第04章標記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備

1、第一章第一章 血液標本采集與處理血液標本采集與處理臨床免疫學檢驗技術(shù)第四章第四章 標記物及其與抗原抗體的標記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備結(jié)合物制備汪汪 付付 兵兵/R20107 目 錄第一節(jié) 標記物種類及特性第二節(jié) 常見交聯(lián)劑的種類及特性第三節(jié) 放射性核素與抗原抗體結(jié)合物制備第四節(jié) 熒光素與抗原抗體結(jié)合物制備第五節(jié) 酶與抗原抗體結(jié)合物制備第六節(jié) 化學發(fā)光劑與抗原抗體的結(jié)合物制備第七節(jié) 稀土離子與抗原抗體的結(jié)合物制備第八節(jié) 量子點與抗原抗體的結(jié)合物制備第九節(jié) 膠體金與抗原抗體的結(jié)合物制備第一節(jié)第一節(jié) 標記物的種類及特性標記物的種類及特性重點提示放射性核素熒光物質(zhì)酶和酶作用底物化學發(fā)光劑量子點膠體

2、金第一節(jié) 標記物的種類及特性標記標記免疫技術(shù)免疫技術(shù) = = 免疫技術(shù)免疫技術(shù) + + 標記技術(shù)標記技術(shù) 抗原抗體反應(yīng)示蹤標記物示蹤標記物高特異性高靈敏性精密儀器檢測高精密性既可以與抗原或抗體相結(jié)合，既可以與抗原或抗體相結(jié)合，又可以被相應(yīng)的儀器所檢測又可以被相應(yīng)的儀器所檢測的物質(zhì)，這就是標記物的物質(zhì)，這就是標記物標記物在免疫分析中標記物在免疫分析中的作用在于示蹤標記的作用在于示蹤標記并能夠被檢測并能夠被檢測一、放射性核素是指在自然條件自然條件下可發(fā)生自發(fā)性的轉(zhuǎn)化，由一種放射性核素轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N放射性核素，并同時釋放射線同時釋放射線，這一轉(zhuǎn)變過程稱為放射性衰變。依衰變方式分為：、。一、放射性核素常

3、用標記核素 125I 3H 理化性理化性 活潑活潑 差差標記方法標記方法 簡單簡單 復(fù)雜復(fù)雜對標記物對標記物免疫活性的影響免疫活性的影響 小小 大大射線射線 半衰期半衰期 60d 12.3y60d 12.3y測量條件測量條件 簡單簡單 復(fù)雜復(fù)雜放射性核素125I特點化學性質(zhì)較活潑，標記方法簡單，容易獲取高比活性的標 記結(jié)合物；衰變過程不產(chǎn)生電離輻射強的射線，對標記多肽，蛋白抗原分子的免疫活性影響小；衰變過程中釋放射線，可用計數(shù)器測量，方法簡便，易推廣應(yīng)用；半衰期(60天)適中、核素豐度(95)及計數(shù)率相對較高。二、二、熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)有機化合物熒光素稀土離子螯合物熒光底物（酶作用后產(chǎn)生熒光的物

4、質(zhì)）熒光素熒光素異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）四乙基羅丹明（rhodamine, RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC）藻紅蛋白(phycoerthrin, PE)常用的熒光素特性熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大吸收光譜最大發(fā)射光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用應(yīng)用異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm （黃綠（黃綠色）色）FATFAT、熒光偏振免疫測、熒光偏振免疫測定定四乙基羅丹明四乙基羅丹明

5、 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙紅色）（橙紅色）FITCFITC的襯比染色或雙的襯比染色或雙標記標記FATFAT四甲基異硫氰酸四甲基異硫氰酸羅丹明羅丹明 (TRITC)(TRITC)550nm550nm620nm620nm（橙紅色）（橙紅色）FITCFITC的襯比染色或雙的襯比染色或雙標記標記FATFAT藻紅蛋白（藻紅蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（紅色）（紅色）雙標記雙標記FATFAT、流式細胞、流式細胞術(shù)術(shù)稀土離子鑭系元素屬于三價稀土離子，包括銪（Eu3+）、釤（Sm3+）、鋱(Tb

6、3+)、釹（Nd3+）、鏑（Dy3+）和鈰(Ce3+)等。銪是標記抗原抗體應(yīng)用最廣的元素。游離的稀土離子熒光比較弱，但與適當?shù)尿蟿┤?萘甲酰三氟丙酮（-NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA）等形成螯合物后，可使熒光得到增強。稀土離子的熒光特性熒光特性如下：具有較大的Stokes位移，發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不會相互重疊。熒光壽命長，熒光半衰期介于10-1000s之間。激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光譜帶很窄，甚至不到10nm。其他熒光物質(zhì)其他熒光物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，但經(jīng)酶催化后便具有強熒光。如4-甲基傘酮-D半乳糖苷，受-半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲基傘酮，可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，

