整理His-Tag表達(dá)蛋白純化

1、His-Tag 表達(dá)蛋白純化原理、方法和問題分析轉(zhuǎn)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化His-Tag 融合蛋白 是目前最常見的表達(dá)方式,而且很成熟,它的優(yōu)點(diǎn)是 表達(dá)方便而且根本不影響蛋白的活性, 無論是表達(dá)的蛋白是可溶性的或 者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜去 IMAC 純化.2 1 IMACImmobilized Metal-ion affinity chromatography 是 Porat h et al.1975 年用固定 IDA 作為配基的填料螯合過渡金屬銅、 鎳、鈷或 鋅離子,可以吸附純化外表帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白, 1987 年 Smith et al. 發(fā)現(xiàn)帶有幾個(gè)組氨酸或

2、色氨酸小肽和螯合金屬離 子的 IDA-sephadex G-25 作用力更強(qiáng),此前在 1986 年他和他的合作 者用 Ni2+-IDA-sephadex G-25 親和純化在氨基端帶組氨酸和色氨酸的 胰島素原.同年 1987 年 Hochuli et al. 發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和 N i2+-NTA 填料作用力更強(qiáng)于普通的肽, 1988 年他第一次用這樣的方法 純化了帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的多肽, 無論是在天然還是變性條件下一次親 和純化都得到很好效果,此后表達(dá)帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合 IMAC 變得非常普遍,相對而言,不帶標(biāo)簽的蛋白純化就非常困難,所以表達(dá) 帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合 IM

3、AC 純化變成最常用而且最有效的研究 蛋白結(jié)構(gòu)和功能的有力手段. 1986 年 Porath et al. 還發(fā)現(xiàn) Fe3+-IDA- sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的純化,而后發(fā)現(xiàn) Ga3+-IDA 也 有同樣的效果, 這樣螯合這兩種金屬離子的填料就有效用于磷酸化多肽 的富集和純化,同時(shí) IMAC 也可以用于純化各種和金屬離子結(jié)合的多肽, 應(yīng)用非常廣泛.市面常見的商品化 IMAC 用于帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽蛋白的配基有以下幾 種：2.2 影響 IMAC 純化結(jié)果的因素：2.2.1 填料的種類： 不同填料廠家的填料有差異,所以使用過程最好能得到廠家的技術(shù)支 持,由于不同的廠家填料不同

4、,此外蛋白純化個(gè)性很強(qiáng),沒有哪一個(gè)填 料是能適合所有帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化, 載量高和特異性好本身 就是矛盾.2.2.2 填料的配基種類、密度、金屬離子種類 填料最簡單的判斷是螯合好同樣的金屬離子, 哪家產(chǎn)品的顏色越深就意 味著和蛋白的作用力越強(qiáng),適用范圍越廣,載量也越高,純化的好壞關(guān) 鍵看純化的條件, 僅有填料的特異性是不夠的, 同樣配基密度下 IDA 填 料的親和力要比 NTA 的強(qiáng), 所以 NTA 上不能吸附的樣品可以選擇 IDA 為配基的填料.螯合金屬離子和蛋白作用強(qiáng)弱為銅和鎳離子的強(qiáng),而鋅和鈷離子的弱. 因此如果一個(gè)蛋白作用力強(qiáng),想得到好的特異性可以選擇螯合鈷離子, 它還有一個(gè)優(yōu)

5、點(diǎn)是不怕復(fù)原劑,特別時(shí)候有高濃度的復(fù)原劑. 相同金屬 離子,IDA的強(qiáng)于NTA.螯合金屬離子的價(jià)位越低和蛋白的作用力越強(qiáng). 同時(shí)鎳離子是最常用的, 如果有條件可以換不同金屬離子以得到更好的效果,由于不同的金屬離子有不同的選擇性. 因此要希望填料應(yīng)用范圍 廣就選擇鎳瓊脂糖凝膠,如果是希望特異性好而且穩(wěn)定就選擇鎳 NTA 瓊脂糖凝膠 .2.2.2 蛋白本身的結(jié)構(gòu)和樣品來源IMAC 原理已經(jīng)說明只要是帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白都 可以被吸附,所以要想得到好的純化效果,必須選擇好純化的條件,通 常帶組氨酸蛋白都可以在天然情況下被鎳瓊脂糖凝膠或鎳 NTA 瓊脂糖 凝膠吸附,但是如果標(biāo)簽折疊在蛋

