皂苷測(cè)定方法

1、1 三萜皂苷三萜皂苷主要分布在植物界的石竹科、桔?？啤⑽寮涌?、豆科中。桔梗、南沙參、黨參、人參、三七、瞿麥、甘草、遠(yuǎn)志、紫菀、地榆等許多中草藥都含有此類(lèi)皂苷。不同的中草藥其三萜皂苷的皂苷元或活性成分不同，比如人參皂苷的皂苷元為人參皂苷Rg1、 Re 和 Rb9；女貞子中三萜皂苷的皂苷元為齊墩果酸10 。三萜皂苷的定量測(cè)定方法主要有比色法、薄層色譜法、高效液相色譜紫外檢測(cè)器法、高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器法。1.1 比色法比色法的原理是：三萜皂苷分子中缺少發(fā)色團(tuán)和助色基，需要某種試劑與其反應(yīng)形成發(fā)色基團(tuán)后顯色，在某個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，再根據(jù)吸光度與濃度的關(guān)系(標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn))，計(jì)算出樣品的濃度，從而

2、計(jì)算出樣品中總皂苷的含量。常見(jiàn)的顯色劑有香草醛冰醋酸溶液和高氯酸體系或濃硫酸。比如徐睿庸等人利用分光光度法測(cè)定青錢(qián)柳葉中總?cè)圃碥盏暮浚捎玫娘@色劑就是0.3mL 的 50g/L 香草醛一冰醋酸與0.6mL 的高氯酸。在顯色劑與樣品中的三萜皂苷反應(yīng)后，80水浴10min， 在波長(zhǎng) 550nm 處測(cè)定青錢(qián)柳葉中總?cè)圃碥盏奈舛龋?從而計(jì)算出含量。其化學(xué)反應(yīng)原理是：強(qiáng)酸使羥基脫水而使其雙鍵數(shù)目增加，又經(jīng)雙鍵位移后與顯色劑縮合等反應(yīng)形成共軛結(jié)構(gòu)，最后在酸作用下形成碳正離子鹽而顯色11 。而楊文志等人則認(rèn)為顯色機(jī)理是因?yàn)樵碥赵蠧3 和 C12 上的羥基與香草醛上的醛基發(fā)生反應(yīng)，形成縮醛，成為新

3、的共軛體系而顯色12 ?？籽嗑齽t采用濃硫酸作為顯色劑，分別測(cè)定了人參、三七和男壯膠囊中三萜皂苷的含量。他認(rèn)為人參皂苷分子上的糖基能被濃硫酸氧化脫水成糠醛衍生物，在60水浴2h 后在 322nm 處有紫外吸收，測(cè)其吸光度，進(jìn)而計(jì)算出人參、三七和男壯膠囊中的三萜皂苷含量13 14 。1.2 薄層掃描法傅強(qiáng)等人依據(jù)五加科植物人參三萜皂苷中人參皂苷Rg1 在薄層板上分離效果較好和熒光分光光度法高靈敏度的特點(diǎn)，建立了薄層色譜-熒光分光光度法測(cè)定人參中人參皂苷Rg1 薄層色譜法。展開(kāi)劑為氯仿：醋酸乙酯：甲醇：水= 16 ： 2 ： 11 ： 12的下層液體，顯色劑為10的硫酸乙醇溶液，噴霧顯色，95c水浴

4、中加熱 5min,在雙波長(zhǎng)薄層掃描儀下掃描，激發(fā)波長(zhǎng)Ex=320nm,發(fā)射波長(zhǎng)Em=400nm。實(shí)驗(yàn)表明：薄層色譜顯色是定量的關(guān)鍵，用 10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色要均勻，否則定量洗脫后測(cè)定熒光強(qiáng)度值有較大差異。在105加熱5min,效果良好15。1.3 高效液相色譜法近年來(lái)，隨著高效液相色譜儀的普及，越來(lái)越多的皂苷成分開(kāi)始使用到了這項(xiàng)技術(shù)。由于它能有效處理非揮發(fā)性和極性較強(qiáng)的化合物，可以較好分離出主成分峰和雜質(zhì)峰，能反映樣品的真實(shí)含量，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、 靈敏有利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制，從而使它成為了測(cè)定皂苷的一種最有效最常用的方法，但HPLC 儀器昂貴，而且要求有對(duì)照品。1.3.1 高效液相色譜紫外

