沙門氏菌檢測

1、沙門氏菌檢測1 設備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設備外，其他設備和材料如下：1.1 冰箱： 2 5。1.2 恒溫培養(yǎng)箱： 36±1， 42±1。1.3 均質器。1.4 振蕩器。1.5 電子天平：感量 0.1g。1.6 無菌錐形瓶 :容量 500ml， 250ml。1.7 無菌吸管： 1ml（具 0.01ml刻度）、 10ml（具 0.1ml刻度）或微量移液器及吸頭。1.8 無菌培養(yǎng)皿：直徑 90mm。1.9 無菌試管： 3mm× 50mm、10mm× 75mm。1.10 無菌毛細管。1.11 pH計或 pH比色管或精密 pH試紙。1.12 全自動微

2、生物生化鑒定系統(tǒng)。2 培養(yǎng)基和試劑2.1 緩沖蛋白胨水（ BPW）：見附錄中 1。2.2 四硫磺酸鈉煌綠（ TTB ）增菌液：見附錄中 2。2.3 亞硒酸鹽胱氨酸（ SC）增菌液：見附錄中 3。2.4 亞硫酸鉍（ BS）瓊脂：見附錄中 4。2.5 HE瓊脂：見附錄中 5。2.6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽（ XLD ）瓊脂：見附錄中6。2.7 沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基。2.8 三糖鐵（ TSI）瓊脂：見附錄中 7。2.9 蛋白胨水、靛基質試劑：見附錄中8。2.10 尿素瓊脂（ pH7.2）：見附錄中 9。2.11 氰化鉀（ KCN ）培養(yǎng)基：見附錄中 10。2.12 賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基：見附錄中11。

3、1/162.13 糖發(fā)酵管：見附錄中 12。2.14 鄰硝基酚 -D 半乳糖苷（ ONPG）培養(yǎng)基：見附錄中 13。2.15 半固體瓊脂：見附錄中 14。2.16 丙二酸鈉培養(yǎng)基：見附錄中15。2.17 沙門氏菌 O和 H診斷血清。2.18 生化鑒定試劑盒。3 操作方法3.1 試驗前準備將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、量筒、吸管（1ml、10ml）、稀釋劑等移至操作室內。準備好足夠用量，避免操作中出入操作間。開啟無菌室紫外殺菌燈和潔凈工作臺的空氣過濾裝置30min。操作人員用肥皂洗手，關閉紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋，用消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿戴好無菌衣、帽、口罩、

4、手套等。操作前先用乙醇棉球擦手、工作臺面，再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌剪刀或鑷子將供試品啟封。3.2 前增菌稱取 25g（ ml）樣品放入盛有 225ml BPW 的無菌均質杯中，以 8000r/min10000r/min均質 1min 2min，或置于盛有 225ml BPW 的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打 1min2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質，振蕩混勻。如需測定pH值，用 1mol/ml 無菌 NaOH或HCl 調pH至6.8 ±0.2。無菌操作將樣品轉至 500ml錐形瓶中，如使用均質袋，可直接進行培養(yǎng)，于36±1培養(yǎng) 8 h

5、18h。如為冷凍產品 ,應在 45以下不超過 15min,或 2 5不超過 18h解凍。3.3 增菌輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物，移取 1ml，轉種于 10ml TTB 內，于 42±1 培養(yǎng) 18 h 24h。同時，另取 1ml，轉種于 10ml SC內，于 36±1培養(yǎng) 18h24h。3.4 分離分別用接種環(huán)取增菌液 1環(huán)，劃線接種于一個 BS瓊脂平板和一個 XLD 瓊脂平板（或 HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于 36±1分別培養(yǎng) 18h24h（ XLD 瓊脂平板、 HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或 40h 48h2/16（ BS瓊脂平板）

