幽門螺桿菌ahpC基因的克隆與原核表達(dá)

1、時間：2021年3月29日學(xué)海無涯頁碼：第1頁共6頁幽門螺桿菌ahpC基因的克隆與原核表達(dá)幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp尾一種定植于人類胃黏膜的革蘭染色陰性、螺旋狀、微需氧菌，是慢性胃炎、消化性潰瘍的病原體， 也與胃腺癌及黏膜相關(guān)性淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)1-4o全世界范 圍內(nèi)Hp的感染率超過50%5。Hp是一種對氧敏感的微需氧菌，菌體 內(nèi)還 有多種抗氧化蛋口，其中烷基過氧化氫物還原酶（Ahp）最為豐富，其作用是通過在高氧化環(huán)境中還原有毒的氫化氧化物來實現(xiàn)的。Ahp由ahpC基因編碼，是抗氧化酶家族peroxiredoxins（prxs）的成員之一 。木研究利用基因克隆

2、技術(shù)，將編碼Hp ahpC外膜蛋白的基因經(jīng) PCRT增后，構(gòu)建重組載體，并在 E.coli BL21（DE3盧進(jìn)行表達(dá)和純化，為進(jìn) 一步研究奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1 材料幽門螺桿菌中國分離株 MEL-Hp27簡稱Hp27）及質(zhì)粒pET-30a 由木實驗室培養(yǎng)和保存；柱、大腸桿菌 DH5a BL21 （DE3）tJ自創(chuàng) 生 公司；限制性核酸內(nèi)切酶 Nde I和Xho卜pMD18-T VectorProtein marker T4 DNA1接酶均貝自大連 TaKaR赤司；Taq DNA聚合酶、dNTP DNA marker.細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA電泳膠回收、質(zhì)粒抽提試劑盒購自天根生

3、化科技（北京）有限公司。引物合成由北京 賽百盛生 物工程公司完成，DNA測序由北京三博遠(yuǎn)志生物有限責(zé)任公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 方法1.2.1 Hp基因組DNA的提取刮取經(jīng)3d培養(yǎng)的Hp培養(yǎng)板上的Hp,以12000r/min離心 lmin,取沉淀按細(xì)菌基因組抽提試劑盒操作方法提取Hp DNAo1.2.2 AhpC編碼基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank上公布的Hp ahpC基因序列，利用引物設(shè)計軟 件primer5.0設(shè)計ahpC基因的引物P1和P2。P1的序列為：5'- CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3U 線為 Nde I 酶切位點；P2 的 序歹 U

4、 為：5'-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAATTT3 戈 U 線為 XhoI 酶切位 點°以Hp中國分離株MEL-Hp27基因組DNA為模板，P1和P2為弓I 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94預(yù)變性5min,然后94°C變性30s, 60 °C退火30s, 72 C°延伸60s共循環(huán)35次，最后于72 °C延伸5min。 PCR產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察擴(kuò)增結(jié)果并用凝膠回收 試劑盒回收PCRJT增產(chǎn)物。1.2.3 重組載體的構(gòu)建 回收的PCR產(chǎn)物與pMDl8-T按照載體與插入DNA的摩爾比 為1 : 6的比例混

5、合后，置26連接過夜，體系為PMD18-T載體1 UL、PORT物2UL、雙蒸水2UL、連接液5 U L經(jīng)藍(lán)白斑篩選鑒定的 pMD18T-ahpC和表達(dá)載體 pET-30a用Nde I和Xho I雙酶切，以10g/L 瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行膠回收后，用T4DNA連接酶于22°C進(jìn)行連接，pET-30a片段與插入DNA的摩爾比為1 : (1? 3)。連接后的重組表 達(dá) 載體pET30a-ahpCM經(jīng)Nde I和Xho I雙酶切，以10g/L瓊脂糖凝膠 電泳鑒定。1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化將重組載體pET3Oa-ahpC專化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)構(gòu) 建的重組工程菌涂布含卡那霉素的

6、LB瓊脂培養(yǎng)基，37培養(yǎng)12?16h,挑選單菌落接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，置37O搖床振蕩培養(yǎng)12ho抽提質(zhì)粒，以Nde I和Xho I雙酶切后，10g/L瓊脂 糖凝膠電泳鑒定，DNA堿基序列測定由北京三博志遠(yuǎn)生物有限責(zé)任 公司完成。1.2.5 重組載體在 E.coli中的表達(dá)取經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建成功的重組工程菌接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37O搖床培養(yǎng)至A600達(dá)到0.5時，加入終濃度為 0.3mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，于誘導(dǎo)過程中取樣，同時作空載體菌對照， 采用SDS-PAGlfe泳分析重組AhpC的表達(dá)。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，用UVP 凝膠成像系統(tǒng)分析重組蛋口的相對含量。1.

