-Hcl250mlTris30.275g 1用200ml去離子水將Tris溶解。2用濃鹽酸調(diào)PH值到6.83調(diào)好PH的Tris-Hcl定容到250ml。40.4µm的濾膜過濾，常溫保存。（八）30%丙烯酰胺的配制：30%丙烯酰胺250ml丙烯酰胺72.5 mlBIS甲叉丙烯酰胺2.5 ml1把藥品用去離子水溶解后定容到250ml。2用濾紙過濾，放在棕色瓶子中，4保存。注意事項(xiàng)：兩種藥品有毒性，配

8、制過程要帶手套和口罩。（九）10%SDS的配制：11g SDS加入10ml去離子水進(jìn)行溶解。2分裝到1.5ml離心管中，-20保存。（十）10%過硫酸銨的配制：11g 過硫酸銨加入10ml去離子水進(jìn)行溶解。2分裝到1.5ml離心管中，-20保存。（十一）5×SDS-PAGE電泳緩沖液的配制：5×SDS-PAGE電泳緩沖液1LTris15.1gGlycine（甘氨酸）94gSDS5g將以上藥品用去離子水溶解后定容到1L，常溫保存。工作時(shí)用的是1×SDS-PAGE電泳緩沖液。（十二）考馬斯亮藍(lán)R-250染色液的配制：考馬斯亮藍(lán)R-250染色液 1L 1 往1g考馬斯亮

9、藍(lán)R-250中加入250ml異丙醇，在磁力攪拌器上攪拌六小時(shí)以上。2 加入650ml去離子水，磁力攪拌器攪拌過夜。3 再加入100ml冰醋酸進(jìn)行溶解，磁力攪拌器攪拌。4 在通風(fēng)櫥內(nèi)用濾紙進(jìn)行過濾。常溫保存。染色液只能反復(fù)用兩次。注意事項(xiàng)：在磁力攪拌器上攪拌時(shí)，要把容器封口。（十三）脫色液的配制：脫色液1L醋酸（冰乙酸）100ml乙醇（無水乙醇）50ml去離子水850ml常溫保存。四實(shí)驗(yàn)步驟： （一）：質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 1使用無菌操作臺(tái)之前先用75%的酒精擦拭，然后將滅菌的培養(yǎng)基以及所有要用到的器具放到超凈臺(tái)上，在開紫外照射30min左右。操作之前，關(guān)掉紫外，打開通風(fēng)櫥，將手用酒精擦拭后開始操作。2從

10、-80的冰箱中取出表達(dá)菌（BL21）的感受態(tài)細(xì)胞（每管100µL），在-80冰水中融化。3載體（PET32a等）與基因片段的連接后質(zhì)粒1µL，緩慢的加入到100µL BL21感受態(tài)中，冰置15min。（無菌操作）342下熱激90s，隨后在冰水中冰置5min。4涂板：先將涂布棒用酒精棉球擦，然后用酒精燈火焰燒，放置等它涼卻。把處理后的感受態(tài)點(diǎn)在含有抗性的固體培養(yǎng)基（氨芐或卡那等）上。用冷卻的涂布棒進(jìn)行涂布，左手把該蓋拿起，小指輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)基，右手來涂，涂到培養(yǎng)基表面快干。（無菌操作）5放在37培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)過夜。注意事項(xiàng)：1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)，質(zhì)粒是凍在-20的冰箱中

11、，等它完全化了在進(jìn)行吸取，往感受態(tài)中加入質(zhì)粒時(shí)，一定要緩慢，因?yàn)楦惺軕B(tài)非常脆弱，防止感受態(tài)受傷。2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)，熱激的時(shí)間90s，一定要控制好時(shí)間。3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化時(shí)，涂布棒在涂布前，一定要晾涼涂布棒。防止感受態(tài)被燙死，或固體培養(yǎng)基的損壞。（二）：挑菌與接菌：1無菌操作臺(tái)紫外線照射，后通風(fēng)。將轉(zhuǎn)化后的平板取出。2在無菌操作臺(tái)中，把消毒后的螺口管（一般一個(gè)基因取四個(gè)螺口管，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)）取出，在酒精燈的外焰上灼燒螺口管管口。3滅菌后的LB培養(yǎng)基從冰箱中取出，在酒精燈的外焰上燒一下培養(yǎng)基瓶口。吸取LB培養(yǎng)基（一般5.5mL）加入螺口管中，后加入抗性（氨芐霉素、卡那等）。氨芐霉素（卡那）：LB培養(yǎng)基=1