5、檢測(cè)器法該方法是HPLC 中測(cè)定有紫外吸收的皂苷常用方法，廣泛應(yīng)用于三萜皂苷如人參皂苷、女貞子中齊墩果酸含量的測(cè)定中。紫外檢測(cè)器由于對(duì)環(huán)境溫度、流速、 流動(dòng)相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗，但它非通用檢測(cè)器，它要求被測(cè)物質(zhì)有較強(qiáng)的紫外吸收或本身無(wú)紫外吸收但轉(zhuǎn)化后有吸收紫外線(xiàn)的基團(tuán)。戰(zhàn)佩英等人使用島津高效液相色譜儀紫外檢測(cè)器(SPD-10A UV-V IS )工作站對(duì)女貞子藥材中的齊墩果酸進(jìn)行了含量測(cè)定。色譜條件是：C18色譜柱(200mm x 4.6mm, 5 m);流動(dòng)相為甲醇-0.05%乙酸胺水溶液(86:14);流速：0.8mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫 25c

6、10。1.3.2 高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器法戚志華等人采用600 高效液相色譜儀2996 二極管陣列檢測(cè)器對(duì)不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)期的女貞子中齊墩果酸和熊果酸的含量進(jìn)行了測(cè)定。其實(shí)驗(yàn)色譜條件如下：色譜柱：LichrospherC18(250mm x 416mm , 5科m);流動(dòng)相：乙睛-甲醇-水-磷酸-三乙胺(50 ： 30 ： 20 ： 0;流速： 1mL - min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量： 20 dL16。Fang LIU 等人對(duì)絞骨 藍(lán)皂昔的高效液相色譜技術(shù)進(jìn)行了研究。他們認(rèn)為，皂甘的紫外吸收較弱，紫外檢測(cè)器 設(shè)置的最大吸收波長(zhǎng)一般在203nm左右，在這個(gè)波長(zhǎng)范

7、圍內(nèi)，黃酮和色素等雜質(zhì)也有紫外吸收，從而帶來(lái)雜峰。因此，他們選用了二極管陣列檢測(cè)器作為檢測(cè)工具17。其色譜條件是：Agilent 1100 系列工作站，G1315A 二極管陣列檢測(cè)器，AlltimaC18 柱(4.6mm x 250mm, 5mm),流動(dòng)相：水：乙睛梯度洗脫(5100%),流速0.8ml/min , 波長(zhǎng)203nm,進(jìn)樣量20ml。Muhammad K.Saeed等人對(duì)中國(guó)粗木匪提取物進(jìn)行了高效液相色譜分析，他們?yōu)榱双@得盡可能多的可檢測(cè)到的強(qiáng)峰，而選用了二極管陣列檢測(cè)器，這樣一來(lái)，所有峰的光譜就都可以被檢測(cè)顯示出來(lái)。他們的色譜條件是：HPLC曰ite P230系列工作站，二極管

8、陣列檢測(cè)器(DAD-230) , Kromasil C18 柱(250mm x 4.6mm , 5 d m);流動(dòng)相是水-乙睛(1 : 1), 540min 內(nèi)線(xiàn)性洗脫，流速0.7ml/min ,波長(zhǎng)254nm，進(jìn)樣量10科l18。二極管陣列檢測(cè)器(diode-array detector, DAD)是先讓所有波長(zhǎng)的光都通過(guò)流動(dòng)池，然后通過(guò)一系列分光技術(shù)，使所有波長(zhǎng)的光在接受器上被檢測(cè)。和普通的紫外一可見(jiàn)分光檢測(cè)器相比，二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)入流動(dòng)池的光不再是單色光。它具有以下優(yōu)點(diǎn)：可極為方便地得任意波長(zhǎng)的色譜圖；可得任意時(shí)間的光譜圖，相當(dāng)于與紫外聯(lián)用；提供組分的定性信息。也就是說(shuō)，二極管陣列 檢