6、白內(nèi)部不容易暴露,這樣就難純化, 如果鎳瓊脂糖凝膠都不能吸附, 可以在樣品和平衡緩沖液中加 1-2M 脲, 這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對松散, 也許能吸附而蛋白不會(huì)變性, 對于本身就是變 性的蛋白如果 8M 脲不能吸附,改用 6M 鹽酸胍溶解樣品就可以被吸附, 由于鹽酸胍可以翻開脲打不開的結(jié)構(gòu)使得標(biāo)簽?zāi)鼙┞? 當(dāng)然如果有二硫 鍵最好加 1-2mMDTT 也可以更好解決吸附的問題.此外也可以把標(biāo)簽 換到另外一端.2.2.3 緩沖體系, pH 及鹽濃度 對于一些作用力弱的蛋白不能選擇帶氮原子的的一些緩沖體系,如 Tri s-HCl 等,適當(dāng)提升緩沖液 pH 可以增加吸附效果,同樣原理可以降低 pH 洗脫一些咪

7、唑洗不去的雜帶.為防止由于電荷作用的干擾,平衡緩 沖液中需要加 0.1-1M 氯化鈉,而在平衡緩沖液添加 00.1-0.5% 吐溫或 者 triton 可以降低由于疏水相互作用導(dǎo)致的非特異吸附.2.2.4 外表活性劑及其他添加劑 添加一些外表活性劑可以增加蛋白的溶解度, 降低疏水相互作用, 這樣 使純化的結(jié)果更好,在實(shí)驗(yàn)說明在平衡緩沖液中加 0.5-1% 的吐溫可以 使電泳的背景更清楚,雜帶減少.對一些難溶解的樣品也可以加乙醇或 者甘油.在變性條件下有時(shí)會(huì)在樣品中添加復(fù)原劑如巰基乙醇或者二巰 基蘇木糖醇, 它們?nèi)绻麧舛冗^高或者上樣量過大, 會(huì)導(dǎo)致鎳離子復(fù)原甚 至脫落,使填料失效,如果要在這樣的

8、環(huán)境下,那最好選擇螯合價(jià)位高 的填料如鎳 NTA 瓊脂糖凝膠或降低復(fù)原劑的濃度, 通常 1-2mM 是沒問 題的.如果一定要選擇高濃度的復(fù)原劑,也可以把鎳離子還成鈷離子, 它不怕復(fù)原,把普通的鎳瓊脂糖凝膠還成鈷離子即可. 以下是破碎及提取、純化操作和常見問題解決方法： 破碎方法 樣品的處理對純化是很重要的, 重要的原那么是破碎要溫和, 不能使蛋 白斷裂或者降解, 否那么一些片段同樣也帶有標(biāo)簽, 這樣增加了純化的 難度.需要注意的問題是超聲破碎溫度,強(qiáng)度,時(shí)間 大腸桿菌的破碎方法：1 收集培養(yǎng)發(fā)酵液, 4 度 7000-8000g 離心 10 分鐘,收集沉淀的 菌體 如果不是馬上破碎可以放 -7

9、0 度冷凍,但是最好能保存成小塊或 者薄片,這樣好用. 2 取 1-2 克菌體加 10ml 破碎緩沖液 pH7.4 的 50mM 磷酸緩沖液 含 0.5M NaCl , 0.5mg/ml 溶菌酶, 1mM PMSF , 1mM MgCl2 , 1. 7units/ml Benzonase, 其中的菌酶, 1mM PMSF ,1.7units/ml Benz onase 現(xiàn)加在冰上混合 45 分鐘, 如果 pH 不在 7-8,需要用 0.5MNaOH 一邊攪拌一邊滴加 .如果溶菌酶 10mg/ml 混合時(shí)間可以縮短到 10 分鐘 .3) 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎 20 秒種 ,總共四次

10、,中間間隔要保持2分鐘冷卻破碎液,檢測pH,如果不在7-8,還是用0.5M NaOH 一邊攪拌一邊滴加去調(diào) .如果菌體的為 50-500 克,可以高壓破碎的 方法,緩沖液同上 ,體積為 1升,破碎三次,壓力為 800 bar.4) 破碎的液 4 度 12000g 離心 10 分鐘,如果要讓溶液更澄清,可 以 4 度 50000g 離心 30 分鐘,這時(shí)候可以把上清和沉淀分別留樣, 跑電泳,如果只沉淀中有目標(biāo)蛋白,那就用變性條件下去提取.5) 破碎離心的上清加2M咪唑溶液0.12ml使終濃度為20mM,樣 品的總體積為10ml.過柱子的樣品最好過0.45 m的濾膜,防止堵 柱.2 可溶性蛋白的純

