ELISA標準操作及技術服務的常見問題分析

1、詳細介紹：一 .ELISA 標 準 操 作 要 點 優(yōu)質的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證 ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。 ELISA 中 用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質量的本公司要求使用的純化水電 導率小于1.5卩s/cm。1.標 本 的 采 取 和 保 存 大部分 ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶 解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP 為標記的 ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。一般說來，在5

2、 天內測定的血清標本可放置于4C,標本在冰箱中保存時間過長導致血清 IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需20C保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡?；鞚峄蛴谐恋淼难?標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如 需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防 腐劑。 抗凝不完全的標本因纖維蛋白原的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是肝素抗凝 劑。2.加樣加樣時應將所加物加在 ELISA 板孔的底部， 避免加在孔壁上部， 并注意不 可濺出。3.保溫在建立 ELI

3、SA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37C經(jīng)1-2 小時，產物的生成可達頂峰。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋 板孔，反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。應注意溫育的溫度和時間應按規(guī)定 力求準確。由于公司的試劑盒溫育是在空氣浴中完成，采用水浴會造成值偏高或花板。另外溫 育中還有邊緣效應，邊上的值會偏高，建議為了客觀的判斷結果，將質控放在非邊緣位置。4.洗滌洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結 合的物

4、質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白 質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來?？梢哉f在ELISA 操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌 ， 不 得 馬 虎 。 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離 子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從 而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水 溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可

5、在0.05%-0.2% 之間，高于 0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實驗的靈敏度。 洗板時注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋，應按要求稀釋，所用的水電導率 最好在 1.5us/cm 之下，洗液如果結晶應待其融解后配制。保證洗板浸泡時間為 40 秒左右， 孔內液體被洗板機吸收得越干凈洗滌效果更好，手工洗板防止洗液在孔內形成氣泡5.顯 色 和 比 色 TMB 經(jīng) HRP 作用后，約 40 分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至 2 小時后即可完全消退至無 色。TMB 的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS 等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間

6、（ 12-24 小時）不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各 類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。酶標比色儀簡稱酶標儀，通常指專用于測讀 ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有：測 讀速度、讀數(shù)的準確性、 重復性、 精確度和可測范圍、 線性等等。 優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可 精確到 0.001 ， 準確性為 1%，重復性達 0.5%。酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時 室溫宜在 1530 C ,使用前先預熱儀器 15-30分鐘，測讀結果更穩(wěn)定。 測讀 A 值時，要選用產物的敏感吸收峰，如 OPD 用 492nm 波長。有的酶標儀可用

7、雙波長式測 讀，即每孔先后測讀兩次，第一次在最適波長（W1，第二次在不敏感波長（W2，兩次測定間不移動 ELISA 板的位置，最終測得的A 值為兩者之差（W1-W2。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。二 . 本 底 及 假 陽 性 產 生 的 原 因 分 析1.基 因 工 程 抗 原 與 合 成 肽 抗 原 的 區(qū) 別1.1基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母 菌 為 表 達 系 統(tǒng) 。 該 類 抗 原 與 合 成 肽 相 比 具 有 以 下 特 點 ：a. 分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數(shù)量有限，只能達到

8、數(shù)百個氨 基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。b. 穩(wěn)定性好。包被的抗原的穩(wěn)定性可使試劑盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原 的試劑盒效期只有 3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。c. 基因工程抗原將特異性抗原決定簇基因融合表達，表達產物包含更多的抗原決定簇，可提高 試劑盒的靈敏度，提高檢出率。d. 純化難度大。基因工程抗原的純化技術難度較大。1.2合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片 段。合成肽抗原有以下特點：a. 分子量太小b. 一般只含有一個抗原決定簇c. 純度高d. 穩(wěn)定性差由于基因工程抗原較于合成肽抗原有無可比擬的優(yōu)越性

9、，ELISA 診斷試劑經(jīng)歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。就 HCV ELISA 試劑盒來講，第一代產品為合成肽抗原，主要是 HCV 特 異性抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時的 基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區(qū)片段；第三代產品基本上采用了基因工程抗原， 而且這些抗原包括更多、更穩(wěn)定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代試劑的敏感度大大提 由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量 ELISA 反應試劑盒，因此有些廠家為了 保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類試劑盒的流行病學敏感度不 夠，穩(wěn)定性也成問題。值得欣慰的是也