12、:1000（5.5µL），抗性由載體決定。4鑷子用酒精棉球擦拭，并在酒精燈的外焰上灼燒，將鑷子晾涼。用晾涼的鑷子，夾取20µL小槍頭，在轉(zhuǎn)化后的平板上挑取單菌落，扔到培養(yǎng)基中。5接好菌的螺口管，進(jìn)行搖菌。37，180rpm。搖到菌的對數(shù)期（OD600值0.4-0.6），時(shí)間大概2-3h。可以模糊看到手即可。（注意不要搖過）6用完的平板用封口膜封住，倒置放于4保存。7若直接用菌液進(jìn)行接菌，接菌比例為，菌液：LB培養(yǎng)基=1：100。注意事項(xiàng)：1 接菌吸培養(yǎng)基時(shí)，把放置培養(yǎng)基的三角瓶傾斜才吸取培養(yǎng)基，移液槍盡量不要插進(jìn)三角瓶中。2接菌時(shí)一定要加入抗性，挑菌落時(shí)，要挑單個(gè)的菌落，且

13、不要把培養(yǎng)基也扣起來。3搖菌不要過了它的對數(shù)期，2小時(shí)后隨時(shí)注意其生長狀態(tài)。（三）小量保菌：1無菌操作臺(tái)紫外線照射，后通風(fēng)。2將搖到標(biāo)準(zhǔn)OD值的菌液進(jìn)行小量保菌，先在酒精燈的外焰上灼燒螺口管管口。3保菌：從滅菌的飯盒中取出4個(gè)1.5ml的滅菌的離心管，加入50µL的滅菌后的80%的甘油，并分別加入相應(yīng)的350µL菌液。一個(gè)基因的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)菌都要進(jìn)行保菌。（若不保菌，實(shí)驗(yàn)不能進(jìn)行重復(fù)，只能從頭做）4標(biāo)清保菌的類別，名稱，時(shí)間，如“BL21 PET32a VAV 1號(hào)2010.7.14”,其中的1號(hào)是平行對照中它排幾號(hào)。5混勻，-20保存。注意事項(xiàng)：1在小量保菌中，一個(gè)基因的

14、四個(gè)平行對照都要保菌，否則得重新摸條件。2在小量保菌中，菌液與甘油一定要混勻在保存，否則菌會(huì)被凍死。（四）蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索1無菌操作臺(tái)紫外線照射，后通風(fēng)。2小量保菌后的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，分別加入不同終濃度的IPTG，在不同的溫度條件下進(jìn)行誘導(dǎo)（如下圖）：對照編號(hào)IPTG終濃度誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)溫度1號(hào)1 mmol/L3h372號(hào)0.1 mmol/L3h373號(hào)1 mmol/L3h304號(hào)0.1 mmol/L3h30（五）小量收菌1將誘導(dǎo)完成的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液，分別取出1mL，對應(yīng)裝于4個(gè)不同的1.5ml離心管中并做好標(biāo)記。剩余的平行實(shí)驗(yàn)組菌液放入4保存。2離心7000rpm，2min，使菌沉淀。

15、3把上層培養(yǎng)基倒掉，用1ml 1×PBS把表達(dá)菌重懸，再次離心7000rpm，2min，使菌沉淀。4把上層1×PBS倒掉，再次離心同步驟3。5用80µL 1×PBS把表達(dá)菌體重懸。6在四個(gè)平行的重懸液中，分別加入80µL 3×SDS-PAGE loading buffer。（把3×SDS-PAGE loading buffer當(dāng)成2×SDS-PAGE loading buffer用）7煮樣8min。（打開鍋蓋煮）8離心13000rpm,10min。吸上清。9進(jìn)行SDS-PAGE電泳。注意事項(xiàng)：在煮樣時(shí)要打開鍋蓋煮，

16、防止小樣進(jìn)水，若樣進(jìn)水，則不能再用。（六）SDS-PAGE膠的配制1分離膠的配制（1）找出配套的膠板，用擦鏡紙擦干凈，并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏。（2）若膠板不漏水，就進(jìn)行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中（如下圖），混勻。（1mm的膠板，一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%，但濃度也要視情況而定。蛋白越小，膠的濃度越大。）（3）將膠板中的水倒掉，并用濾紙吸干水分（不要將濾紙塞到膠板底部）。（4）小燒杯中再加入TEMED，混勻。（TEMED可使膠凝固，所以最后加）（5）灌膠：混勻