6、，觀察各個平板上生長的菌落。各個平板上的菌落特征見表1。表 1 沙門氏菌屬在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征選擇性瓊脂平板沙門氏菌菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色， 菌落周圍培養(yǎng)基可呈黑色或棕色；BS瓊脂有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色；有些菌株為黃色，中心HE 瓊脂黑色或幾乎全黑色。菌落呈粉紅色，帶或不帶黑色中心，有些菌株可呈現(xiàn)大的帶光澤的黑色中XLD 瓊脂心，或呈現(xiàn)全部黑色的菌落；有些菌株為黃色菌落，帶或不帶黑色中心。沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基按照顯色培養(yǎng)基的說明進行判定。3.5 生化試驗自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三

7、糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺；接種針不要滅菌,直接接種賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂平板，于36±1培養(yǎng) 18h24h，必要時可延長至 48h。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內，沙門氏菌屬的反應結果見表2。表 2 沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基內的反應結果三糖鐵瓊脂賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基初步判斷產氣硫化氫斜面底層KA()()可疑沙門氏菌屬KA()()可疑沙門氏菌屬AA()()可疑沙門氏菌屬AA/ 非沙門氏菌KK/ / 非沙門氏菌注： K ：產堿， A ：產酸，：陽性，：陰性；()多數(shù)陽性，少數(shù)陰性；/：陽性或陰性。接種三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基

8、的同時,可直接接種蛋白胨水（供做靛基質試驗）、尿素瓊脂（pH7.2）、氰化鉀（ KCN ）培養(yǎng)基，也可在初步判斷結果后從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落接種。于36±1培養(yǎng) 18h24h，必要時可延長至 48h，按表 3判定結果。將已挑菌落的平板儲存于2 5或室溫至少保留 24h，以備必要時復查。表 3 沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表反應序硫化氫（ H2S）靛基質pH7.2 尿素氰化鉀（ KCN ）賴氨酸脫羧酶號A1A2A3/注：陽性，：陰性，/：陽性或陰性。3/16反應序號 A1：典型反應判定為沙門氏菌屬。如尿素、 KCN 和賴氨酸脫羧酶 3 項中有 1項異常，按表 4可判定為沙門氏菌。如

9、有2項異常為非沙門氏菌。表 4 沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表pH7.2 尿素氰化鉀（ KCN ）賴氨酸脫羧酶判定結果甲型副傷寒沙門氏菌（要求血清學鑒定結果）沙門氏菌IV 或 V （要求符合本群生化特性）沙門氏菌個別變體（要求血清學鑒定結果）注：陽性，：陰性。反應序號 A2：補做甘露醇和山梨醇試驗，沙門氏菌靛基質陽性變體兩項試驗結果均為陽性，但需要結合血清學鑒定結果進行判定。反應序號 A3：補做 ONPG。ONPG 陰性為沙門氏菌，同時賴氨酸脫羧酶陽性。甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。3.5.2.4 必要時按表 5 進行沙門氏菌生化群的鑒別。表 5沙門氏菌屬各生化群的鑒別項 目IIIIII

10、IVVVI衛(wèi)矛醇山梨醇水楊苷ONPG丙二酸鹽KCN注：陽性，：陰性。如選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)的初步判斷結果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙?，使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進行鑒定。3.6 血清學鑒定抗原的準備一般采用 1.2 1.5瓊脂培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2 3）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi 抗原的存在而阻止了 O凝集反應時，可挑取菌苔于1ml生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。H抗原發(fā)育不良時，將菌株接種在0.554/160.65半固體瓊脂平板的

11、中央，俟菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或將菌株通過裝有 0.3 0.4半固體瓊脂的小玻管 1 次 2次，自遠端取菌培養(yǎng)后再檢查。多價菌體抗原（ O）鑒定在玻片上劃出 2個約 1cm×2cm的區(qū)域，挑取 1環(huán)待測菌，各放 1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域上部，在其中一個區(qū)域下部加1滴多價菌體（ O）抗血清，在另一區(qū)域下部加入 1滴生理鹽水，作為對照。再用無菌的接種環(huán)或針分別將兩個區(qū)域內的菌落研成乳狀液。將玻片傾斜搖動混合1 min，并對著黑暗背景進行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象皆為陽性反應。多價鞭毛抗原（ H）鑒定同。3.7 結果與報告綜合以上生化試驗和血清學鑒定的結果，報告25g（ml