9、測(cè)器不僅可用于定量檢測(cè)，還具有輔助定性、山I純度評(píng)估等功能，可得到立體的光譜-色譜圖，對(duì)有特征紫外吸收的化合物的定性很有幫助。 1.3.3高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light-scattering detector, ELSD)是一種基于溶質(zhì)的光散射性 質(zhì)的通用檢測(cè)器，由霧化器、加熱漂移管(溶劑蒸發(fā)室)、激光光源和光檢測(cè)器(光電轉(zhuǎn)換器)等部件構(gòu)成。流動(dòng)相由熱氣流使之熱氣化噴霧，再進(jìn)入加熱管，溶劑在加熱管中揮發(fā)。 被分析檢測(cè)的物質(zhì)顆粒通過(guò)一束狹窄的散射光由光電倍增管收集，色譜柱流出液導(dǎo)入霧化器，被載氣(壓縮空氣或氮?dú)?霧化成微細(xì)液滴，液滴通過(guò)加熱漂

10、移管時(shí)，流動(dòng)相中的溶劑 被蒸發(fā)掉，只留下溶質(zhì)，激光束照在溶質(zhì)顆粒上產(chǎn)生光散射，光收集器收集散射光并通過(guò)光電倍增管轉(zhuǎn)變成電信號(hào)。 ELSD的響應(yīng)取決于被分析的質(zhì)粒的數(shù)量和大小， 而不依賴(lài)于 被測(cè)物的光學(xué)特性。ELSD可消除因溫度變化引起的基線(xiàn)漂移，即使是在梯度洗脫時(shí)也能提供平穩(wěn)的基線(xiàn)。和紫外檢測(cè)器相比，它排除了用 UV檢測(cè)器時(shí)的溶劑干擾，大大地提高了分離效果。和二極管陣列檢測(cè)器相比，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器基線(xiàn)噪音小，不受梯度影響，能夠獲得較好的峰形，且僅對(duì)不揮發(fā)被分析物質(zhì)產(chǎn)生響應(yīng)，因此雜質(zhì)峰較少。和示差折光檢測(cè)器相比，它的基線(xiàn)漂移不受溫度影響，信噪比，高靈敏度比RID高二個(gè)數(shù)量級(jí)，且與梯度洗脫兼容。對(duì)

11、無(wú)紫外吸收或僅有紫外末端吸收的物質(zhì)如糖類(lèi)、皂甘類(lèi)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器具有良好的穩(wěn)定性，較高的靈敏度和重現(xiàn)性。因此，越來(lái)越多的中草藥中皂甘類(lèi)成分的測(cè)定使用到了蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。 王舉濤等人用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法對(duì)常用中藥黃甚中的功效成分黃甚甲昔進(jìn)行了含量測(cè)定。由于黃茂甲昔僅在200 nm處有弱的末端吸收，因而操作條件十分嚴(yán)格，噪音對(duì)結(jié)果影響較大，靈敏度也較差；如果用柱前衍生化高效液相色譜-紫外檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定，雖可克服黃茜甲昔僅在 200nm處有弱的末端吸收的弱點(diǎn)，但試驗(yàn)結(jié)果表明操作繁瑣，重現(xiàn)性差。而高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定黃茂甲昔， 不受流動(dòng)相溶劑的干擾，不要求被檢測(cè)組分