7、2.6表達(dá)純化rAhpC蛋白將大量誘導(dǎo)的細(xì)菌4C 4000g離心收集細(xì)菌，PBS洗菌1次， 重懸于純水中，-20 C過夜后超聲破碎，12000g離心，收集上清及沉淀。使用離子親和層析柱純化融合蛋白，SDS-PAG由泳檢查蛋白純化效果。2結(jié)果2.1 Hp ahpC編碼基因的擴(kuò)增以Hp中國分離株MEL-Hp27基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，所獲PCR產(chǎn)物以10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，在600bp 附近有單一條帶，片段的大小與預(yù)計相符（圖 l） o2.2 重組載體的酶切鑒定科技論文發(fā)表網(wǎng)站回收幽門螺桿菌QhpC基因的PCR產(chǎn)物，與pMD18-T連接后 轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a受體菌，經(jīng)藍(lán)

8、口斑篩選試驗挑取口色菌斑擴(kuò)增培養(yǎng) 后，提取pMD18T-ahpC質(zhì)粒。經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I雙酶切 切 出約600bp片段，回收后與用同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體 pET-30a連接，獲得陽性重組質(zhì)粒，命名為pET30a-ahpCo重組質(zhì)粒雙酶切鑒定得到1條約594bp的帶，與實驗設(shè)計相一致（圖 2）,第3泳 道出現(xiàn)第3條帶，可能是因為雙酶切時間為10h,酶切時間過長產(chǎn)生 的 非特異條帶，但對實驗結(jié)果無影響。2.3 ahpC基因序列的分析ahpC基因的測序結(jié)果見圖3。ahpC的堿基測序結(jié)果與GenBank己公布的Hp菌株編碼ahpC基因的序列進(jìn)行同源性比對，其 一致性達(dá)99%

9、（ 590方94），其編碼的氨基酸序列同源性為 99%（ 19A198） o 2.4重組載體在E.coli中的表達(dá)及表達(dá)形式鑒定重組質(zhì)粒pET30a-ahpC專化至E.coli BL21 （DE3）中獲得重組工 程菌，接種LB液體培養(yǎng)基，于37°C培養(yǎng)至A600達(dá)到0.5時，力口入終 濃度為0.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h,收集菌體進(jìn)行SDS-PAG檢測?？梢娫贛r 23ku處出現(xiàn)1條新的蛋白帶，與理論預(yù)測值相符（圖4）。2.5 重組表達(dá)蛋口 rAhpC的純化可溶性分析目的蛋口主要以可溶性方式存在。 選取鐮離子親 和層析柱純化蛋白，收集洗脫液，SDS-PAG盅泳檢測洗脫液目的蛋

10、口 的分子大小。經(jīng)UVP凝膠成像系統(tǒng)分析，洗脫所得目的蛋口的分 子 質(zhì)量為23ku （圖5） o3討論科技論文發(fā)表網(wǎng)站大多數(shù)細(xì)胞都具有產(chǎn)生和清除活性氧（ROS的能力。在正常情況 下，活性氧是作為分子氧單電子還原反應(yīng)的不可避免的產(chǎn)物。正常細(xì)胞具有相關(guān)的保護(hù)機(jī)制維持細(xì)胞內(nèi)最低水平的活性氧濃度。而過 氧化氫是一種穩(wěn)定的活性氧分子，能夠穿過細(xì)胞膜并且在多種細(xì)胞 的生理 過程中起著重要的作用，包括蛋白磷酸化、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄因 子的活化、DNA合成和細(xì)胞分裂等過程。高濃度過氧化氫對細(xì)胞具 有毒性，尤其是能夠?qū)?xì)胞組分造成損傷；而適當(dāng)濃度的過氧化氫可 以作為第2信使分子參與信號傳導(dǎo)途徑并調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。而黃單胞菌 中，Ahp和CAT （過氧化氫酶）等共同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的水平， ahpC突變能引起細(xì)胞內(nèi)過氧化氫水平下降7。黃志剛等利用同源重組技術(shù)構(gòu) 建了 Hp27基因敲除突變株（Hp27AcagA），并利用蛋白 質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn) Ahp在cagA基因敲除突變株菌體蛋口中 表達(dá)下降，可能影響Hp的抗氧化應(yīng)急能力。本研究對 編碼Hp小分子外膜蛋白ahpC的基因進(jìn)行克隆，并進(jìn)行序列測定， 所得序列與GenBank公布的序列一致性為99% ;成功構(gòu)建重組表達(dá)載 體pET30a-ahpCg過雙酶切及測序鑒定，結(jié)果與預(yù)測一致；經(jīng)42&#