17、的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下，防止產(chǎn)生氣泡。（6）用水將分離膠壓平。（用水灌滿，同時(shí)加水時(shí)要緩慢加入，防止把膠吹起）2濃縮膠的配制（1）待分離膠與水中間形成明顯的橫線，即分離膠凝固。隨后進(jìn)行濃縮膠的配制，依次將水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%過硫酸銨加到干凈的小燒杯中（如下圖）(2) 將分離膠上層的水倒掉，并用濾紙吸干水分。（盡量不要把濾紙插入）（3）小燒杯中再加入TEMED，混勻。 （4）灌膠。然后插入梳子。 （5）把制膠器倒過來，膠仍然不會(huì)往外流，或可以明顯看出梳子中兩個(gè)齒之間的膠面明顯凹下去，說明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內(nèi)，并

18、在電泳槽內(nèi)加入SDS-PAGE電泳緩沖液，把膠浸泡一段時(shí)間，時(shí)間越長越好。（防止梳子與膠相連，或膠因濕度不夠而萎縮）（6）點(diǎn)樣時(shí)，再把梳子拔出來，拔時(shí)動(dòng)作要輕，防止膠齒被拔斷。（七）未誘導(dǎo)和空載的制備在誘導(dǎo)表達(dá)中，有兩個(gè)重要的對照組，即空載誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)。1未誘導(dǎo)的制備（1）未誘導(dǎo)是我們所做一個(gè)基因除了四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)外，再做的一個(gè)對照組菌，唯一不同的是它不進(jìn)行誘導(dǎo)（接菌步驟如上），在37下，進(jìn)行搖菌，不加IPTG，搖起來即可。（和表達(dá)完的菌濃度差不多即可）（2）未誘導(dǎo)的菌進(jìn)行小量處理，見上面的小量收菌。2空載誘導(dǎo)的制備（1）空載的轉(zhuǎn)化：將不連基因片段的空載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌（和前面的試驗(yàn)用一個(gè)表達(dá)

19、菌），如“BL21-PET32a-VAV質(zhì)?！鞭D(zhuǎn)入“BL21表達(dá)菌”，其空載應(yīng)當(dāng)是“BL21-PET32a”轉(zhuǎn)入“BL21表達(dá)菌”。轉(zhuǎn)化步驟同上。（2）空載接一個(gè)菌（實(shí)驗(yàn)組），并搖菌搖到對數(shù)期（步驟同上）。（3）空載的誘導(dǎo)： 空載的誘導(dǎo)條件固定為溫度37，時(shí)間3h. ，IPTG終濃度為1mmol/L。（誘導(dǎo)步驟如上）。（4）空載的菌進(jìn)行小量處理，見上面的小量收菌。（八）蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件摸索的SDS-PAGE電泳1拔掉SDS膠上的梳子，并用小針調(diào)整齒的位置（使它們都平行）。2點(diǎn)樣。用20µL的小槍頭，吸煮過的樣品10µL，對準(zhǔn)膠孔點(diǎn)樣，注意不要把樣品點(diǎn)在外面。我們用的mark

20、er是低分子量蛋白marker。一般的點(diǎn)樣順序是：1234567空載未誘導(dǎo)樣品1號(hào)樣品2號(hào)樣品3號(hào)樣品4號(hào)marker3開始電泳，電泳儀正負(fù)極接好，打開電源。濃縮膠：電壓 low 100V分離膠：電壓 high 150V。4卸膠染色。等膠內(nèi)的所有的藍(lán)色都跑出去，電泳停止，一般時(shí)間為1小時(shí)45分。把膠板從電泳儀上卸下，用刀片把膠板撬開，膠的濃縮膠部分割除，放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中進(jìn)行常溫過夜染色。5脫色。將過夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進(jìn)行脫色，直到背景發(fā)白。（九）四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液的選擇1將脫好的膠拿出進(jìn)行觀察，看四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液是否進(jìn)行了蛋白表達(dá)。一般來說，未誘導(dǎo)沒有過量

