第一節(jié) 第二節(jié)核酸的凝膠電泳

1、核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 它是一種分析鑒定重組它是一種分析鑒定重組DNA分子及分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，同時也是分子生物學(xué)研究方法的段，同時也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。技術(shù)基礎(chǔ)。 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。它是一種出的線性多糖聚合物。它是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。小決定于瓊脂糖的濃度。分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMPLMP

2、）瓊脂糖。）瓊脂糖。 1. 1. 將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于自動成像系統(tǒng)將電泳完畢的瓊脂糖凝膠置于自動成像系統(tǒng) 的平臺中間；的平臺中間；2. 2. 開通紫外光，可見到發(fā)出熒光的開通紫外光，可見到發(fā)出熒光的DNADNA條帶，在條帶，在 電腦中觀察圖像；電腦中觀察圖像；3. 3. 關(guān)上紫外光電源，在電腦中編輯和保存圖像；關(guān)上紫外光電源，在電腦中編輯和保存圖像；4. 4. 根據(jù)圖像判定結(jié)果。根據(jù)圖像判定結(jié)果。結(jié)果分析結(jié)果分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA相對遷移距離推測待測定的DNA片段的大小Agarose gel electrophoresis 7 7 電泳緩沖液電泳緩沖液 常用的有常用的有TAETAE、TPET

3、PE及及TBETBE 都是常用電泳緩沖液。三者相比：都是常用電泳緩沖液。三者相比：1 1）TAETAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；花費(fèi)稍貴，但有高得多的緩沖容量；3 3）雙鏈線狀雙鏈線狀DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中遷移快中遷移快10%10%；4 4）對于高分子質(zhì)量的對于高分子質(zhì)量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或T

4、PETPE，對于低分子質(zhì)量的對于低分子質(zhì)量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的電泳分辨率要好于中的電泳分辨率要好于TBETBE。 載樣緩沖液：載樣緩沖液：臨上樣到臨上樣到凝膠加樣孔凝膠加樣孔之前與待之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個作用：載樣緩沖液有三個作用：1 1）增加樣品密度保證）增加樣品密度保證DNADNA沉入加樣孔內(nèi)；沉入加樣孔內(nèi)；2 2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3 3）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速

5、率向陽極遷移。率向陽極遷移。 通過染色通過染色, 紫外燈下檢測。紫外燈下檢測。 主要有溴化乙錠（主要有溴化乙錠（ethidium bromide, EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。 觀察瓊脂糖凝膠中觀察瓊脂糖凝膠中DNA最常用的方法是利用熒光染料溴最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色，溴化乙錠含有一個可以嵌化乙錠進(jìn)行染色，溴化乙錠含有一個可以嵌DNA堆積堿基之堆積堿基之間的一個間的一個三環(huán)平面基團(tuán)三環(huán)平面基團(tuán)。它與。它與DNA的結(jié)合幾乎沒有堿基序列的結(jié)合幾乎沒有堿基序列特異性。特異性。 在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，大在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，大約每約每2.52.5

6、個堿基個堿基插入一個溴化乙錠插入一個溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過范德華力范德華力與上下堿基相互作用。與上下堿基相互作用。這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基這個基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與的密切接近，導(dǎo)致與DNADNA結(jié)合的結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。離溶液中染料有所增加。DNADNA吸吸收收254nm254nm處的紫外輻射并傳遞給處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm302nm和和366nm3

7、66nm的光輻射。這兩的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區(qū)的光譜紅橙區(qū)的590nm590nm處重新發(fā)射處重新發(fā)射出來。由于溴化乙錠出來。由于溴化乙錠-DNA-DNA復(fù)合復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合物的熒光產(chǎn)率比沒有結(jié)合DNADNA的的染料高出染料高出20-3020-30倍，所以當(dāng)凝膠中倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（含有游離的溴化乙錠（0.5ug/ml0.5ug/ml）時，可以檢測到少至?xí)r，可以檢測到少至10ng10ng的的DNADNA條帶條帶。 可以用透射或入射紫外光對可以用透射或入射紫外光對EBEB染色的凝染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計算

8、機(jī)觀察。膠成像，圖像可以直接輸出到計算機(jī)觀察?，F(xiàn)一般采用試劑盒回收：現(xiàn)一般采用試劑盒回收： 存在的主要問題：存在的主要問題：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA （一）（一） 聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖脈沖電場電泳示意圖PFGE can resolve large DNA fragmentsA-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)箝位勻強(qiáng)電場系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+核酸雜交常用幾種膜的核酸雜交常用幾種膜的性能比較性能比較（a）（b）（c）（d）（e）基因組基因組DNADNA限制片段限制