ELISA標(biāo)準(zhǔn)操作及技術(shù)服務(wù)的常見問題分析

1、詳細(xì)介紹：一 .ELISA 標(biāo) 準(zhǔn) 操 作 要 點 優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件。 ELISA 中 用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的本公司要求使用的純化水電 導(dǎo)率小于1.5卩s/cm。1.標(biāo) 本 的 采 取 和 保 存 大部分 ELISA 檢測均以血清為標(biāo)本。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細(xì)胞溶 解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP 為標(biāo)記的 ELISA 測定中，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細(xì)菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。一般說來，在5

2、 天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4C,標(biāo)本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清 IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需20C保存。凍結(jié)血清融解后，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难?標(biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如 需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作，也可加入適當(dāng)防 腐劑。 抗凝不完全的標(biāo)本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝 劑。2.加樣加樣時應(yīng)將所加物加在 ELISA 板孔的底部， 避免加在孔壁上部， 并注意不 可濺出。3.保溫在建立 ELI

3、SA 方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37C經(jīng)1-2 小時，產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋 板孔，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應(yīng)注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定 力求準(zhǔn)確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫 育中還有邊緣效應(yīng)，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結(jié)果，將質(zhì)控放在非邊緣位置。4.洗滌洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié) 合的物

4、質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白 質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌 ， 不 得 馬 虎 。 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離 子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從 而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水 溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可

5、在0.05%-0.2% 之間，高于 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實驗的靈敏度。 洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應(yīng)按要求稀釋，所用的水電導(dǎo)率 最好在 1.5us/cm 之下，洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為 40 秒左右， 孔內(nèi)液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡5.顯 色 和 比 色 TMB 經(jīng) HRP 作用后，約 40 分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至 2 小時后即可完全消退至無 色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS 等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍(lán)色維持較長時間

6、（ 12-24 小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各 類酸性終止液則會使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指專用于測讀 ELISA 結(jié)果吸光度的光度計。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測 讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、 重復(fù)性、 精確度和可測范圍、 線性等等。 優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可 精確到 0.001 ， 準(zhǔn)確性為 1%，重復(fù)性達(dá) 0.5%。酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時 室溫宜在 1530 C ,使用前先預(yù)熱儀器 15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。 測讀 A 值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波長。有的酶標(biāo)儀可用

7、雙波長式測 讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1，第二次在不敏感波長（W2，兩次測定間不移動 ELISA 板的位置，最終測得的A 值為兩者之差（W1-W2。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。二 . 本 底 及 假 陽 性 產(chǎn) 生 的 原 因 分 析1.基 因 工 程 抗 原 與 合 成 肽 抗 原 的 區(qū) 別1.1基因工程抗原是抗原基因在質(zhì)粒載體中原核或真核表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母 菌 為 表 達(dá) 系 統(tǒng) 。 該 類 抗 原 與 合 成 肽 相 比 具 有 以 下 特 點 ：a. 分子量大。合成肽采用化學(xué)方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達(dá)到

8、數(shù)百個氨 基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。b. 穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原 的試劑盒效期只有 3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。c. 基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物包含更多的抗原決定簇，可提高 試劑盒的靈敏度，提高檢出率。d. 純化難度大?；蚬こ炭乖募兓夹g(shù)難度較大。1.2合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片 段。合成肽抗原有以下特點：a. 分子量太小b. 一般只含有一個抗原決定簇c. 純度高d. 穩(wěn)定性差由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性

9、，ELISA 診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就 HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產(chǎn)品為合成肽抗原，主要是 HCV 特 異性抗原決定簇的肽片段；第二代產(chǎn)品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當(dāng)時的 基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產(chǎn)品基本上采用了基因工程抗原， 而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提 由于歷史的原因，人們往往以反應(yīng)本底的好壞來衡量 ELISA 反應(yīng)試劑盒，因此有些廠家為了 保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學(xué)敏感度不 夠，穩(wěn)定性也成問題。值得欣慰的是也