21、的蛋白表達(dá)，而空載有一處蛋白的過量表達(dá)（大小由表達(dá)載體決定），四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組也有一處蛋白的過量表達(dá)，它比空載表達(dá)的蛋白要大，大出的那一部分即我們的目的蛋白。2若平行實(shí)驗(yàn)組中無過量蛋白表達(dá)，尤其是37，1mmol/L，3h無過量蛋白表達(dá)，則說明蛋白無表達(dá)。3若平行實(shí)驗(yàn)組中有過量蛋白表達(dá)，但它的大小與空載的大小相同。這說明蛋白進(jìn)行了漏表達(dá)。4若蛋白表達(dá)正常，則選擇誘導(dǎo)溫度最低，IPTG濃度最低的實(shí)驗(yàn)組（30，0.1 mmol/L，3h），進(jìn)行下面的小量超聲實(shí)驗(yàn)。（十）表達(dá)菌的小量超聲實(shí)驗(yàn)1把以上做的四個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組菌液從4中拿出。2將最有條件的實(shí)驗(yàn)菌全部收集在1.5ml的小離心管中。（其他平行實(shí)驗(yàn)組

22、的菌進(jìn)行滅菌）3離心7000rpm，2min，使菌沉淀。4把上層培養(yǎng)基倒掉，用1ml 1×PBS把表達(dá)菌重懸，再次離心7000rpm，2min，使菌沉淀。5把上層1×PBS倒掉，再次離心同步驟3。6用500µL 1×PBS把表達(dá)菌重懸。7將菌液放入小玻璃管中，準(zhǔn)備進(jìn)行超聲。8將超聲儀打開預(yù)熱20min，并準(zhǔn)備冰盒。9將呈菌液的小玻璃管放入冰盒進(jìn)行超聲，超聲效率為3050HZ，超聲3s，停5s。直到菌液超澄清（透明呈現(xiàn)雞蛋清色）。 10將超開的菌液進(jìn)行離心，13000rpm，10min。11離心產(chǎn)物上清取出100µL，加入100µL3&

23、#215;SDS-PAGE loading buffer。12上清倒掉，沉淀用1ml 1×PBS把表達(dá)菌重懸，再次離心13000rpm，10min。13重復(fù)11步。14上清倒掉，用100µL將沉淀懸起，加入100µL3×SDS-PAGE loading buffer。15上清和沉淀都進(jìn)行煮樣，開鍋蓋，8min。16離心13000rpm,10min。吸上清。17進(jìn)行SDS電泳。注意事項(xiàng)：1小樣超聲時(shí)，要超徹底，一般超45分鐘即澄清。若仍然不澄清，則可能是包涵體。超的過程中不要超糊。2在洗超聲離心物的沉淀時(shí)，要洗干凈。（十一）破菌超聲的SDS-PAGE電泳1

24、配膠、點(diǎn)樣、電泳的步驟如上。破菌超聲的點(diǎn)樣順序一般為：123456marker未誘導(dǎo)空載全菌破菌上清破菌沉淀未誘導(dǎo)，空載，全菌為摸索表達(dá)條件時(shí)所用的樣品。注：我們破的幾號(hào)菌，就上幾號(hào)的全菌樣。2若破菌上清表達(dá)的蛋白與全菌的蛋白分子量一致（目的蛋白），且破菌沉淀中沒有，這說明蛋白可溶；若破菌沉淀中有目的蛋白，而破菌上清中沒有，說明蛋白為包涵體。（十二）目的蛋白的大量表達(dá)（1L）1配制培養(yǎng)基1L，每大瓶500ml，高壓滅菌4保存。2一級接菌：摸索完條件的表達(dá)菌進(jìn)行接菌3管，每管5ml?？剐裕号囵B(yǎng)基=1:1000,菌液：培養(yǎng)基=1:100。（菌液為針對可溶條件的小量保菌液）步驟如上。37，120rp

25、m，過夜搖菌。3標(biāo)準(zhǔn)保菌：100µL滅菌甘油加入700µL過夜菌?；靹颍?20保存。（寫好名稱日期，如上，放入表達(dá)菌的庫中）3二級接菌：對大瓶進(jìn)行接菌，抗性：培養(yǎng)基=1:1000，菌液：培養(yǎng)基=1:100。即每瓶5ml。4搖菌：37，180rpm，搖到對數(shù)期，搖到菌的對數(shù)期（OD600值0.4-0.6），時(shí)間大概2-3h。可以模糊的看到手即可。（注意在搖過程中隨時(shí)觀察狀態(tài)，不要搖過）5誘導(dǎo)：依據(jù)摸索好的條件進(jìn)行誘導(dǎo)。（十三）大量誘導(dǎo)的收菌：150ml離心管滅菌烘干，待用。2找出兩個(gè)50ml離心管，管蓋和管壁上做標(biāo)記，并稱重。36個(gè)50ml離心管（包括稱重的兩個(gè)），倒入菌液（

