分子生物學實驗設計蠶豆病

1、分子生物學實驗設計蠶豆病分子生物學實驗設計蠶豆病2021/4/272案例：案例： 患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。臨床表現(xiàn)：臨床表現(xiàn)： 體格檢查：體溫38，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無叩擊痛，神經系統(tǒng)檢查未及異常。2021/4/273病例樣本病例樣本標準值標準值意義意義紅細胞紅細胞1.981012/L 4.34.51012/L 血紅蛋白血紅蛋

2、白53g/L 170-200 g/L 血清總蛋白血清總蛋白85.5mol/L 5.1318.8mol/L 結合膽紅素結合膽紅素13.7mol/L 1.716.84mol/L 未結合膽紅素未結合膽紅素71.8mol/L 3.4211.96mol/L 尿蛋白尿蛋白（+） () 輕度蛋白尿輕度蛋白尿潛血潛血(+) () 血管內溶血血管內溶血尿膽紅素尿膽紅素() () 尿膽原素尿膽原素(+) 少量少量 實驗室檢查：實驗室檢查：2021/4/2741 1、根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初、根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初 步判斷患兒是何種疾?。坎脚袛嗷純菏呛畏N疾??？2 2、請設計實驗進一步明

3、確診斷。、請設計實驗進一步明確診斷。3 3、從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢、從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果。查結果。必答題：必答題：5 5、 患者體型瘦小與該病癥是否有關，為患者體型瘦小與該病癥是否有關，為什么？什么？選答題：選答題：2021/4/275惡心、嘔吐、面色蒼白惡心、嘔吐、面色蒼白 皮膚及鞏膜黃染皮膚及鞏膜黃染 紅細胞紅細胞 1.981012/L 血紅蛋白血紅蛋白53g/L 血清總膽紅素血清總膽紅素85.5mol/L 尿蛋白（尿蛋白（+） 尿膽紅素尿膽紅素() 尿膽素原尿膽素原(+) 尿液鏡下未見紅細胞尿液鏡下未見紅細胞 黃疸黃疸紅細胞膜不完整，已破裂紅細胞膜

4、不完整，已破裂紅細胞含量少紅細胞含量少含量明顯增加含量明顯增加血紅蛋白量減少血紅蛋白量減少排尿呈醬油樣色排尿呈醬油樣色游離膽紅素增加游離膽紅素增加溶血性黃疸溶血性黃疸初步診斷為：紅細胞葡萄糖初步診斷為：紅細胞葡萄糖-6-6-磷酸磷酸脫氫酶（脫氫酶（G6PDG6PD）缺乏癥（蠶豆?。┤狈ΠY（蠶豆?。┠c肝循環(huán)增多腸肝循環(huán)增多1.1.根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初步判斷患根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查，初步判斷患兒是何種疾病？兒是何種疾病？ 癥狀癥狀正常紅細胞正常紅細胞溶血性貧血溶血性貧血 紅細胞紅細胞2021/4/276蠶豆病簡介蠶豆病簡介l蠶豆病是一種6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-P

5、D）缺乏所導致的疾病，表現(xiàn)為在遺傳性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PD）缺陷的情況下，食用新鮮蠶豆后突然發(fā)生的急性血管內溶血。 易發(fā)人群易發(fā)人群l多見于兒童，男性患者約占90%以上。 發(fā)病機制發(fā)病機制G6PD NADPH+H+ GSH 紅細胞的抗紅細胞的抗 氧化能力氧化能力發(fā)生溶血發(fā)生溶血左：健康新生兒左：健康新生兒右：溶血性貧血患兒右：溶血性貧血患兒（黃疸）（黃疸）2021/4/277早期有惡寒、微熱、頭昏、倦怠無力、食欲缺乏、腹痛，繼之出現(xiàn)黃疸、貧血、血紅蛋白尿，尿呈醬油色，此后體溫升高，倦怠乏力加重，可持續(xù)3日左右。與溶血性貧血出現(xiàn)的同時，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和腹痛加劇，肝臟腫大，肝功能異常

6、，約50%患者脾腫大。嚴重病例可見昏迷、驚厥和急性腎衰竭，若急救不及時常于12日內死亡。 主要臨床表現(xiàn)：主要臨床表現(xiàn)：2021/4/2782 2、設計實驗進一步明確診斷。、設計實驗進一步明確診斷。貧血、黃疸有和無遺傳史無或有誘因（食用蠶豆、服用藥物、感染）體征：脾腫大、黃疸血常規(guī)檢查血清學檢查檢查HA的病因G6PD篩選試驗G6PD確診試驗Hb、網(wǎng)織紅細胞間接膽紅素尿膽原游離Hb結合珠蛋白懷疑其他HA,相應病因檢測結果正常G6PD熒光斑點試驗紅細胞G6PD活性測定G6PD基因分析其他篩選試驗高鐵血紅蛋白還原試驗初診或確診G6PD缺陷癥確診溶貧（血管內溶血）確診G6PD做1項或2項做1項2021/

