藥用植物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)(hua)

1、藥用植物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡使用與植物細(xì)胞觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、學(xué)會(huì)正確使用與保養(yǎng)光學(xué)顯微鏡。2、學(xué)會(huì)臨時(shí)裝片法。3、學(xué)會(huì)繪制植物細(xì)胞圖的基本技術(shù)，能繪出植物細(xì)胞圖，并注明各部分名稱。4、了解顯微鏡的類型、構(gòu)造及簡(jiǎn)要的工作原理。5、通過(guò)實(shí)驗(yàn)理解植物細(xì)胞的概念、結(jié)構(gòu)及作用。二、儀器用品及實(shí)驗(yàn)材料：1. 儀器用品：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、刀片、0.03中性紅、1mol/L硝酸鉀溶液、4mol/L（24%）尿素溶液備用、稀甘油、稀碘液、氯化鋅碘試液、去離子水、吸水紙。2. 實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥、馬鈴薯三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（一）顯微鏡的類型：略（二）光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)：光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)部分和機(jī)械部分兩大

2、部分構(gòu)成。1、光學(xué)部分：主要包括物鏡、目鏡、反光鏡和聚光鏡四個(gè)部件。2、機(jī)械部分：主要由精巧的金屬零件組成，作用是支持光學(xué)部分，使其充分發(fā)揮效能。主要有鏡座、鏡臂、鏡筒、載物臺(tái)、物鏡轉(zhuǎn)換器和調(diào)焦裝置等六部分。(三）顯微鏡的使用每臺(tái)顯微鏡一般都配有低倍、高倍、油鏡三個(gè)物鏡頭，在觀察物體時(shí)，要先在低倍鏡下觀察，因低倍鏡的視野范圍大，容易找到觀察物，然后轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，若需要再放大時(shí)，再到油鏡下觀察。低倍鏡的使用取鏡對(duì)光放置載玻片調(diào)焦高倍鏡的使用由低倍高倍低倍（四）顯微鏡的使用、保護(hù)的注意事項(xiàng)1、 顯微鏡應(yīng)放在干燥的地方，避免強(qiáng)烈的日光照射。2、 拿取顯微鏡時(shí)，應(yīng)右手握鏡臂，左手托住底座，使鏡身直立

3、，切勿左右搖晃，以免碰傷或目鏡滑出。3、 保持顯微鏡的清潔，用擦鏡紙擦拭鏡頭，不可用手或毛布擦物鏡和目鏡；用綢布或紗布擦機(jī)械部分。4、 觀察時(shí)應(yīng)由低倍到高倍再到低倍，決不可先用高倍物鏡，以免損壞玻片而影響觀察。（五）植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)（1）用尖頭鑷子撕取洋蔥（玉蔥）鱗片內(nèi)表皮薄片（0.3×0.3cm），浸到0.03中性紅溶液中（載玻片上）1015min進(jìn)行染色。觀察：1.1 將染色后的植物材料放到載玻片上，蓋好蓋玻片，在蓋玻片的一側(cè)滴加無(wú)離子水（或pH略高于7.0的自來(lái)水），另一側(cè)放吸水紙吸干，以洗凈撕片外粘附的中性紅溶液，然后在顯微鏡下觀察，可以看出液泡染成櫻桃紅色；原生質(zhì)層（細(xì)胞質(zhì)和

4、細(xì)胞）則無(wú)色透明緊貼細(xì)胞壁（在細(xì)胞的角隅上可以看見(jiàn)）。1.2 在第1項(xiàng)觀察后，接著從蓋玻片的一邊滴2滴1mol/L硝酸鉀溶液, 在蓋玻片的另一邊用吸水紙吸蓋玻片下的水，將硝酸鉀溶液引入蓋玻片下浸漬植物材料，并立即鏡檢，可以看到細(xì)胞很快發(fā)生凸形質(zhì)壁分離。1.3 在第2項(xiàng)觀察后，接著在蓋玻片的一邊加入23滴無(wú)離子水，在另一邊用吸水紙吸去硝酸鉀溶液，使質(zhì)壁分離劑（即高滲的硝酸鉀溶液）被基本上洗吸掉。立即鏡檢可以看到帶有液泡的原生質(zhì)體重新吸水膨大，最后充滿整個(gè)細(xì)胞腔，即質(zhì)壁分離復(fù)原（復(fù)原緩慢進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞仍可正常存活；如果進(jìn)行很快，則會(huì)因原生質(zhì)機(jī)械破壞而死亡）。（2）另撕取內(nèi)表皮少許，平展于載玻片的水滴

