抗體實(shí)用教案

1、第二節(jié)第二節(jié) 免疫免疫(miny)(miny)球蛋白基因球蛋白基因 免疫球蛋白是具有與抗原決定簇特異性結(jié)合免疫球蛋白是具有與抗原決定簇特異性結(jié)合的大量蛋白分子的總稱，多樣性是免疫球蛋白的重的大量蛋白分子的總稱，多樣性是免疫球蛋白的重要特點(diǎn)。要特點(diǎn)。 抗原的種類極多，免疫球蛋白的多樣性也非抗原的種類極多，免疫球蛋白的多樣性也非常高，數(shù)目可達(dá)百萬以上。而人類常高，數(shù)目可達(dá)百萬以上。而人類(rnli)基因組基因組中的基因總數(shù)不到中的基因總數(shù)不到3萬，與免疫球蛋白的多樣性并不萬，與免疫球蛋白的多樣性并不一致。一致。 免疫球蛋白的多樣性是其基因發(fā)生重排的結(jié)免疫球蛋白的多樣性是其基因發(fā)生重排的結(jié)果。果。第

2、1頁/共51頁第一頁，共52頁。 抗體結(jié)合抗原的特異抗體結(jié)合抗原的特異(ty)性是由重性是由重鏈和輕鏈鏈和輕鏈V區(qū)的氨基酸序列決定的，為了產(chǎn)區(qū)的氨基酸序列決定的，為了產(chǎn)生大量的不同抗體，免疫系統(tǒng)必須產(chǎn)生大量生大量的不同抗體，免疫系統(tǒng)必須產(chǎn)生大量不同的不同的V區(qū)序列。區(qū)序列。 另一方面恒定區(qū)的序列在同一類型的另一方面恒定區(qū)的序列在同一類型的抗體中是相似的，并且對(duì)抗原特異抗體中是相似的，并且對(duì)抗原特異(ty)生生無影響。無影響。 只有淋巴細(xì)胞具有完整的、有功能的只有淋巴細(xì)胞具有完整的、有功能的編碼抗體的基因，這些抗體基因經(jīng)過一系列編碼抗體的基因，這些抗體基因經(jīng)過一系列高度有序的加工才形成功能基因，

3、其他的細(xì)高度有序的加工才形成功能基因，其他的細(xì)胞并沒有這個(gè)過程。胞并沒有這個(gè)過程。第2頁/共51頁第二頁，共52頁。一、免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu) 1.免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)證據(jù) 利根川進(jìn)應(yīng)用分子雜交(zjio)技術(shù)證明并克隆出Ig分子V區(qū)和C區(qū)基因。同時(shí)應(yīng)用克隆cDNA片段為探針，證明了B細(xì)胞在分化發(fā)育過程中編碼Ig基因結(jié)構(gòu)，闡明了Ig抗原結(jié)合部位多樣性的起源，以及遺傳和體細(xì)胞突變?cè)诳贵w多樣性形成中的作用。1987年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第3頁/共51頁第三頁，共52頁。第4頁/共51頁第四頁，共52頁。 編碼人和小鼠輕重鏈的編碼人和小鼠輕重鏈的Ig基因分別位基因分別位于不同的染色體上，總體分為編碼于

4、不同的染色體上，總體分為編碼V區(qū)和區(qū)和C區(qū)區(qū)的兩大部分。的兩大部分。 重鏈的胚系基因中有許多基因片段重鏈的胚系基因中有許多基因片段(gene segment)。 包括包括(boku)：眾多的：眾多的V基因片段基因片段(variable segment)，多個(gè)，多個(gè)D基因片段基因片段(diversity segment)和幾個(gè)和幾個(gè)J基因片段基因片段(joining segment)。第5頁/共51頁第五頁，共52頁。V區(qū)基因(jyn)C區(qū)基因(jyn)V基因(jyn)片斷D基因片斷J基因片斷IgH基因簇：包括V、D、J、C 基因片段?；虼兀?包括V、J、C 基因片段。基因簇： 包括V、J、C