7、4/279高鐵血紅蛋白還原試驗篩選試驗確診試驗G6PD熒光斑點試驗紅細胞G6PD活性測定實驗名稱：實驗名稱：2021/4/2710高鐵血紅蛋白還原試驗高鐵血紅蛋白還原試驗實驗一實驗一2021/4/2711實驗原理實驗原理 在全血中加入亞硝酸鈉，使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白在全血中加入亞硝酸鈉，使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白（氧化為高鐵血紅蛋白（MHb）,高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白在在高鐵血紅蛋高鐵血紅蛋白還原酶白還原酶的作用下又被還原為的作用下又被還原為亞鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白。在這過程中，。在這過程中，高鐵血紅蛋白還原酶不僅需要高鐵血紅蛋白還原酶不僅需要亞甲藍亞甲藍作為遞氫體，還需要作

8、為遞氫體，還需要由由G6PD參與磷酸戊糖途徑形成參與磷酸戊糖途徑形成NADPH作為輔酶才完成上作為輔酶才完成上述反應。所以，述反應。所以，G6PD缺陷癥的患者其缺陷癥的患者其MHb還原率下降還原率下降（分光光度技術）（分光光度技術）亞鐵血紅蛋白亞鐵血紅蛋白NADPH(輔酶輔酶) 亞甲藍亞甲藍(遞氫體遞氫體) 高鐵血紅蛋白還原酶高鐵血紅蛋白還原酶高鐵血紅蛋白高鐵血紅蛋白（實驗方向）2021/4/2712 0.18mol/L亞硝酸鈉-葡萄糖溶液、 0.4mmol/L亞甲藍溶液 、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液、混合液 （等量+）、生理鹽水、抗凝劑紫外分光光度計水浴箱、離心機、試管3支 主要試

9、劑和儀器主要試劑和儀器 主要試劑：主要試劑：儀器：儀器：2021/4/2713實驗操作流程實驗操作流程取靜脈血1. 8mL 于抗凝管，混勻抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝劑+葡萄糖20 mg)離心沉淀 1000 r/ min 15 min調整 血細胞 血漿=1 1 ，混勻 調整后全血（備用）1ml 0. 18 mol/ L 亞硝酸鈉1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 1ml 0.14 mmol/ L 亞甲基藍液混勻 混合試劑混合試劑（備用）2021/4/2714取試管3 支,標上A、B、S ,按下表加入試劑高鐵血紅蛋白還原試驗操作步驟混合試劑/ mL 0. 01 /

10、 /生理鹽水/ mL / 0. 01 /0. 18 mol/ L 亞硝酸鈉- / / 0. 010. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 經調整的全血/ mL 0. 1 0. 1 0. 1來回搖動1520 次,置37 水浴箱靜置3 h蒸餾水 10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml 試劑 A B SB管為空白管, 在波長635 nm處，測定“A”管及“S”管吸光度2021/4/2715計算高鐵血紅蛋白還原率公式：MHb % = (1 - A/ S) 100 % 2021/4/2716注意事項注意事項1、血細胞比容比值過低，高鐵血紅蛋白還原率降低。 應將血細胞比容調整到0.35-0

11、.402、細菌污染可產生亞硝酸鹽而造成假陽性，試管等 應無菌3、不穩(wěn)定Hb、高脂血癥等均可出現(xiàn)假陽性結果， 故應2h內送檢4、標本不應有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在標本內應適當加入葡萄糖，以避免較全血缺乏2021/4/2717結果分析方法結果分析方法正常值：MHb還原率=75%，臍血=77% 臨床診斷：純合子和半合子（XY）患者： MHb還原率 30% 臍血 40% 雜合子患者： MHb還原率 31%74% 臍血 41%76%2021/4/2718實驗二實驗二G6PD熒光斑點試驗熒光斑點試驗2021/4/2719實驗原理實驗原理 葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖

12、（6PGA）,同時使NADP轉變?yōu)镹ADPH,后者在340nm波長紫外線照射下產生熒光（反應原理如下圖）。所以將含有G6P和NADP等的混合試劑與血混勻后在0分鐘、5分鐘、10分鐘分別取1滴血到濾紙上，通過觀察濾紙上有熒光出現(xiàn)時間可判斷G6PD活性 G6P6PGAG6PD NADPNADPH2021/4/2720 反應液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸鹽緩沖液3份和蒸餾水3份混勻長波紫外燈、濾紙、水浴箱主要試劑和儀器主要試劑和儀器 試劑：試劑：儀器：儀器：2021/4/2721實驗操作流程實驗操作流程取試管，加10l全血+100l反應液，混勻，取一滴于濾紙上（第一斑點 ）作為

13、對照將上液置于37水浴10min ，再取一小滴滴于濾紙上（第二斑點）實驗組 晾干后，于長波紫外燈下（365nm）觀察結果，計時 根據(jù)結果作出相應診斷2021/4/2722注意事項注意事項1、檢測的第一點作為實驗對照應無熒光或弱熒光出現(xiàn)2、每次試驗應用正常標本（已知G-6-PD正常）作陰 性對照。如可能選用已知G-6-PD缺乏者的標本作 陽性對照3、如貧血嚴重取血量應相應加大，或用紅細胞混懸液 進行檢驗4、為提高敏感性可在反應液中加入1份8.0mmol/L GSSG2021/4/2723結果分析結果分析正常人： 0min斑點無熒光，5-10min出現(xiàn)， 10min熒光最強臨床診斷： 輕度缺陷者：