11、化1) 平衡緩沖液： pH7.4 的 50mM 磷酸緩沖液含 0.5M NaCl ,含 20m M 咪唑.2) 洗脫緩沖液： pH7.4 的 50mM 磷酸緩沖液含 0.5M NaCl ,含 500 mM 咪唑.3) 取 1ml 鎳瓊脂糖凝膠 FF 或鎳 NTA 瓊脂糖凝膠 FF 預(yù)裝柱,用 10 ml 平衡緩沖液平衡,然后取破碎上清 10ml 樣品以 0.5ml/min 上樣,然 后 2ml/ 管分管收集.4) 用 15ml 平衡緩沖液洗去未吸附的樣品, 流速 1-2ml/min ,2ml/ 管收 集.5) 用 5 ml 洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品, 流速 1-2ml/min ,2ml/ 管

12、收 集.6) 再用 5ml 平衡緩沖液平衡柱子,灌滿 20% 乙醇,封閉,以備下次 使用.7) 此方法是通用的方法,但是未必能得到適合自己蛋白的滿意效果, 所以優(yōu)化的方法是洗脫可以用 50mM ,100mM , 300mM ,500mM 分 階段洗脫,各洗脫 5 個(gè)柱體積,這樣配合電泳檢測,得到適合自己的蛋 白的條件.8) 收集的局部可以用紫外分光光度法、 BCA 法或用考瑪斯亮藍(lán)法測 定蛋白的濃度,再取有蛋白的局部電泳檢測純度.3 常見問題及解決方法1) 蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的 pH ,此外在樣品 中添加一些外表活性劑甚至乙醇等有機(jī)溶劑可以增加疏水性蛋白的溶 解度,防止沉

13、淀.2) 蛋白不吸附：這是最常見的,通常的原因有 1 是標(biāo)簽不暴露,被折 疊在蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi),可以在變性的條件下去純化, 2 可以選擇作用力更 強(qiáng),配基密度更高的填料,通常鎳瓊脂糖凝膠作用力最強(qiáng),如果蛋白分 子量大可以選擇手臂長的填料,如鎳 NTA 瓊脂糖凝膠,填料的好壞可 以看填料的顏色,顏色越深那配基密度越高,作用力也相應(yīng)要強(qiáng). 3 樣 品的 pH 過低或者沉淀導(dǎo)致不能吸附,所以樣品和緩沖液的 pH 要盡量 一致,防止沉淀,通常再偏堿性條件下吸附更好.3) 難洗脫：如果穿透中目標(biāo)蛋白明顯減少,而洗脫又沒有,取點(diǎn)填料 加電泳緩沖液煮后離心跑電泳還是有目標(biāo)蛋白, 可以用更強(qiáng)的洗脫條件 如 500

14、mM 咪唑,如果還不能洗脫,可以直接用 500mM 咪唑加到 6M 鹽酸胍去洗脫.4) 電泳雜帶多：由于這種親和畢竟特異性要差點(diǎn),原因在蛋白中帶組 氨酸,色氨酸,半胱氨酸等很常見,特別是蛋白折疊會(huì)導(dǎo)致幾個(gè)這樣的 氨基酸殘基臨近, 這樣也會(huì)使它們和鎳柱的作用力增加,因此可以用不 同濃度的咪唑階段洗脫, 此外在咪唑洗脫前增加一步 0.5M pH5 的醋酸 緩沖液洗脫,在平衡緩沖液中添加 0.5% 吐溫或 Triton 可以防止由于疏 水相互作用導(dǎo)致非特異吸附, 這樣可以電泳的雜帶明顯減少, 但是如果 用這樣的方法還是雜帶多, 那就地回頭去看看破碎的條件是不是太劇烈 或者溫度限制不好導(dǎo)致蛋白短裂或者

15、分解導(dǎo)致一些蛋白片段帶標(biāo)簽, 或 者由于樣品長時(shí)間保存導(dǎo)致水解等,總之純化的好壞決定于每一個(gè)步 驟,不僅僅是純化的問題.還有一個(gè)不容忽略的問題是有時(shí)候由于蛋白 相互作用或者由于形成聚合體導(dǎo)致雜帶增加, 而由于疏水相互作用或者 由于離子作用可以通過添加外表活性劑或者增加離子強(qiáng)度得到改善, 對 于由于形成聚合體的可以在緩沖液和樣品中加 1-2mM 巰基乙醇防止, 如果這樣的情況下最好是選擇鎳 NTA 瓊脂糖凝膠,由于它在復(fù)原劑下 更穩(wěn)定.包涵體蛋白的純化及復(fù)性包涵體破碎1、大腸桿菌的破碎方法：1收集培養(yǎng)發(fā)酵液,4度7000-8000g離心10分鐘,收集沉淀的菌體如果不是馬上破碎可以放 -70 度冷