5、 基因片段。免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)免疫球蛋白基因結(jié)構(gòu)胚系基因結(jié)構(gòu)：三個(gè)基因簇，四種基因片段。 人Ig重鏈胚系基因結(jié)構(gòu)第6頁/共51頁第六頁，共52頁。 抗體編碼基因(jyn)的染色體定位 肽鏈 所在染色體 基因(jyn)片段及排列 人 小鼠 22q11.2 16 Vn(JC)n 2 p11-12 6C2 VnJnC H 14q32.3 12F1 VnDnJnCn 抗體(kngt)的胚系基因（germline genes） 重鏈：L,V,D,J,C基因片段 輕鏈： L,V,J,C基因片段第7頁/共51頁第七頁，共52頁。第8頁/共51頁第八頁，共52頁。基因重排：基因重排： 免疫球蛋白胚系基因狀態(tài)下

6、的免疫球蛋白胚系基因狀態(tài)下的V、（、（D）、）、J基因片段成簇存在，要編碼完整的功能性的基因片段成簇存在，要編碼完整的功能性的Ig多肽鏈必須在這些成簇存在的基因簇中選擇某些多肽鏈必須在這些成簇存在的基因簇中選擇某些基因片段進(jìn)行基因片段進(jìn)行(jnxng)重新組合，這一過程稱為重新組合，這一過程稱為基因重排?；蛑嘏拧?在在V、D、J、C基因群中各選擇一個(gè)基因片基因群中各選擇一個(gè)基因片段，組成單個(gè)段，組成單個(gè)Ig的編碼基因，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄和翻譯，的編碼基因，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄和翻譯，產(chǎn)生功能性產(chǎn)生功能性Ig。二、免疫球蛋白基因(jyn)的重排與表達(dá)調(diào)控第9頁/共51頁第九頁，共52頁。1.胚系基因(jyn)2.基

7、因(jyn)重排3. 重排的基因(jyn)4.RNA轉(zhuǎn)錄本5.mRNA剪切6.成熟mRNA7.IgM前體多肽 V1 V2 V3 Vn D1 D2 D3 Dn J1 J2 J3 J4 Cm Cd Cg Ce Ca V1 V2 D2 J3 J4 Cm Cd Cg Ce Ca V1 V2 D2 J3 J4 Cm Cd Cg Ce Ca V2D2J3 J4 Cm Cd V2D2J3 Cm CdJ4 L VH Cm V2 D2 J3 Cm第10頁/共51頁第十頁，共52頁。第11頁/共51頁第十一頁，共52頁。第12頁/共51頁第十二頁，共52頁。三、抗體多樣性的形成1.胚胎細(xì)胞的V-J或V-D-J重排

8、 胚系免疫球蛋白基因在B細(xì)胞發(fā)育分化過程的重排是抗體多樣性的主要(zhyo)來源。第13頁/共51頁第十三頁，共52頁。人人Ig多樣性產(chǎn)生多樣性產(chǎn)生(chnshng)的機(jī)制的機(jī)制多樣性機(jī)制多樣性機(jī)制 H 胚系基因胚系基因(jyn)數(shù)（功能性）數(shù)（功能性） V 65 30 40 D 27 0 0 J 6 4 5組合多樣性組合多樣性 1.1104 1.2102 2102總計(jì)總計(jì) 11000 (120+200)=3106連接多樣性連接多樣性 共共100核苷酸插入核苷酸插入 300 / /體細(xì)胞突變體細(xì)胞突變 + + +第14頁/共51頁第十四頁，共52頁。 Ig多樣性數(shù)目多樣性數(shù)目Ig的的V區(qū)基因組