5、上，加一滴水，加蓋玻片制成臨時(shí)裝片。低倍鏡下觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞壁較透明，細(xì)胞質(zhì)顏色均勻，細(xì)胞核扁球形，仔細(xì)觀察可見(jiàn)其內(nèi)13個(gè)發(fā)亮的核仁。再在高倍鏡下仔細(xì)觀察。從一側(cè)滴加稀碘液，細(xì)胞質(zhì)被染成淺黃色，細(xì)胞核被染成深黃色。（3）纖維素細(xì)胞壁觀察：馬鈴薯塊莖，徒手切片，滴加氯化鋅碘試液，觀察顏色反應(yīng)（藍(lán)紫色）。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告：繪出洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖，標(biāo)明細(xì)胞壁、液泡、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)二 植物根尖的觀察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、了解植物根尖的構(gòu)造；2、區(qū)分根尖不同部位組織細(xì)胞的差異；3、領(lǐng)會(huì)根尖不同部分的生理功能；4、繪制根尖顯微示意圖。二、儀器用品及實(shí)驗(yàn)材料：1、儀器用品：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、刀片、清

6、水。2、實(shí)驗(yàn)材料：洋蔥根尖。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1. 用刀片取洋蔥根尖1.2 cm（含根毛區(qū)），沿中軸切開(kāi)，取其中一半置于載玻片上，縱切面朝上，制臨時(shí)切片。2. 顯微鏡觀察不同部位組織細(xì)胞的形態(tài)。四、實(shí)驗(yàn)報(bào)告：繪制洋蔥根尖的縱切面圖。實(shí)驗(yàn)三 植物細(xì)胞后含物的鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?、識(shí)別細(xì)胞主要后含物的種類及鑒別方法。2、學(xué)習(xí)徒手切片和組織粉末裝片法。3、通過(guò)實(shí)驗(yàn)理解后含物的概念、種類及在鑒定藥材中的意義。4、繪出不同類型淀粉粒、結(jié)晶的形態(tài)圖。二、儀器用品及實(shí)驗(yàn)材料：1、儀器用品：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、斯氏液、稀碘液、蘇丹III試液、水合氯醛、稀甘油。2、實(shí)驗(yàn)材料：馬鈴薯塊莖、小茴香粉末、杏仁（或蓖麻

7、）、黨參粉末、無(wú)花果葉、半夏粉末、大黃粉末、黃柏粉末。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：（一）貯藏物：與淀粉鑒別1、淀粉粒觀察：刮取馬鈴薯塊莖組織少許，加斯氏液制作臨時(shí)裝片，鏡下觀察淀粉粒類型。加稀碘液，觀察淀粉粒顏色變化。2、糊粉粒觀察：觀察小茴香粉末（需透化），制臨時(shí)裝片。觀察胚乳細(xì)胞的糊粉粒。加稀碘液，觀察糊粉粒顏色變化（暗黃色）。注：還有無(wú)色的、不被染色的球晶體，它不是蛋白質(zhì)分子，而是無(wú)機(jī)磷酸化合物與鈣、鎂結(jié)合的鹽類。3、油滴觀察：杏仁（或蓖麻）徒手切片（浸泡后切面在載玻片上抹過(guò)），制臨時(shí)裝片，加蘇丹III試液，觀察油滴顏色變化（橙紅色）。 4、菊糖觀察：黨參粉末，首先浸于乙醇溶液1周，進(jìn)行軟化，然后加透

8、化劑（水合氯醛）加熱透化，加熱時(shí)須續(xù)加透化劑，至待觀察樣品透化清晰為止。觀察菊糖形態(tài)（類圓形或扇形）。圖310馬鈴薯塊莖淀粉粒A.單粒; B.C.D 復(fù)粒; E.半復(fù)粒圖311 蓖麻種子的胚乳細(xì)胞示糊粉粒1.球晶體;2.擬晶體;3.無(wú)定形膠層;4.糊粉粒;5.細(xì)胞核（二）晶體1、取大黃粉末制臨時(shí)裝片，觀察簇晶形態(tài)。2、取半夏粉末制臨時(shí)裝片，觀察針晶形態(tài)。3、取黃柏粉末制臨時(shí)裝片，觀察方晶形態(tài)。4、撕取無(wú)花果葉表皮，制臨時(shí)裝片，觀察表皮細(xì)胞中的鐘乳體。四、作業(yè)與思考：植物細(xì)胞后含物（貯藏物）主要有哪些種類？產(chǎn)生和儲(chǔ)藏的部位如何？如何鑒別？五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告：繪出不同類型淀粉粒、結(jié)晶的形態(tài)圖。實(shí)驗(yàn)四 薄