12、 ）樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。5/16附錄 培養(yǎng)基和試劑1 緩沖蛋白胨水（ BPW）1.1 成分蛋白胨10.0g氯化鈉5.0g磷酸氫二鈉（含 12 個結晶水）9.0g磷酸二氫鉀1.5g蒸餾水1000mlpH7.2 ±0.21.2 制法將各成分加入蒸餾水中，攪混均勻，靜置約10 min，煮沸溶解，調節(jié) pH，高壓滅菌 121 ， 15min。2 四硫磺酸鈉煌綠（ TTB ）增菌液2.1 基礎液蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g氯化鈉3.0g碳酸鈣45.0g蒸餾水1000mlpH7.0 ±0.2除碳酸鈣外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，再加入碳酸鈣，調節(jié) pH，高壓滅菌 121

13、， 20 min。2.2 硫代硫酸鈉溶液硫代硫酸鈉（含 5個結晶水）50.0g蒸餾水加至 100ml高壓滅菌 121， 20 min。2.3 碘溶液碘片20.0g碘化鉀25.0 g6/16蒸餾水加至 100 ml將碘化鉀充分溶解于少量的蒸餾水中，再投入碘片， 振搖玻瓶至碘片全部溶解為止，然后加蒸餾水至規(guī)定的總量，貯存于棕色瓶內，塞緊瓶蓋備用。2.4 0.5煌綠水溶液煌綠0.5g蒸餾水100ml溶解后，存放暗處，不少于1d，使其自然滅菌。2.5 牛膽鹽溶液牛膽鹽10.0g蒸餾水100ml加熱煮沸至完全溶解，高壓滅菌121 ， 20min。2.6 制法基礎液900ml硫代硫酸鈉溶液100ml碘溶液

14、20.0ml煌綠水溶液2.0ml牛膽鹽溶液50.0ml臨用前，按上列順序，以無菌操作依次加入基礎液中，每加入一種成分，均應搖勻后再加入另一種成分。3 亞硒酸鹽胱氨酸（ SC）增菌液3.1 成分蛋白胨5.0g乳糖4.0g磷酸氫二鈉10.0g亞硒酸氫鈉4.0gL- 胱氨酸0.01g蒸餾水1000mlpH7.0 ±0.23.2 制法7/16除亞硒酸氫鈉和 L-胱氨酸外，將各成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，冷至55以下，以無菌操作加入亞硒酸氫鈉和1g/L L- 胱氨酸溶液 10ml（稱取 0.1g L-胱氨酸，加 1mol/L 氫氧化鈉溶液 15ml ，使溶解，再加無菌蒸餾水至100ml 即成，

15、如為 DL-胱氨酸，用量應加倍）。搖勻，調節(jié)pH。4 亞硫酸鉍（ BS）瓊脂4.1 成分蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g葡萄糖5.0g硫酸亞鐵0.3g磷酸氫二鈉4.0g煌綠0.025g或 5.0g/L水溶液 5.0ml檸檬酸鉍銨2.0g亞硫酸鈉6.0g瓊脂18.0g20g蒸餾水1000mlpH7.5 ±0.24.2 制法將前三種成分加入 300 ml 蒸餾水（制作基礎液），硫酸亞鐵和磷酸氫二鈉分別加入 20ml和 30ml蒸餾水中，檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉分別加入另一20ml和30ml蒸餾水中，瓊脂加入 600ml蒸餾水中。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。冷至80 左右時，先將硫酸亞鐵和磷酸氫