16、凍,但是最好能保存成小塊或者薄 片,這樣好用.2 取 1-2 克菌體加 10ml 破碎緩沖液pH8.5 50mM Tris-HCI , 2mMEDTA, 100mM NaCl,0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶.在冰上混合 45 分鐘.3 把混合菌體在冰水中用超聲探頭破碎 20秒種,總共四次,中間間隔要 保持2分鐘冷卻破碎液,檢測pH,如果不在8.5,還是用1M Tris溶液一邊 攪拌一邊滴加去調(diào) .如果菌體的為 50-500 克,可以高壓破碎的方法 ,緩沖 液同上 ,體積為 1 升,破碎三次 ,壓力為 800 bar.4 破碎的液4度12000g離心10分鐘,如果要讓

17、溶液更澄清,可以4 度 50000g 離心 30 分鐘,這時(shí)候可以把上清和沉淀分別留樣,跑電泳, 如果只沉淀中有目標(biāo)蛋白,那就用變性條件下去提取.5 破碎離心的沉淀用4M清洗包涵體,再離心得沉淀加pH7.4的50 mM 磷酸緩沖液含 0.5M NaCl , 8M 脲, 20mM 咪唑.過柱子的樣品 最好過0.45 um的濾膜,防止堵柱.4 包涵體蛋白的純化1 平衡緩沖液：pH7.4 的 50mM 磷酸緩沖液含 0.5M NaCl, 8M 脲,20mM 咪唑2 洗脫緩沖液：pH7.4 的 50mM 磷酸緩沖液含 0.5M NaCl, 8M 脲,含 500mM 咪唑3 取 1ml 鎳瓊脂糖凝膠 F

18、F 或鎳 NTA 瓊脂糖凝膠 FF 預(yù)裝柱,用 10 ml 平衡緩沖液平衡,然后取破碎上清 10ml 樣品以 0.5ml/min 上樣,然 后 2ml/ 管分管收集.4) 用 15ml 平衡緩沖液洗去未吸附的樣品, 流速 1-2ml/min ,2ml/ 管收 集.5) 用 5 ml 洗脫緩沖液洗去未吸附的樣品, 流速 1-2ml/min ,2ml/ 管收 集.6) 再用 5ml 平衡緩沖液平衡柱子,灌滿 20% 乙醇,封閉,以備下次 使用.7) 此方法是通用的方法,但是未必能得到適合自己蛋白的滿意效果, 所以優(yōu)化的方法是洗脫可以用 50mM ,100mM , 300mM ,500mM 分 階段

19、洗脫,各洗脫 5 個(gè)柱體積,這樣配合電泳檢測,得到適合自己的蛋 白的條件.8) 收集的局部可以用紫外分光光度法、 BCA 法或用考瑪斯亮藍(lán)法測 定蛋白的濃度,再取有蛋白的局部電泳檢測純度.9) 其問題和解決方法可以參考可溶性蛋白的純化的相關(guān)內(nèi)容. 復(fù)性十分復(fù)雜,所以建議參考文獻(xiàn)和一些專門的論述. 常見問題及解決方法1) 不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的 pH ,此外在樣品中添 加一些外表活性劑甚至乙醇等有機(jī)溶劑可以增加疏水性蛋白的溶解度, 對于帶半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀,所以需要加 2-5mM 巰 基乙醇防止沉淀.2) 白不吸附：這是最常見的,通常的原因有 1 是標(biāo)簽不暴露,被折疊 在蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi), 可以在變性的條件下去純化, 如果用脲變性吸附不好, 可以改用鹽酸胍,個(gè)人經(jīng)驗(yàn)是這樣通常可以使吸附不上的蛋白得到改 善,順利純化. 2 可以選擇作用力更強(qiáng),配基密度更高的填料,通常鎳 瓊脂糖凝膠作用力最強(qiáng), 如果蛋白分子量大可以選擇手臂長的填料,如 鎳 NTA 瓊脂糖凝膠,填料的好壞可以看填料的顏色,顏色越深那配基 密度越高,作用力也相應(yīng)要強(qiáng).