10、有廠家堅持試劑盒高的流行病學(xué)敏感度，科學(xué)得對待反 應(yīng)結(jié)果。2假陽性本底產(chǎn)生的原因2. 1 抗原因素2.1. 1 融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基 因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達(dá)載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因 子發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生了可疑標(biāo)本。2.1.2錯誤排序的影響。合成肽在制備過程中，如果某些肽序列錯誤，會導(dǎo)致合成肽特異性改 變而產(chǎn)生假陽性。另外，在構(gòu)建基因工程表達(dá)載體時引入的 HCV 核苷酸發(fā)生相位改變或點突 變也會對抗原的特異性產(chǎn)生不利的影響，但由于基因工程技術(shù)的不斷進步，由工藝原因造成的 抗原特異性降低會逐漸被克服。2.2. 3

11、 抗原純度對特異性的影響。以 HCV 抗原為例，利用大腸桿菌大規(guī)模表達(dá)后需經(jīng)破碎細(xì) 胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能最后的到一定純度的 HCV 抗原。目前的工藝還不 能做到抗原純度為 100，因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過大腸桿菌感染的 人，血清中的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產(chǎn)生反應(yīng)而引起假陽性。2.2人血清中的正常 IgG人血清中 IgG 的濃度對 HCV 試劑盒有較大的影響。 HCV 試劑盒采用的間接法，酶標(biāo)抗抗體能 與人所有 IgG結(jié)合，而 IgG 吸附于板孔的能力很強，因此我們采用 100 微升樣稀加 10 微升血 清來將其稀釋以降低本底。到成人時，據(jù)統(tǒng)計學(xué)調(diào)查，成

12、人的 IgG 為 12mg/ml ，而有些人的 IgG 濃度會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于此，這部分人的血清經(jīng) ELISA 反應(yīng)后往往會顯色。2.3人血情中異常的 IgG 結(jié)締組織?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤等）等病癥時，血清中的風(fēng)濕小體和其它異常IgG （IgG 濃度達(dá)到 50mg/ml ）會引起本底升高或假陽性。2.4溶血的影響 當(dāng)溶血時，紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì)，當(dāng)其通過吸 附或“ PP 效應(yīng)”（蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象）結(jié)合后，可催化A、B 液顯色而造成假陽性。2.5操作不當(dāng)引起 任何操作不當(dāng)都會影響結(jié)果，因此在操作過程中保證操作的規(guī)范，嚴(yán)格按照說明書進行是得到 準(zhǔn)確

13、結(jié)果的關(guān)鍵核基礎(chǔ)。2.5.1加樣2.5.1.1樣品稀釋液少加，或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因 素影響更大。因為血清中受檢的特異性 IgG 只占總 IgG 中的一小部分。 IgG 的吸附性很強，非 特異 IgG 可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的 IgG 均可 以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋 倍數(shù)，必將帶來陰性高值。2.5.1.2酶結(jié)合物的不正確加入。一般來講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯(lián)板再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為120 卩 l。如果加入

14、的酶多于 120 卩 l 或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。2.5.2溫育5.2.1由于試劑盒確定的一定溫度下的反應(yīng)時間并不是反應(yīng)的終點，升高反應(yīng)的溫度，會加快 反應(yīng)，同樣增加時間會延長反應(yīng)，這樣得到的反應(yīng)程度會比試劑盒確定的反應(yīng)程度多，也會引 起陰性高值或假陽性。5.2.2由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為 37 度，在這個溫度下放置 30 分鐘，蒸發(fā)的水分會很 多，對于整個反應(yīng)體系來講，各種反應(yīng)物的濃度會不斷增加，這樣必會導(dǎo)致反應(yīng)最后的值升 高。因此溫育時應(yīng)蓋上膠貼。5.2.3試劑盒在設(shè)計時，反應(yīng)是在靜置條件下完成的，如果反應(yīng)改變?yōu)檎駝訔l件，會加快分子 的熱運動，增加反應(yīng)的機