9、合數(shù)區(qū)基因組合數(shù)3.4106連接多樣性連接多樣性 100核苷酸插入核苷酸插入(ch r)多樣性多樣性 300Ig的多樣性總計(jì)約的多樣性總計(jì)約 1010 1011 第15頁/共51頁第十五頁，共52頁。2.體細(xì)胞突變體細(xì)胞突變 B細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中，胚系免疫球蛋白基因經(jīng)過重排，形成完整細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中，胚系免疫球蛋白基因經(jīng)過重排，形成完整的有功能的基因。的有功能的基因。V區(qū)基因在重排后仍可發(fā)生改變，這種改變是由體細(xì)胞突區(qū)基因在重排后仍可發(fā)生改變，這種改變是由體細(xì)胞突變產(chǎn)生的。變產(chǎn)生的。 體細(xì)胞突變發(fā)生在初次免疫應(yīng)答的后期和再次免疫應(yīng)答。成熟體細(xì)胞突變發(fā)生在初次免疫應(yīng)答的后期和再次免疫應(yīng)答。

10、成熟B細(xì)細(xì)胞在受到抗原刺激后，在生發(fā)中心發(fā)生體細(xì)胞突變。由于免疫球蛋白基因胞在受到抗原刺激后，在生發(fā)中心發(fā)生體細(xì)胞突變。由于免疫球蛋白基因的突變頻率比正常細(xì)胞中其他基因突變的突變頻率比正常細(xì)胞中其他基因突變(j yn t bin)頻率高頻率高106倍，也倍，也稱為體細(xì)胞高頻突變。稱為體細(xì)胞高頻突變。 第16頁/共51頁第十六頁，共52頁。 經(jīng)過類別轉(zhuǎn)換之后(zhhu)抗體的親和力增高（親和力成 熟）。 成熟B細(xì)胞在識(shí)別抗原后分化成為漿細(xì)胞，其中一部分漿細(xì)胞分泌IgM類抗體(kngt)，其余的須進(jìn)行第二次基因重排。 第二次基因重排時(shí)V區(qū)的突變頻率高，稱為體細(xì)胞超突變（高頻突變），并發(fā)生類別轉(zhuǎn)換，

11、使分泌(fnm)抗體的類別由IgM轉(zhuǎn)換成IgG、IgA或IgE。第17頁/共51頁第十七頁，共52頁。 體細(xì)胞突變多發(fā)生在體細(xì)胞突變多發(fā)生在Ig的的CDR區(qū)，體細(xì)胞突變是隨區(qū)，體細(xì)胞突變是隨機(jī)的，突變后的機(jī)的，突變后的B細(xì)胞受抗原選擇，親和力降低的細(xì)胞受抗原選擇，親和力降低的B細(xì)胞克細(xì)胞克隆凋亡，親和力增高的隆凋亡，親和力增高的B細(xì)胞克隆存活。抗原選擇的結(jié)果細(xì)胞克隆存活?？乖x擇的結(jié)果是抗體總體的親和力提高是抗體總體的親和力提高(t go)。這種通過體細(xì)胞突變。這種通過體細(xì)胞突變使抗體親和力普遍提高使抗體親和力普遍提高(t go)的現(xiàn)象稱為親和力成熟。的現(xiàn)象稱為親和力成熟。第18頁/共51頁第

12、十八頁，共52頁。第三節(jié)第三節(jié) 免疫免疫(miny)(miny)球蛋白的合球蛋白的合成與分泌成與分泌 抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，抗體的產(chǎn)生過程即抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，抗體的產(chǎn)生過程即為特異性體液免疫應(yīng)答。分泌抗體的漿細(xì)胞來源于為特異性體液免疫應(yīng)答。分泌抗體的漿細(xì)胞來源于B淋巴淋巴細(xì)胞，抗原只作為淋巴細(xì)胞克隆的選擇因子細(xì)胞，抗原只作為淋巴細(xì)胞克隆的選擇因子(ynz)，刺激，刺激相應(yīng)相應(yīng)B淋巴細(xì)胞分化增殖成為抗體分泌漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。淋巴細(xì)胞分化增殖成為抗體分泌漿細(xì)胞和記憶細(xì)胞。大多數(shù)抗體的產(chǎn)生需要其他細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子大多數(shù)抗體的產(chǎn)生需要其他細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子(ynz)的輔助。的