12、特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，亦可用于不揮發(fā)性成分的檢測(cè)。 試驗(yàn)結(jié)果表明分離度好、干擾少、前處理簡(jiǎn)便。靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性均符合含量測(cè)定要 求。其色譜條件如下：色譜柱：ODS柱(4.6mm x 150mm, 5m);柱溫：25 C；流動(dòng)相：乙睛-水(40 : 60),流速：1.0ml/min；漂移管溫度：105C,載氣流速為 2.8 L/min19。2管體皂昔管體皂昔主要存在于薯拓科、百合科植物中，如各種薯茄、七葉一枝花、土茯苓、知母、麥冬等。管式皂昔因可作為合成管體激素的原料而有重要意義。不同的中草藥其管體皂昔的皂昔元或活性成分不同，比如知母、天冬中管體皂甘的皂昔元主要為菠葵皂昔元20 21;黃姜或盾葉

13、薯藤中管體皂昔的主要皂昔元?jiǎng)t為薯藤皂昔元22 23。管體皂音的定量測(cè)定方法主要有比色法、高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法。2.1 比色法比色法測(cè)定管體皂昔的含量其原理同三菇皂昔相同，但因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與三菇皂甘不同，故所選用的顯色劑不同。一般來(lái)說(shuō)，測(cè)定總管體皂昔的顯色劑是濃硫酸或香草醛-冰乙酸溶液和 高氯酸。薛小娟等人利用知母中菠葵皂昔元能與濃硫酸發(fā)生顯色反應(yīng)的原理，通過(guò)測(cè)定總皂甘水解產(chǎn)物中菠葵皂昔元的含量來(lái)測(cè)定知母總皂昔含量24。李敏等人在測(cè)定天冬中總皂昔含量時(shí)，對(duì)不同的顯色劑； 0.2ml香草醛冰醋酸和 0.8ml高氯酸； 8%香草醛乙 醇液和77%硫酸；高氯酸

14、；94%硫酸進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)高氯酸的顯色效果較好21?？偟膩?lái)說(shuō)，比色法的特點(diǎn)是：方法靈敏，但顯色試劑的專(zhuān)屬性較差，通常用于總皂昔的測(cè)定；要求有特定的顯色劑；要選擇合適的對(duì)照品。2.2 高效液相色譜法-二極管陣列檢測(cè)器法都述虎等人通過(guò)采用 waters高效液相色譜儀和 996二極管陣列檢測(cè)器(DAD)對(duì)穿龍薯藤總 皂昔中薯藤皂昔元含量進(jìn)行測(cè)定，建立了反相高效液相色譜法測(cè)定穿龍薯藤總皂昔中薯藤皂昔元的含量的方法25。色譜條件如下：Bondapak C18柱，甲醇為流動(dòng)相，流速1.0ml / min,檢測(cè)波長(zhǎng) 208nm。劉中博等人同樣采用高效液相色譜儀，2996型和二級(jí)管陣列檢測(cè)器，對(duì)薯藤屬植物有

15、效成分管體皂昔中的原薯藤皂昔進(jìn)行了定，該方法不僅靈敏度高、 專(zhuān)屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單易行，而且將質(zhì)量控制與活性成分相結(jié)合。色譜條件如下：色譜柱為XterraTM ODS(250mm x 416mm, 5 科 m),以乙睛-水(27 ： 73)為流動(dòng)相，體積流量 110mL/min,柱溫35 C,檢測(cè)波長(zhǎng) 203nm26。 2.3高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器法示差折光檢測(cè)器(differential refractometers detector, RID)是除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的 檢測(cè)器。其優(yōu)點(diǎn)是通用性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便；缺點(diǎn)是靈敏度低，最小檢測(cè)濃度達(dá)10-610-7g/mL, 不能做痕量分析，線(xiàn)性范