16、二鈉混勻，倒入基礎液中，混勻。將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉混勻，倒入基礎液中，再混勻。調節(jié) pH，隨即傾入瓊脂液中，混合均勻，冷至 50 55。加入煌綠溶液，充分混勻后立即傾注平皿。注：本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌， 在制備過程中不宜過分加熱， 避免降低其選擇性，貯于室溫暗處，超過 48h會降低其選擇性，本培養(yǎng)基宜于當天制備， 第二天使用。5 HE瓊脂（ Hektoen Enteric Agar）5.1 成分蛋白胨12.0g8/16牛肉膏3.0g乳糖12.0g蔗糖12.0g水楊素2 .0g膽鹽20.0g氯化鈉5.0g瓊脂18.0g20.0g蒸餾水1 000ml0.4溴麝香草酚藍溶液16.0mlAndrad

17、e 指示劑20.0ml甲液20.0ml乙液20.0mlpH7.5 ±0.25.2 制法將前面七種成分溶解于 400 ml 蒸餾水內作為基礎液 ;將瓊脂加入于 600 ml蒸餾水內。然后分別攪拌均勻，煮沸溶解。加入甲液和乙液于基礎液內,調節(jié) pH。再加入指示劑 ,并與瓊脂液合并 ,待冷至 50 55傾注平皿。注 :本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性。甲液的配制硫代硫酸鈉34.0g檸檬酸鐵銨4.0g蒸餾水100ml乙液的配制去氧膽酸鈉10.0g蒸餾水100ml Andrade指示劑酸性復紅0.5g1mol/L 氫氧化鈉溶液16.0ml9/16蒸餾水100m

18、l將復紅溶解于蒸餾水中 ,加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時后如復紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液 1ml 2ml 。6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽（ XLD ）瓊脂6.1 成分酵母膏3.0gL- 賴氨酸5.0g木糖3.75g乳糖7.5g蔗糖7.5g去氧膽酸鈉2.5g檸檬酸鐵銨0.8g硫代硫酸鈉6.8g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g酚紅0.08g蒸餾水1 000mlpH7.4 ±0.26.2 制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400ml蒸餾水中，煮沸溶解，調節(jié)pH。另將瓊脂加入 600ml蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，待冷至50 55傾注平皿。注 :本培養(yǎng)基不需要高壓滅菌，在制備

19、過程中不宜過分加熱，避免降低其選擇性，貯于室溫暗處。本培養(yǎng)基宜于當天制備，第二天使用。7 三糖鐵（ TSI）瓊脂7.1 成分蛋白胨20.0g牛肉膏5.0g乳糖10.0g10/16蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亞鐵銨（含 6 個結晶水）0.2g酚紅0.025g或 5.0 g/L溶液 5.0ml氯化鈉5.0g硫代硫酸鈉0.2g瓊脂12.0g蒸餾水1000mlpH7.4 ±0.27.2 制法除酚紅和瓊脂外，將其他成分加入400ml蒸餾水中，煮沸溶解，調節(jié)pH。另將瓊脂加入 600ml蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩溶液混合均勻后，再加入指示劑，混勻，分裝試管，每管約 2ml4ml，高壓滅菌

20、12110 min 或 115 15min，滅菌后置成高層斜面，呈桔紅色。8 蛋白胨水、靛基質試劑8.1 蛋白胨水蛋白胨（或胰蛋白胨）20.0g氯化鈉5.0g蒸餾水1000mlpH7.4 ±0.2將上述成分加入蒸餾水中， 煮沸溶解，調節(jié) pH，分裝小試管 ,121高壓滅菌 15min。 8.2 靛基質試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基甲醛溶解于 75ml戊醇中 ,然后緩慢加入濃鹽酸25ml。歐-波試劑：將 1g對二甲氨基苯甲醛溶解于 95ml95乙醇內。 然后緩慢加入濃鹽酸 20ml。8.3 試驗方法挑取小量培養(yǎng)物接種 ,在36±1培養(yǎng) 1d2d，必要時可培養(yǎng) 4d5d。加入