13、輔助。第19頁/共51頁第十九頁，共52頁。一、體液免疫應(yīng)答與抗體的產(chǎn)生 1.初次應(yīng)答與再次應(yīng)答 抗原初次侵入(qnr)機(jī)體所誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答稱為初次免疫應(yīng)答。 相同抗原再次侵入(qnr)機(jī)體，記憶性免疫細(xì)胞可迅速、高效、特異地產(chǎn)生應(yīng)答，稱為再次免疫應(yīng)答。第20頁/共51頁第二十頁，共52頁。1.1.初次免疫應(yīng)答 潛伏期，對(duì)數(shù)期，平臺(tái)期，下降期 （1 1）潛伏期( (誘導(dǎo)期) )長(zhǎng)( (約7 71010天) ) （2 2）抗體的種類以IgMIgM為主 （3 3）抗體親和力低 （4 4）維持(wich)(wich)時(shí)間短 （5 5）總抗體水平低第21頁/共51頁第二十一頁，共52頁。 2.再

14、次免疫應(yīng)答 （1）潛伏期短（約23天） （2）抗體的種類(zhngli)以IgG為主 （3）抗體親和力比初次應(yīng)答明顯增強(qiáng) （4）維持時(shí)間長(zhǎng) （5）總抗體水平高第22頁/共51頁第二十二頁，共52頁。ABCDE 初 次 與 再 次 體 液 免 疫 應(yīng) 答抗C 抗體(kngt)抗C 抗體(kngt)Bm細(xì)胞(xbo)Bm細(xì)胞血清抗體濃度天 數(shù)針對(duì)抗原 C 的初次體液免疫應(yīng)答針對(duì)抗原 B 的初次應(yīng)答抗原C 免疫抗原C抗原B免疫針對(duì)抗原 C 的再次體液免疫應(yīng)答第23頁/共51頁第二十三頁，共52頁。第24頁/共51頁第二十四頁，共52頁。第25頁/共51頁第二十五頁，共52頁。2.TD和和TI抗原的免

15、疫應(yīng)答抗原的免疫應(yīng)答 胸腺依賴性抗原胸腺依賴性抗原(TD-Ag)： 需要在需要在T細(xì)胞輔助下才能細(xì)胞輔助下才能(cinng)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。大多誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。大多數(shù)天然抗原，由蛋白質(zhì)組成，相數(shù)天然抗原，由蛋白質(zhì)組成，相對(duì)分子量大。能夠引起體液免疫、對(duì)分子量大。能夠引起體液免疫、細(xì)胞免疫；可發(fā)生細(xì)胞免疫；可發(fā)生Ig類轉(zhuǎn)換，產(chǎn)類轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生各類抗體（生各類抗體（IgM, IgG，IgA, IgE）產(chǎn)生抗體以）產(chǎn)生抗體以IgG為主；有為主；有免疫記憶。免疫記憶。 第26頁/共51頁第二十六頁，共52頁。 胸腺非依賴性抗原胸腺非依賴性抗原(TI-Ag)： 不需要不需要T細(xì)胞輔助就能直接誘導(dǎo)細(xì)胞輔助就能直接