7、發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物（4-甲基傘酮磷酸鹽）和辣根過氧化物酶的底物（對羥基苯乙酸）等，都具有熒光底物的性質(zhì)。三、酶和酶作用底物常用的酶標記物有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)- 半乳糖苷酶(-galactosidase, -Gal) 每種酶可與相應(yīng)的顯色或發(fā)光底物作用，產(chǎn)生典型每種酶可與相應(yīng)的顯色或發(fā)光底物作用，產(chǎn)生典型的有色反應(yīng)物或化學發(fā)光反應(yīng)，通過反應(yīng)的顏色或發(fā)光的有色反應(yīng)物或化學發(fā)光反應(yīng)，通過反應(yīng)的顏色或發(fā)光強度對被檢物進行定性、定量分析強度對被檢物進行定性、定

8、量分析。辣根過氧化物酶HRP辣根過氧化物酶（辣根過氧化物酶（HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)主酶與酶活性無關(guān) 輔基是酶的活性中心輔基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm （輔基）（輔基）與與275nm275nm（主酶）（主酶） ODOD值之比值之比 RZRZ值與酶活性無關(guān)，值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比酶活性單位比RZRZ值值更為重要更為重要 ELISAELISA中應(yīng)用最為廣中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶泛的標記用酶 堿性磷酸酶ALP及-半乳糖苷酶半乳糖苷酶堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（APAP） 菌源性菌源性AP AP 腸粘膜

9、腸粘膜APAP 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal） 用于均相酶用于均相酶免疫測定免疫測定 HRP底物HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氫體供氫體DHDH2 2習慣上被稱為底物，底物有多種習慣上被稱為底物，底物有多種 H H2 2O O2 2為受氫體，為受氫體，HRPHRP對受氫體的專一性很高對受氫體的專一性很高 鄰苯二胺鄰苯二胺 OPDOPD四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺 TMBTMB5-5-氨基水楊酸氨基水楊酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺

10、酸唑啉磺酸-6)-6)銨鹽銨鹽 ABTSABTS常用底物常用底物OPDOPD反應(yīng)后顯橙黃反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，應(yīng)后呈棕黃色，測定波長測定波長492nm492nm。不穩(wěn)定，致癌性。不穩(wěn)定，致癌性。TMBTMB反應(yīng)后顯藍色反應(yīng)后顯藍色 ，加酸終止反應(yīng)后變加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色為黃色, ,測定波長測定波長450nm 450nm ，穩(wěn)定，無，穩(wěn)定，無致癌性，致癌性，ELISAELISA中應(yīng)中應(yīng)用最廣泛的底物。用最廣泛的底物。 HRPHRP的常見底物的常見底物 對羥基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，HPA）HPA具有熒光底物性質(zhì)，在H2O2存

11、在下被HRP氧化成二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長的熒光。H2O2HRP+熒 光COOHHOCHCOOHHOCH22氧化二聚體ALP底物常用的常用的ALPALP色原底物色原底物對-硝基苯磷酸鹽（p-nitrophenyl phosphate，PNP）氯化硝基四氮唑藍/ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽（nitro- blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate，BCIP/ NBT）4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-methylumbelliferyl phosphate，4-MUP）是ALP的發(fā)光底物之一。

12、ALPALP的的底物底物 對對- -硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（ pNPP pNPP ）經(jīng)經(jīng)APAP作用后的產(chǎn)物為黃色對作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm405 nm。 常用底物常用底物BCIP/ NBT常用于ELISPOT中的PVDF膜顯色，在ALP的催化作用下，BCIP被水解生成強反應(yīng)性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物與NBT發(fā)生反應(yīng)，形成不溶性的深藍色至藍紫色沉淀4-MUP被AP催化生成4-甲基傘形酮，在360nm的激發(fā)光的作用下，發(fā)出450nm的熒光，可用熒光光度計進行測量。熒光AP 360nm激發(fā)光H3PO4 +- Gal 熒光底物-Gal-Gal的底物的底

13、物 4-4-甲基傘酮基甲基傘酮基-D-D半半- -乳糖苷乳糖苷（ 4MUG 4MUG ）酶作用后，生成高強度酶作用后，生成高強度熒光物熒光物 ，用熒光計測，用熒光計測量。量。常用4-甲基傘酮基-D半乳糖（4-methylumbellifery-D-galactoside，4-MUG）作為底物，酶促反應(yīng)后，產(chǎn)生高強度熒光物質(zhì)4-甲基傘形酮（4-MU）。四、化學發(fā)光劑在化學發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。直接化學發(fā)光劑酶促反應(yīng)發(fā)光劑直接化學發(fā)光劑直接化學發(fā)光劑直接化學發(fā)光劑 直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作