9、層色譜制備及應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、初步掌握簿層色譜法的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2、學(xué)會(huì)用薄層色譜法在生藥學(xué)中的應(yīng)用，了解薄層層析法分析單糖組分的原理和方法。二、實(shí)驗(yàn)原理色譜法的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質(zhì)中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經(jīng)該物質(zhì)時(shí)進(jìn)行反復(fù)的吸附或分配等作用，從而將各組分分開(kāi)。流動(dòng)的混合物溶液稱為流動(dòng)相；固定的物質(zhì)稱為固定相（可以是固體或液體）。根據(jù)組分在固定相中的作用原理不同，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜等；根據(jù)操作條件不同，可分為柱色譜、紙色譜、薄層色譜、氣相色譜及高效液相色譜等類型。薄層色譜(Thin Layer

10、Chromatography)常用TLC表示，又稱薄層層析，屬于固液吸附色譜。是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種很重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，屬固液吸附色譜，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)，一方面適用于少量樣品（幾到幾微克，甚至0.01微克）的分離；另一方面在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚加大，因此，又可用來(lái)精制樣品，此法特別適用于揮發(fā)性較小或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的質(zhì)。此外，薄層色譜法還可用來(lái)跟蹤有機(jī)反應(yīng)及進(jìn)行柱色譜之前的一種“預(yù)試”。三、實(shí)驗(yàn)儀器與材料常用薄層層析槽、薄層層析板、薄層層析點(diǎn)樣管、展開(kāi)劑（乙酸乙脂：吡啶：無(wú)水乙醇：水=8：1：1：2）、正丁醇：乙酸：水=4：1：5 (上層)備用

11、、顯色劑（苯胺-鄰苯二甲酸-正丁醇飽和水溶液）、單糖混合品、單糖標(biāo)準(zhǔn)品、硅膠、0.5羧甲基纖維素鈉、電吹風(fēng)、烘箱、鉛筆（自備）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1薄層板制備：稱取硅膠5 g于50 ml燒杯中，加入用 15 mL 0.5羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液，用玻璃棒慢慢攪拌至硅膠分散均勻，注意不能產(chǎn)生氣泡。接著沿著板中線把硅膠倒在玻璃板上，可以用玻璃棒引著溶液平鋪在玻璃板上（注意：硅膠厚度以0.2mm1.0mm為宜，玻璃板事先應(yīng)洗干凈，沒(méi)有劃痕，沒(méi)有缺口，4個(gè)角要“健全”）。然后在實(shí)驗(yàn)桌的一側(cè)輕輕顛震玻璃板，使薄層板表面平整，各個(gè)角落都布滿。制備完畢，放在平坦空處自然晾干。薄層板活化：取已制備好的薄層板于1

12、10 烘箱活化1 h，備用。2點(diǎn)樣：用點(diǎn)樣管吸取樣品點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊1.52.0 cm，點(diǎn)樣直徑為24mm，點(diǎn)間距離約為1.52.0 cm，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。3展開(kāi)：展開(kāi)室如需預(yù)先用展開(kāi)劑飽和，將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開(kāi)室的展開(kāi)劑中，浸入展開(kāi)劑的深度為距薄層板底邊0.51.0 cm（切勿將樣點(diǎn)浸入展開(kāi)劑中），密封室蓋，等展開(kāi)劑前沿升至至離頂部1/3高度時(shí)，取出薄層板，晾干（或電吹風(fēng)吹干）。4顯色：涼干后的薄板。用噴霧器把顯色劑噴在薄板上，置于85烘箱內(nèi)加熱10分鐘即可顯色。薄層顯色后，將樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜進(jìn)行比較