16、誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體細(xì)胞產(chǎn)生抗體(kngt)。細(xì)菌脂多糖、。細(xì)菌脂多糖、肺炎球菌莢膜多糖、多聚鞭毛素等。不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫；只產(chǎn)生肺炎球菌莢膜多糖、多聚鞭毛素等。不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫；只產(chǎn)生IgM類抗類抗體體(kngt)，無，無Ig類轉(zhuǎn)換；無免疫記憶。類轉(zhuǎn)換；無免疫記憶。第27頁/共51頁第二十七頁，共52頁。TI抗原刺激抗原刺激B細(xì)胞活化細(xì)胞活化 直接作用直接作用 TD抗原刺激抗原刺激B細(xì)胞活化細(xì)胞活化 需兩種信號(hào)需兩種信號(hào) 第一信號(hào)（抗原刺激信號(hào)）第一信號(hào)（抗原刺激信號(hào)） 第二信號(hào)（第二信號(hào)（Th細(xì)胞信號(hào)）細(xì)胞信號(hào)） Th細(xì)胞細(xì)胞-B細(xì)胞間接觸作用細(xì)胞間接觸作用 Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子細(xì)胞分泌細(xì)胞因

17、子 B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答絕大多數(shù)是由細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答絕大多數(shù)是由TD抗原引起抗原引起(ynq)，B細(xì)胞識(shí)細(xì)胞識(shí)別別TD抗原后的活化和增殖需要特異性抗原后的活化和增殖需要特異性Th細(xì)胞的輔助。細(xì)胞的輔助。第28頁/共51頁第二十八頁，共52頁。第29頁/共51頁第二十九頁，共52頁。 B細(xì)胞和T細(xì)胞分別識(shí)別(shbi)同一抗原分子中兩種不同的抗原表位。 B細(xì)胞的激活需要Th細(xì)胞輔助刺激分子的輔助，而Th細(xì)胞可被B細(xì)胞或其他APC遞呈的抗原與輔助刺激分子激活。 Th細(xì)胞不僅為B細(xì)胞提供第二活化信號(hào)，還分泌多種細(xì)胞因子輔助B細(xì)胞活化。第30頁/共51頁第三十頁，共52頁。3.抗體形成中抗體種類的轉(zhuǎn)

18、換機(jī)制抗體形成中抗體種類的轉(zhuǎn)換機(jī)制 Ig類別轉(zhuǎn)換類別轉(zhuǎn)換: B細(xì)胞在生發(fā)中心細(xì)胞在生發(fā)中心發(fā)育過程中，表達(dá)的發(fā)育過程中，表達(dá)的Ig分子可從分子可從IgM轉(zhuǎn)換為轉(zhuǎn)換為IgG、IgA、IgE，稱為類別轉(zhuǎn)，稱為類別轉(zhuǎn)換。換。 機(jī)制：轉(zhuǎn)換重組，即機(jī)制：轉(zhuǎn)換重組，即VDJ基因基因片段與下游的另一個(gè)片段與下游的另一個(gè)C基因重組?；蛑亟M。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：Ig Fab不變，抗體特異不變，抗體特異性不變。性不變。 意義：意義：Ig Fc的改變的改變(gibin)使抗體效應(yīng)機(jī)制發(fā)生變化，以適應(yīng)消使抗體效應(yīng)機(jī)制發(fā)生變化，以適應(yīng)消滅抗原的需要滅抗原的需要 。 第31頁/共51頁第三十一頁，共52頁。Ig類別轉(zhuǎn)換第32

19、頁/共51頁第三十二頁，共52頁。Ig類轉(zhuǎn)換(zhunhun)第33頁/共51頁第三十三頁，共52頁。4.影響體液免疫應(yīng)答的因素影響體液免疫應(yīng)答的因素 不同種類不同種類(zhngli)的抗原和免疫途徑導(dǎo)致應(yīng)答的方式與特點(diǎn)發(fā)生的抗原和免疫途徑導(dǎo)致應(yīng)答的方式與特點(diǎn)發(fā)生改變，免疫應(yīng)答過程受細(xì)胞因子的調(diào)控，因此，不同種類改變，免疫應(yīng)答過程受細(xì)胞因子的調(diào)控，因此，不同種類(zhngli)細(xì)胞細(xì)胞因子或其相對(duì)比例不同對(duì)因子或其相對(duì)比例不同對(duì)B細(xì)胞的作用也不一樣。細(xì)胞的作用也不一樣。 Th1可以分泌可以分泌IL-2，IFN；可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)；刺激刺激B細(xì)胞發(fā)