26、4045ml）。配平，離心7000rpm，10min。4倒掉上清，用1×PBS把菌重懸，離心7000rpm，10min。5重復(fù)4。6倒掉上清，稱菌體的重量。7懸菌。1g菌體加入35ml的純化時(shí)用的上樣緩沖液懸起。-20保存。（十四）大量表達(dá)菌的超聲1把表達(dá)菌從-20拿出，在流水中融化。2把完全融化的表達(dá)菌，放入小燒杯中準(zhǔn)備超聲。3將超聲儀打開預(yù)熱20min，并準(zhǔn)備冰盒。4將呈菌液的小燒杯放入冰盒進(jìn)行超聲，超聲效率為3050HZ，超聲3s，停5s。直到菌液超澄清，呈現(xiàn)雞蛋清色。（一般超20-30min，注意不要吵時(shí)間太長，使菌超糊）5將超開的菌液進(jìn)行離心，13000rpm，10min。

27、6將上清收集在滅菌的50ml離心管中，進(jìn)行純化。五促進(jìn)原核表達(dá)的蛋白可溶的方法：一般來說，人們認(rèn)為包涵體的形成是因?yàn)樾律嚯逆湶荒茉谡_位置形成二硫鍵，二硫鍵錯(cuò)配， 進(jìn)而錯(cuò)誤折疊的結(jié)果。而IPTG濃度越低，溫度越低，一般蛋白的可溶性越大，因?yàn)檫@樣的條件下，可以減慢蛋白的形成，減少蛋白的二硫鍵錯(cuò)配，從而促進(jìn)蛋白的可溶。1使蛋白可溶的條件并不是固定的，一般來說，以上條件就可是蛋白可溶（有時(shí)2/4條件可以把IPTG濃度提的高一點(diǎn)）。但如果仍不可溶的話，可以試一下0.025mmol/L，常溫，過夜誘導(dǎo)。這種條件是IPTG使用量的最小濃度，可以使包涵體部分可溶。2 180rpm搖菌搖對數(shù)時(shí)，不要搖過。對

28、數(shù)期時(shí)，是表達(dá)菌產(chǎn)蛋白的最佳時(shí)期。表達(dá)菌濃度太大，對菌中蛋白的可溶性影響會(huì)很大。所以在搖菌到2h后，一定密切關(guān)注菌的濃度，隨時(shí)用分光光度計(jì)測OD600值。這就意味著在接菌時(shí)，多接一些菌（由實(shí)際情況而定）。3蛋白的可溶與表達(dá)菌也有關(guān)系。菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。堪稱經(jīng)典的BL21 系列 就是lon 和ompT 蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。BL21(DE3)即我們做表達(dá)是常用的表達(dá)菌。真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此

29、，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候，真核基因中的一些密碼子對于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta 2 系列就是更好的選擇 這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的 BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。（已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒）當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時(shí)，可以選擇K-12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB)和glutathione

30、reductase (gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。（卡那霉素敏感）Rosetta-gami 2 則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點(diǎn)，既補(bǔ)充7種稀有密碼子，又能夠促進(jìn)二硫鍵的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）Origami B 是衍生自 lacZY突變的 BL21菌株，這個(gè)突變能根據(jù)IPTG的濃度精確調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。（四環(huán)素敏感）在決定試用這些名字古怪的菌株時(shí)，有幾個(gè)小Tips是要注意的，一個(gè)是不同菌株有時(shí)已經(jīng)攜帶某個(gè)質(zhì)粒或者已經(jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達(dá)

31、質(zhì)粒是否能與之兼容。比如Rosetta 2 已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒，不能再用氯霉素篩選等等。現(xiàn)象可能原因改進(jìn)方案建議菌株無蛋白表達(dá)E. coli 的密碼子偏移性補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA；將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子Rosetta 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami BRosettaBlue出現(xiàn)截短蛋白包涵體二硫鍵形成困難降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B表達(dá)過快，表達(dá)量過高控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化TunerRosetta-gami B蛋白無活性蛋白錯(cuò)誤折疊

32、降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化TunerRosetta-gami B細(xì)胞死亡，生長極困難毒性蛋白更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制pLysS 菌株無克隆生長過高本底表達(dá)更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制pLysS、pLysE 菌株4若實(shí)在不可溶，只能把蛋白截短，這樣可溶性會(huì)明顯增加。六SDS-PAGE的相關(guān)技巧：1SDS-PAGE電泳的原理：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量

33、幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。2SDS-PAGE電泳遇到的相關(guān)問題及解答。（1）配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？ 在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用