14、0-10min熒光很弱或不出現(xiàn) 中度缺陷者：10-30min出現(xiàn)熒光 嚴重缺陷者：30min內不出現(xiàn)熒光2021/4/2724實驗三實驗三紅細胞紅細胞G6PD活性測定活性測定2021/4/2725實驗原理實驗原理 基本原理同G6PD熒光斑點實驗。不同的是利用紫外光分光光度法定量測定酶活性，即每隔一分鐘在340nm波長測定孵育液中NADPH吸光度（測6次），求每分鐘吸光度增加的平均值，根據(jù)單位時間內NADPH生成由于所用試劑及體系的不同。方法：WHO推薦的Zinkham;NBT定量法等2021/4/2726 生理鹽水、溶血素 、3.8mmol/L NADP 、0.5mol/L Tris緩沖液（p

15、H7.5） 、0.63mol/L氯化鎂溶液 、33mmol/L G-6-P液 紫外分光光度計水浴箱、離心機、試管 主要試劑和儀器主要試劑和儀器試劑：試劑：儀器：儀器：2021/4/2727實驗流程實驗流程取抗凝血2ml，生理鹽水洗滌紅細胞3次（1500r/min離心 10min）除去上清液和乳白層（白細胞和血小板）加等體積生理鹽水紅細胞懸液紅細胞懸液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min 溶血液并測定其Hb濃度進行比色 （見下表）2021/4/2728 G-6-PD活性測定的操作表（Zinkham法 )試管 對照管 測定管 NADP液（ml） 0.1 0.1Tris液（ml） 0

16、.1 0.1氯化鎂液（ml） 0.1 0.1蒸餾水（ml） 0.68 0.58G6P液（ml） 0.1 37預熱溶血液（l） 20 20立即340nm處測吸光度，以對照管調零，37恒溫，每分鐘觀察1次，記錄吸光度的變化2021/4/2729計算公式：G-6-PD活性（U/gHb） =A/min1000/6.221020/20 Hb(gL-1) A/min:每min吸光度的平均變化值1000/6.22:為微摩爾消光系數(shù)1020/20:總容量與溶血液的量之比； 2021/4/2730注意事項注意事項 1、急性溶血期后23個月再查或復查G6PD活性 2、最好同時作陰性對照和陽性對照（影響因素多） 3

17、、離心沉底后應取底層紅細胞測定 G6PD活性2021/4/2731結果分析結果分析G6PD缺陷者： G6PD活性較正常平均值低40%以上即可作出診斷方法 正常值范圍WHO推薦的Zinkham （12.012.09)IU/gHb(37)ICSH推薦的Glock與McLoan法 （8.341.59）IU/gHb(37) NBT定量法 （13.130.0）NBT單位Chapman和Dern法 （2.87.31）IU/gHb(25)2021/4/2732根據(jù)實驗結果根據(jù)實驗結果該男孩患蠶豆病該男孩患蠶豆病2021/4/27333.從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實驗室檢查結果。從生化代謝解釋患兒的臨床表

18、現(xiàn)和實驗室檢查結果。 細胞膜的破壞膽紅素的異常342021/4/27 紅細胞膜的破壞紅細胞膜的破壞n葡萄糖磷酸戊糖途徑葡萄糖磷酸戊糖途徑葡萄糖葡萄糖 6 磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+磷酸化磷酸化5 磷酸核糖磷酸核糖磷酸磷酸戊糖途徑戊糖途徑NADPH + H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+5 磷酸核糖磷酸核糖NADPH + H+NADPH維持維持GSH(谷胱甘肽）的正常含量和還原狀態(tài)谷胱甘肽）的正常含量和還原狀態(tài)G6PD (6 磷酸葡萄糖脫氫酶）磷酸葡萄糖脫氫酶）起關鍵作用起關鍵作用352021/4/27n還原型谷胱甘肽 體內重要的抗氧化劑 保護紅細胞膜蛋白的完整性 紅細胞膜的破壞紅細胞膜的破壞單核吞噬細單核吞噬細胞識別吞噬胞識別吞噬血紅蛋白血紅蛋白氧化破壞氧化破壞血紅素血紅素珠蛋白珠蛋白紅細胞紅細胞362021/4/27 單核吞噬細單核吞噬細胞識別吞噬胞識別吞噬血紅蛋白血紅蛋白珠蛋白珠蛋白氧化破壞氧化破壞紅細胞紅細胞氧化破壞氧化破壞紅細胞紅細胞單核吞噬細單核吞噬細胞識別吞噬胞識別吞噬紅細胞紅細胞血紅蛋白血紅蛋白單核吞噬細單核吞噬細胞識別吞噬胞識別吞噬紅細胞紅細胞珠蛋白珠蛋白血紅蛋白血紅蛋白單核吞噬細單核吞噬細胞識別吞噬胞識別吞噬紅細胞紅細胞血紅素血紅素珠蛋白珠蛋