15、會。5.2.4試劑盒的溫育過程是在培養(yǎng)箱中進行，這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯(lián)板迅速升溫，但較難將溫度控制在較穩(wěn)定的溫度，往往高于37 度，同樣會引起高值陰性。2.5.3. 洗板2.5.3.1各個廠家使用的洗液配方是不同的，是根據(jù)各自試劑的條件配制的，采用不配套的洗 液常會得到不正常的反應(yīng)結(jié)果，包括本底過高。本公司的洗液采用獨特的洗滌系統(tǒng)不能和其它 公司的試劑盒混用。2.5.3.2試劑盒中提供的洗液是濃縮的，應(yīng)該稀釋到規(guī)定的倍數(shù)使用，過多稀釋洗液，會影響 洗液的效果，而使反應(yīng)的本底過高。2.533 稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水，電導(dǎo)率小于1.2 卩 s。如果水中含有過多的Ca2+、Mg，

16、這些離子會占用表面活性劑，影響洗滌效果。2.5.3.4洗板時，應(yīng)每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對洗滌的效果影響也是很大的。本公司的酶聯(lián)板板孔為400 卩 l，比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時調(diào)整液量，以避免加液量不滿。2.5.3.5洗板的次數(shù)不夠孔內(nèi)多余的抗原（抗體）或酶結(jié)合物不能徹底去除，也會因此本底升高。2.5.3.6洗板的強度和洗板的浸泡時間是密切相關(guān)的。洗板機不同，使用的泵不同，液體加入時的沖力不同。如果加入洗液的沖力不大，也沒有設(shè)定浸泡時間，同樣會使結(jié)果的A 值偏高。2.5.3.7洗板完畢后，要進行拍板，盡量采用質(zhì)量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，紙屑 會留在

17、板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。2.5.4顯色。加 A、 B 液準(zhǔn)確，順序不能顛倒，要及時終止顯色。終止后要在3 分鐘內(nèi)讀數(shù)，否則強陽性會變低。2.5.5.槍頭、加樣槽或其它來源的污染 如果使用的槍頭、加樣槽是反復(fù)使用的，必須肯定其沒有來自酶或陽性的污染。酶作為反應(yīng)的 催化劑，及其微量也會很明顯影響反應(yīng)。反復(fù)使用的槍頭、加樣槽清洗不當(dāng)，也會干擾反應(yīng)。 如將槍頭使用 84 消毒液浸泡而沒有沖洗干凈，因為 84 是強氧化劑，加入 AB 液后就會顯色。 同樣槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的PH 值，反應(yīng)的結(jié)果也會不正常。常常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會將紙

18、上的強氧化劑留在槽中而影響反應(yīng)。2.5.6.測 A 值時，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起三、 cut off 值附近血清的處理1.cut off值附近的值是客觀存在的cutoff 值指經(jīng)過大量臨床調(diào)查后自行制定的判斷陰陽性的界限。 Cut off 值附近的值客觀存 在基于以下原因：大量臨床陰性樣本 A 值呈正態(tài)分布；這些陰性樣本 A 值是由低到高的連續(xù) 曲線； cutoff 值是這個連續(xù)曲線上的截斷值。1.1 正常血清 A 值的正態(tài)分布如圖一：當(dāng)試劑盒研發(fā)完成后，需要進行大量的臨床樣品的考核。其中陰性血清的 A 值呈正態(tài)分布，大 約 95 的陰性血清值與平均值相近，而有5的陰性血清則明顯低于或高于平均值，這是A 值的升cutoff 值可根據(jù) 95的置信限來確定。若試劑盒的特異性很好，可用98作為置信限來確定cutoff 值。但不論是選擇多少的置信限，總存在置信限以外的區(qū)域，該區(qū)域的部分樣品 A 值 會高于 cutoff 值，從統(tǒng)計上說是無法避免的。1.2正常血清 A 值的連續(xù)分布經(jīng)過大量的臨床調(diào)查會發(fā)現(xiàn)，正常血清的 A 值是一條從小到大的連續(xù)曲線。如圖二：在這條連續(xù)的曲線上，經(jīng)過計算選取一點作為 cutoff 值，這一點之下為陰性，之上為陽性， 因此 cut