10、有廠家堅持試劑盒高的流行病學敏感度，科學得對待反 應結果。2假陽性本底產生的原因2. 1 抗原因素2.1. 1 融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷試劑盒為例為例，因為包被的基 因工程抗原為融合蛋白，包含了來自表達載體的一些序列，因此可以與血清中抗大腸桿菌的因 子發(fā)生反應而產生了可疑標本。2.1.2錯誤排序的影響。合成肽在制備過程中，如果某些肽序列錯誤，會導致合成肽特異性改 變而產生假陽性。另外，在構建基因工程表達載體時引入的 HCV 核苷酸發(fā)生相位改變或點突 變也會對抗原的特異性產生不利的影響，但由于基因工程技術的不斷進步，由工藝原因造成的 抗原特異性降低會逐漸被克服。2.2. 3

11、 抗原純度對特異性的影響。以 HCV 抗原為例，利用大腸桿菌大規(guī)模表達后需經(jīng)破碎細 胞、鹽析、粒子交換柱等分離純化步驟才能最后的到一定純度的 HCV 抗原。目前的工藝還不 能做到抗原純度為 100，因此抗原中還混有大腸桿菌的其它雜蛋白，受過大腸桿菌感染的 人，血清中的抗大腸桿菌抗體可和這些雜蛋白產生反應而引起假陽性。2.2人血清中的正常 IgG人血清中 IgG 的濃度對 HCV 試劑盒有較大的影響。 HCV 試劑盒采用的間接法，酶標抗抗體能 與人所有 IgG結合，而 IgG 吸附于板孔的能力很強，因此我們采用 100 微升樣稀加 10 微升血 清來將其稀釋以降低本底。到成人時，據(jù)統(tǒng)計學調查，成

12、人的 IgG 為 12mg/ml ，而有些人的 IgG 濃度會遠遠高于此，這部分人的血清經(jīng) ELISA 反應后往往會顯色。2.3人血情中異常的 IgG 結締組織?。ㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性骨髓瘤等）等病癥時，血清中的風濕小體和其它異常IgG （IgG 濃度達到 50mg/ml ）會引起本底升高或假陽性。2.4溶血的影響 當溶血時，紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質，當其通過吸 附或“ PP 效應”（蛋白質間相互吸附的現(xiàn)象）結合后，可催化A、B 液顯色而造成假陽性。2.5操作不當引起 任何操作不當都會影響結果，因此在操作過程中保證操作的規(guī)范，嚴格按照說明書進行是得到 準確

13、結果的關鍵核基礎。2.5.1加樣2.5.1.1樣品稀釋液少加，或血清多加，都會引起本底增高。對于間接法來說，受上述兩個因 素影響更大。因為血清中受檢的特異性 IgG 只占總 IgG 中的一小部分。 IgG 的吸附性很強，非 特異 IgG 可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異的 IgG 均可 以和酶標二抗發(fā)生反應而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多，高于規(guī)定的稀釋 倍數(shù)，必將帶來陰性高值。2.5.1.2酶結合物的不正確加入。一般來講，酶也有一定的非特異吸附，將包被好的酶聯(lián)板再封閉，一方面也可避免酶的非特異性吸附。通常每孔加入的封閉液為120 卩 l。如果加入

14、的酶多于 120 卩 l 或加在較高的孔壁上或孔口，也會引起本底升高或假陽性。2.5.2溫育5.2.1由于試劑盒確定的一定溫度下的反應時間并不是反應的終點，升高反應的溫度，會加快 反應，同樣增加時間會延長反應，這樣得到的反應程度會比試劑盒確定的反應程度多，也會引 起陰性高值或假陽性。5.2.2由于試劑盒通常設定的反應溫度為 37 度，在這個溫度下放置 30 分鐘，蒸發(fā)的水分會很 多，對于整個反應體系來講，各種反應物的濃度會不斷增加，這樣必會導致反應最后的值升 高。因此溫育時應蓋上膠貼。5.2.3試劑盒在設計時，反應是在靜置條件下完成的，如果反應改變?yōu)檎駝訔l件，會加快分子 的熱運動，增加反應的機