21、柯凡克試劑約 0.5ml，輕搖試管 ,陽性者于試劑層呈深紅色；或加入歐 -波試劑約11/160.5ml，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面,陽性者于液面接觸處呈玫瑰紅色。注：蛋白胨中應含有豐富的色氯酸。每批蛋白胨買來后，應先用已知菌種鑒定后方可使用。9 尿素瓊脂（ pH 7.2）9.1 成分蛋白胨1.0g氯化鈉5.0g葡萄糖1.0g磷酸二氫鉀2.0g0.4酚紅3.0ml瓊脂20.0g蒸餾水1000ml20%尿素溶液100mlpH7.2 ±0.29.2 制法除尿素、瓊脂和酚紅外，將其他成分加入 400ml 蒸餾水中，煮沸溶解，調節(jié)pH。另將瓊脂加入 600 ml 蒸餾水中，煮沸溶解。將上述兩

22、溶液混合均勻后，再加入指示劑后分裝， 121高壓滅菌 15min。冷至 50 55,加入經除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2。分裝于無菌試管內，放成斜面?zhèn)溆谩?.3 試驗方法挑取瓊脂培養(yǎng)物接種 ,在36±1培養(yǎng) 24h，觀察結果。尿素酶陽性者由于產堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。10 氰化鉀（ KCN ）培養(yǎng)基10.1 成分蛋白胨10.0g氯化鈉5.0g磷酸二氫鉀0.225g磷酸氫二鈉5.64g蒸餾水1000ml12/160.5氰化鉀20.0ml10.2 制法將除氰化鉀以外的成分加入蒸餾水中，煮沸溶解，分裝后121高壓滅菌15min。放在冰箱內使其充分冷卻。每 100ml 培養(yǎng)基加入 0.

23、5氰化鉀溶液 2.0ml （最后濃度為 1:10000），分裝于無菌試管內 ,每管約 4ml,立刻用無菌橡皮塞塞緊 ,放在 4冰箱內 ,至少可保存兩個月。同時，將不加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基 ,分裝試管備用。10.3 試驗方法將瓊脂培養(yǎng)物接種于蛋白胨水內成為稀釋菌液，挑取1環(huán)接種于氰化鉀（ KCN ）培養(yǎng)基。并另挑取 1環(huán)接種于對照培養(yǎng)基。在 36±1培養(yǎng) 1 d2 d，觀察結果。 如有細菌生長即為陽性 （不抑制），經2d細菌不生長為陰性 （抑制） 。注 :氰化鉀是劇毒藥 ,使用時應小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應在冰箱內進行。試驗失敗的主要原因是封口不嚴 ,氰化鉀逐漸

24、分解，產生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應。試驗時對每一環(huán)節(jié)都要特別注意。11 賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基11.1 成分蛋白胨5.0g酵母浸膏3.0g葡萄糖1.0g蒸餾水1000ml1.6溴甲酚紫 -乙醇溶液1.0mlL- 賴氨酸或 DL- 賴氨酸0.5g/100ml 或1.0g/100mlpH6.8 ±0.211.2 制法除賴氨酸以外的成分加熱溶解后,分裝每瓶 100ml，分別加入賴氨酸。 L- 賴氨酸按 0.5加入， DL- 賴氨酸按 1加入。調節(jié) pH。對照培養(yǎng)基不加賴氨酸。分裝于無菌的小試管內， 每管 0.5ml ，上面滴加一層液體石蠟， 115高壓

25、滅菌 10min。11.3 試驗方法13/16從瓊脂斜面上挑取培養(yǎng)物接種， 于36±1培養(yǎng) 18h 24h，觀察結果。氨基酸脫羧酶陽性者由于產堿，培養(yǎng)基應呈紫色。 陰性者無堿性產物， 但因葡萄糖產酸而使培養(yǎng)基變?yōu)辄S色。對照管應為黃色。12 糖發(fā)酵管12.1 成分牛肉膏5.0g蛋白胨10.0g氯化鈉3.0g磷酸氫二鈉（含 12個結晶水）2.0g0.2溴麝香草酚藍溶液12.0ml蒸餾水1000mlpH7.4 ±0.212.2 制法葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，調節(jié) pH。按 0.5加入葡萄糖，分裝于有一個倒置小管的小試管內， 121高壓滅菌 15min。其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后 ,分裝每瓶 100ml， 121高