16、圍寬小于105,對(duì)壓力和溫度變化敏感，此外，由于洗脫液組成的變化會(huì)使折射率變化很大，因此，這種檢測(cè)器也不適用于梯度洗脫。牛偉等人對(duì)采用反相高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器對(duì)痍藜全草和果實(shí)中的管體皂昔元?？略砀试?、替告皂昔元進(jìn)行了定量比較的初探。色譜條件如下：色譜柱： Kromasil C18(250mm x 4.6mm , 5科m)。流 動(dòng)相是甲醇；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器(設(shè)置)：靈敏度0.2min(4s),樣品池溫度：35C。紫外檢測(cè)器(設(shè)置)：靈敏度=0.1min(2s)，檢測(cè)波長(zhǎng)：209nm；柱溫：室溫(28.1 C )；流速：1mL/min ; 分析時(shí)間：12min ;進(jìn)樣量：10WL27

17、。由于管體皂昔元無(wú)紫外吸收或紫外吸收較弱且主要 存在于低波區(qū)，給 HPLC定量檢測(cè)帶來(lái)了一定的困難。而示差折光檢測(cè)器屬于總體性能檢 測(cè)器，是根據(jù)不同物質(zhì)具有不同折射率來(lái)進(jìn)行組分檢測(cè)的，凡是具有與流動(dòng)相折射率不同的組分，均可以使用這種檢測(cè)器，因此是一種通用型檢測(cè)器，它對(duì)沒(méi)有紫外吸收的物質(zhì)，如高分子化合物，糖類(lèi)，某些皂昔等都能檢測(cè)。2.4 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法和三菇皂昔的測(cè)定相比，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法更多地應(yīng)用在了管體皂昔的測(cè) 定中。吳強(qiáng)等人采用 Shimadzu 210AT高效液相色譜儀和 Alltech ELSD500型檢測(cè)器對(duì)湖北 麥冬中主要皂甘的含量進(jìn)行了測(cè)定，色譜

18、條件如下：氣化溫度93.18C,氣體流速(N2)2.47 SLPM;色譜柱： A lltech V erspapack C18(416mm x 250mm);流速：2mm/ min。流動(dòng)相：乙 睛-四氫吠喃-水(45.6 : 2.9 : 51.5);流速:0.7mL / min28。唐曉清等人利用 HPLC- EL SD 法對(duì)麥冬中魯斯可皂昔元和薯藤皂昔元進(jìn)行了分離分析，測(cè)定了麥冬中魯斯可皂昔元的含量。由于魯斯可皂昔元為管體皂昔元，本身沒(méi)有紫外吸收，且麥冬中糖類(lèi)含量較多，故選用 EL SD 檢測(cè)器對(duì)無(wú)紫外吸收的甾體皂苷元的測(cè)定具有良好的穩(wěn)定性，較高的靈敏度和重現(xiàn)性，色譜條件如下：色譜柱：All

19、tech V ersapark C18(4.6mm x 250mm , 10科m);流動(dòng)相：甲醇-水(88 ： 12);流速：1.0ml / min。平均回收率為 98.22%(n=5) ,R SD=1.54% , 流動(dòng)相能很好地將魯斯可皂苷元和薯蕷皂苷元分離，且排除了其它成分的干擾29 。此外，劉彤焱 30 、祁海宏31 、成旭東32 等人分別采用高效液相色譜法-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法對(duì)通光藤和蒺藜中的皂苷進(jìn)行了測(cè)定，方法簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定，均取得了較好的結(jié)果。3 總結(jié)中草藥的皂苷成分千差萬(wàn)別，測(cè)定方法也因類(lèi)而宜，每一種方法都有其局限性?？傮w上來(lái)說(shuō)，紫外分光光度法、高效液相色譜法仍然是測(cè)定皂苷類(lèi)物質(zhì)的主要方法。通過(guò)超聲波、大孔吸附樹(shù)脂、超臨界 CO2 反相微乳萃取、溶劑萃取等手段去除雜質(zhì)，使皂苷溶解于非極性溶液中后， 再測(cè)定皂苷的含量是最常見(jiàn)的步驟。一般來(lái)講