20、生類型轉(zhuǎn)換，主要產(chǎn)生細(xì)胞發(fā)生類型轉(zhuǎn)換，主要產(chǎn)生Ig2，調(diào)理，調(diào)理M。 Th2可以分泌可以分泌IL-4,5,10,13，刺激，刺激IgE和和IgG1或或IgG4產(chǎn)生，參與其產(chǎn)生，參與其他細(xì)胞如肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。他細(xì)胞如肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。第34頁/共51頁第三十四頁，共52頁。二、免疫球蛋白的表達(dá)、裝配與分配 1.免疫球蛋白mRNA hnRNA需要polA尾巴和加帽結(jié)構(gòu)，DNA重排后的內(nèi)含子需要在拼接中除去。RNA拼接方式的不同，產(chǎn)生(chnshng)的mRNA也不同。2.膜結(jié)合型和分泌型免疫球蛋白的表達(dá) 第35頁/共51頁第三十五頁，共52頁。第36頁/共

21、51頁第三十六頁，共52頁。第37頁/共51頁第三十七頁，共52頁。Membrane-bound vs. SecretedFigure 2.23第38頁/共51頁第三十八頁，共52頁。Figure 2-18V(D)J recombinationis initiated by the Recombinase Activator Gene Products, RAG1 and RAG2(found only in developing lymphocytes)第39頁/共51頁第三十九頁，共52頁。3.B細(xì)胞發(fā)育與抗體形成細(xì)胞發(fā)育與抗體形成 B細(xì)胞在骨髓內(nèi)產(chǎn)生并成熟，細(xì)胞在骨髓內(nèi)產(chǎn)生并成熟，其成熟

22、過程可分為骨髓內(nèi)和骨髓外其成熟過程可分為骨髓內(nèi)和骨髓外兩個(gè)兩個(gè)(lin )階段。階段。 骨髓內(nèi)成熟過程中不接觸外骨髓內(nèi)成熟過程中不接觸外來抗原，發(fā)生的變化是來抗原，發(fā)生的變化是Ig基因重排、基因重排、膜膜Ig的表達(dá)和具有自身反應(yīng)性受體的表達(dá)和具有自身反應(yīng)性受體的的B細(xì)胞的清除。細(xì)胞的清除。 骨髓內(nèi)成熟骨髓內(nèi)成熟B細(xì)胞離開骨髓進(jìn)細(xì)胞離開骨髓進(jìn)入外周免疫器官并通過血液和淋巴入外周免疫器官并通過血液和淋巴系統(tǒng)在全身淋巴組織中循環(huán)。系統(tǒng)在全身淋巴組織中循環(huán)。第40頁/共51頁第四十頁，共52頁。骨髓干細(xì)胞原B細(xì)胞前B細(xì)胞幼B細(xì)胞膜抗體(kngt) 骨髓-外周循環(huán) 漿細(xì)胞抗體(kngt)成熟B細(xì)胞抗原 記憶B細(xì)胞第41頁/共51頁第四十一頁，共52頁。Bone marrowB cell development第42頁/共51頁第四十二頁，共52頁。輸入(shr)外周B細(xì)胞庫第43頁/共51頁第四十三頁，共52頁。 以上的B細(xì)胞發(fā)育過程發(fā)生在骨髓內(nèi)，不依賴外來抗原。成熟B細(xì)胞若無抗原刺激很快就會(huì)死亡，若一旦被抗原或多克隆刺激劑刺激后成為活化(huhu)B細(xì)胞，發(fā)生增殖和分化，膜表面Ig逐