13、，參考斑點(diǎn)顏色、相對(duì)位置及Rf值，確定樣品中有哪幾種糖。五、作業(yè)觀察結(jié)果，繪制薄層色譜圖，計(jì)算Rf值。思考題：1、在一定的操作條件下為什么可利用Rf值來(lái)鑒定化合物？2、在混合物薄層色譜中，如何判定各組分在薄層上的位置？3、展開(kāi)劑的高度若超過(guò)了點(diǎn)樣線，對(duì)薄層色譜有何影響？附1.Rf值的計(jì)算薄層色譜是在被洗滌干凈的玻板上均勻的涂一層吸附劑或支持劑，帶干燥、活化后將樣品溶液用管口平整的毛細(xì)管滴加于離薄層板一端約1cm處的起點(diǎn)線上，涼干或吹干后置薄層板于盛有展開(kāi)劑的展開(kāi)槽內(nèi)，浸入深度為0.5cm。待展開(kāi)劑前沿離頂端約1cm附近時(shí)，將色譜板取出，干燥后噴以顯色劑，或在紫外燈下顯色。記下原點(diǎn)至主斑點(diǎn)中心及

14、展開(kāi)劑前沿的距離，計(jì)算比移值（Rf），公式如下：2.薄層色譜展開(kāi)方式薄層色譜展開(kāi)需要在密閉容器中進(jìn)行。為使溶劑蒸氣迅速達(dá)到平衡，可在展開(kāi)槽內(nèi)襯一濾紙。常用的展開(kāi)槽有：長(zhǎng)方形盒式和廣口瓶式。展開(kāi)方式有：（1）上升法 將色譜板垂直于盛有展開(kāi)劑的容器中，適合于含粘合劑的色譜板。（2）傾斜上行法 色譜板傾斜1015°角，適用于干板或無(wú)粘合劑軟板的展開(kāi)；色譜板傾斜4560°角適用于含有粘合劑的色譜板。（3）下降法 用濾紙或紗布等將展開(kāi)劑吸到薄層板的上端，使展開(kāi)劑沿板下行，這種連續(xù)展開(kāi)的方法適用于Rf值小的化合物。（4）雙向色譜法 將樣品點(diǎn)在方形薄層板的角上，先向一個(gè)方向展開(kāi)，然后轉(zhuǎn)動(dòng)

15、90°角的位置，再換另一種展開(kāi)劑展開(kāi)。適合于成分復(fù)雜的化合物分離。3.薄層色譜是否成功的關(guān)鍵薄層色譜的上樣技術(shù)不良的上樣是薄層色譜失敗的主要原因：1 原點(diǎn)位置對(duì)樣品容積的負(fù)荷量是極其有限的。2 上樣環(huán)行色譜效應(yīng)。3 供試液的溶劑在原點(diǎn)的殘留。4 上樣裝置對(duì)薄層表面的機(jī)械損傷對(duì)色譜質(zhì)量的影響。實(shí)驗(yàn)五 植物色素的提取分離一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)萃取的原理及方法，掌握分液漏斗的使用；2、學(xué)習(xí)柱色譜法的基本原理，掌握用柱色譜法分離提純有機(jī)物的操作方法。二、實(shí)驗(yàn)原理利用萃取技術(shù)從植物葉中獲得色素提取物，然后通過(guò)柱色譜法分離提純獲得較高純度的色素樣品。三、儀器與試劑 干燥綠樹葉（或綠草葉）、硅膠、石

16、油醚（6090 ）、丙酮、無(wú)水硫酸鈉、飽和氯化鈉溶液、蒸餾水、色譜柱、玻璃漏斗、分液漏斗、研缽、三角瓶、試管、滴管、玻棒、濾紙、脫脂棉。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、綠色植物葉色素的提?。悍Q取2.5 g綠色草葉，切成碎片，置于研缽中，加15mL丙酮一起搗爛（丙酮蒸發(fā)快，可適當(dāng)補(bǔ)之），過(guò)濾除去濾渣，濾液移至分液漏斗，加10mL石油醚。如有乳狀液形成，可加入5-10 mL的飽和氯化鈉溶液一起振搖，靜置，棄水層后，用20 mL蒸餾水洗滌綠色溶液兩次，分出有機(jī)層，用0.2 g無(wú)水硫酸鈉干燥1小時(shí)，備用。2、裝柱：將一根洗凈，烘干的色譜柱（2.53.0*3040 cm）垂直固定在鐵架臺(tái)上，于柱的下端放入少許的脫脂棉，