15、會。5.2.4試劑盒的溫育過程是在培養(yǎng)箱中進行，這和水浴的條件不一樣。水浴可是酶聯(lián)板迅速升溫，但較難將溫度控制在較穩(wěn)定的溫度，往往高于37 度，同樣會引起高值陰性。2.5.3. 洗板2.5.3.1各個廠家使用的洗液配方是不同的，是根據(jù)各自試劑的條件配制的，采用不配套的洗 液常會得到不正常的反應結果，包括本底過高。本公司的洗液采用獨特的洗滌系統(tǒng)不能和其它 公司的試劑盒混用。2.5.3.2試劑盒中提供的洗液是濃縮的，應該稀釋到規(guī)定的倍數(shù)使用，過多稀釋洗液，會影響 洗液的效果，而使反應的本底過高。2.533 稀釋洗液的水應該是新鮮的蒸餾水，電導率小于1.2 卩 s。如果水中含有過多的Ca2+、Mg，

16、這些離子會占用表面活性劑，影響洗滌效果。2.5.3.4洗板時，應每孔加滿洗液，如果加入的洗液液量不夠，對洗滌的效果影響也是很大的。本公司的酶聯(lián)板板孔為400 卩 l，比別的廠家的板孔大，因此洗了別公司的板后要及時調整液量，以避免加液量不滿。2.5.3.5洗板的次數(shù)不夠孔內多余的抗原（抗體）或酶結合物不能徹底去除，也會因此本底升高。2.5.3.6洗板的強度和洗板的浸泡時間是密切相關的。洗板機不同，使用的泵不同，液體加入時的沖力不同。如果加入洗液的沖力不大，也沒有設定浸泡時間，同樣會使結果的A 值偏高。2.5.3.7洗板完畢后，要進行拍板，盡量采用質量好的毛巾和吸水紙，使用易掉渣的紙，紙屑 會留在

17、板孔中，由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。2.5.4顯色。加 A、 B 液準確，順序不能顛倒，要及時終止顯色。終止后要在3 分鐘內讀數(shù)，否則強陽性會變低。2.5.5.槍頭、加樣槽或其它來源的污染 如果使用的槍頭、加樣槽是反復使用的，必須肯定其沒有來自酶或陽性的污染。酶作為反應的 催化劑，及其微量也會很明顯影響反應。反復使用的槍頭、加樣槽清洗不當，也會干擾反應。 如將槍頭使用 84 消毒液浸泡而沒有沖洗干凈，因為 84 是強氧化劑，加入 AB 液后就會顯色。 同樣槍頭和加樣槽不正確清洗，改變加入試劑的PH 值，反應的結果也會不正常。常常有人用手紙將加樣槽擦干，但是如果使用的手紙容易掉渣，會將紙

18、上的強氧化劑留在槽中而影響反應。2.5.6.測 A 值時，微孔條底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面都可能引起三、 cut off 值附近血清的處理1.cut off值附近的值是客觀存在的cutoff 值指經(jīng)過大量臨床調查后自行制定的判斷陰陽性的界限。 Cut off 值附近的值客觀存 在基于以下原因：大量臨床陰性樣本 A 值呈正態(tài)分布；這些陰性樣本 A 值是由低到高的連續(xù) 曲線； cutoff 值是這個連續(xù)曲線上的截斷值。1.1 正常血清 A 值的正態(tài)分布如圖一：當試劑盒研發(fā)完成后，需要進行大量的臨床樣品的考核。其中陰性血清的 A 值呈正態(tài)分布，大 約 95 的陰性血清值與平均值相近，而有5的陰性血清則明顯低于或高于平均值，這是A 值的升cutoff 值可根據(jù) 95的置信限來確定。若試劑盒的特異性很好，可用98作為置信限來確定cutoff 值。但不論是選擇多少的置信限，總存在置信限以外的區(qū)域，該區(qū)域的部分樣品 A 值 會高于 cutoff 值，從統(tǒng)計上說是無法避免的。1.2正常血清 A 值的連續(xù)分布經(jīng)過大量的臨床調查會發(fā)現(xiàn)，正常血清的 A 值是一條從小到大的連續(xù)曲線。如圖二：在這條連續(xù)的曲線上，經(jīng)過計算選取一點作為 cutoff 值，這一點之下為陰性，之上為陽性， 因此 cut