17、關(guān)上活塞，沿柱壁倒入少量石油醚，潤(rùn)濕玻璃棉（或脫脂棉），并趕走氣泡（如底部有砂芯隔板，上述加脫脂棉步驟可省略）。稱取30 g硅膠（200-300目）于250 mL燒杯中，加入100 mL石油醚，充分?jǐn)嚢枋怪畱腋?，一次性倒入色譜柱（柱底部預(yù)裝50 mL的石油醚）同時(shí)打開(kāi)活塞，并隨時(shí)用橡皮塞輕輕敲打柱身，底部收集的裝柱溶劑可回收加到色譜柱上端，30 min后，當(dāng)柱上端溶劑剛好與硅膠界面齊平時(shí)，關(guān)上活塞，最后在柱的上端加入少許脫脂棉。3、上樣：用滴管取2 mL第一步中已處理好的樣品立即沿柱壁轉(zhuǎn)一圈加入，打開(kāi)活塞，待樣品剛剛完全進(jìn)入硅膠時(shí)，關(guān)上活塞，并用少量石油醚沿柱壁洗下粘在柱壁的有色物質(zhì)，并使之完

18、全進(jìn)入硅膠界面。4、洗脫：緩慢加入石油醚洗脫液，控制洗脫速度（v=3 mL/min），觀察色譜帶的出現(xiàn)（兩條黃色帶在前，兩條綠色帶在后）。當(dāng)?shù)谝粭l黃色帶（-胡蘿卜素）到達(dá)底部時(shí)，改用石油醚：丙酮混合溶劑（9：1）梯度洗脫，當(dāng)?shù)诙l色帶（葉黃素）到達(dá)底部時(shí)，同樣換用石油醚：丙酮混合溶劑（7：3）梯度洗脫，最后用混合溶劑（1：1）梯度洗脫，收集的最后色帶為黃綠色（葉綠素b）。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，倒出柱中硅膠，并將色譜柱等實(shí)驗(yàn)器材清洗干凈放回遠(yuǎn)處。五、作業(yè)1、萃取過(guò)程中，如出現(xiàn)乳濁液難于分層怎么辦？2、萃取過(guò)程中最應(yīng)該注意的安全事項(xiàng)時(shí)什么？3、為什么極性大的組分，要用極性大的溶劑洗脫？4、柱子中若有空氣

19、或填裝不均勻，會(huì)影響分離效果嗎？為什么？如何避免？萃取與柱色譜介紹1. 萃取是天然藥物實(shí)驗(yàn)中用來(lái)提取或純化天然有機(jī)產(chǎn)物的常用操作之一。應(yīng)用萃取可以從固體或液體混合物中提取出所需要的物質(zhì)，也可以用來(lái)洗去混合物中少量的雜質(zhì)，前者稱為萃取，后者稱為洗滌，二者在理論上和基本操作上有許多相同之處，但目的不同。萃取是利用物質(zhì)在兩項(xiàng)（或更多項(xiàng)）不互溶（或微溶）溶劑中，溶解度或分配比的不同來(lái)達(dá)到分離，進(jìn)行物質(zhì)提取或純化目的的一種操作。有機(jī)物質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度一般比在水中的溶解度大，所以可以將它們從水中萃取出來(lái)。在一定溫度下，一種物質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中分配比為一常數(shù)K：K = CA / CB = (W1/V) / (W0 W1) / S 或 W1 = W0 KV / (KV + S)CA 和 CB 分別為物質(zhì)在原溶液A和B中的濃度；V = 原溶液體積；S = 溶劑體積；W0 = 原物質(zhì)重量；W1 = 萃取后剩余重量。萃取幾次后，在水中的剩余量Wn為：W1 = W0 KV / (KV + S)n實(shí)驗(yàn)證明：在一定溫度下，用一定量的溶劑進(jìn)行萃?。ɑ蛳礈欤r(shí)，分幾次萃?。ɑ蛳礈欤┮扔萌咳軇┮淮屋腿。ɑ蛳礈欤┧玫男Ч谩］腿】煞譃閺墓腆w物質(zhì)萃取及從液體物質(zhì)萃取兩種。從固體混合物中萃取所需物質(zhì)，最簡(jiǎn)單的方法是先將固體混合物研細(xì)，放在容器里，然后加入適量的萃取劑，振蕩，最后用過(guò)濾的方法把萃