14、用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們在化學結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。吖啶酯在堿性條件下與H2O2 就可產(chǎn)生化學發(fā)光現(xiàn)象。在堿性介質(zhì)中氧化時，這些化合物經(jīng)歷共價鍵的斷裂，經(jīng)過一個二氧酮的中間體，產(chǎn)生電激發(fā)的N-甲基吖啶酮，當它恢復(fù)到基態(tài)時，在430nm出釋放出光子。 AE特性化學發(fā)光反應(yīng)簡單，無需催化劑，背景噪聲低。極其穩(wěn)定，如2-甲基吖啶酯，因其獨特的結(jié)構(gòu)使其有效期長達1 年甚至更久。發(fā)光過程快速，1秒內(nèi)光子散射達高峰，整個過程在2秒內(nèi)完成。電化學發(fā)光劑是指通過在電極表面進行電化學反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。特點：反應(yīng)在電極進行； 電子供體為：三丙胺（TPA） 化學發(fā)光劑：三聯(lián)毗啶釕三聯(lián)

15、毗啶釕三聯(lián)毗啶釕分子結(jié)構(gòu)圖分子結(jié)構(gòu)圖NNNNNNRuOONOO電化學發(fā)光劑酶促反應(yīng)發(fā)光劑酶促反應(yīng)發(fā)光劑：酶促反應(yīng)發(fā)光劑：是利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。魯米諾及其衍生物魯米諾及其衍生物 AMPPDAMPPD魯米諾及其衍生物魯米諾發(fā)光原理魯米諾及其衍生物魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理 AMPPDAMPPD3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷五、量子點量子點 QDs量子點(quantimim dots, QDs)即半導(dǎo)體納米粒子，是指半徑小于或接近于激子玻爾半徑的半導(dǎo)體納米晶粒（1-10nm）。由I

16、I-VI族或III-V族元素組成，性質(zhì)穩(wěn)定，可接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光，具有類似體相晶體的規(guī)整原子排布。廣義的量子點還包括 IV-VI 族、V-VI 族元素組成的納米晶，以及金簇、銀簇、硅點、碳點、復(fù)合型熒光納米顆粒等。量子點的光學特性熒光強度高，穩(wěn)定性好，抗漂白能力強熒光強度高，穩(wěn)定性好，抗漂白能力強所謂光漂白是指由光激發(fā)引起發(fā)光物質(zhì)分解而使熒光強度降低的現(xiàn)象。有機熒光色素的光漂白速率很快，而量子點的光漂白作用則小得多。具有具有“調(diào)色調(diào)色”功能，一元激發(fā)多元發(fā)射功能，一元激發(fā)多元發(fā)射不同粒徑的量子點具有不同的顏色，可用同一波長的光激發(fā)不同大小的量子點，獲得多種標記顏色。激發(fā)光波長寬，而發(fā)射光波長窄

17、激發(fā)光波長寬，而發(fā)射光波長窄量子點的激發(fā)光波長范圍很寬，具有較大的Stokes位移和狹窄對稱的熒光譜峰。量子點調(diào)色功能在紫外光激發(fā)下，相同組成不同粒徑的量子點的發(fā)射光譜量子點的制備大致分為兩種方法：物理制備法、化學合成法。物理制備法物理制備法可制得粒徑易控的量子點，但所需實驗設(shè)備昂貴，廣泛使用受限?；瘜W合成法化學合成法有水相和有機相合成法有機相體系 可制備性能優(yōu)良的量子點，如 CdSe及CdSe/ZnS。 量子點分散性好、穩(wěn)定性高、不易沉積，但水溶性太差。水相體系 操作簡單、成本低廉、量子點表面形貌及性質(zhì)可控、易修飾各種基團。量子點表面修飾無機殼層修飾法和化學修飾法是兩種常用的量子點修飾無機殼

18、層修飾法和化學修飾法是兩種常用的量子點修飾方法方法。無機殼層修飾法無機殼層修飾法合成核/殼結(jié)構(gòu)的量子點，如在CdSe量子點的外面包覆一層CdS 或ZnS 就構(gòu)成了以CdSe為核，以CdS 或ZnS 為殼的量子點?；瘜W修飾法化學修飾法用含巰基的有機分子如二氫硫辛酸、巰基乙酸和聚乙二醇等對量子點進行表面修飾。六、膠體金膠體金（膠體金（colloidal goldcolloidal gold）也稱金溶膠，是金鹽被還原成金原子后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個基礎(chǔ)金核(原子金Au)及包圍在外的雙離子層構(gòu)成(內(nèi)層為負離子層AuCl2-，外層是帶正電荷的H+)。由于靜電作用，金顆粒之間相互排斥而懸浮成為

19、一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的疏水膠溶液，故稱膠體金。膠體金特性具有膠體的多種特性具有膠體的多種特性特別是對電解質(zhì)的敏感性，電解質(zhì)能破壞膠體金顆粒的外周水化層，從而打破膠體金的穩(wěn)定狀態(tài)。膠體金顆粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同膠體金顆粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同最小的膠體金(2nm5nm)是橙黃色，中等大小膠體金(10nm20nm)是酒紅色，較大顆粒膠體金(30nm80nm)則是紫紅色。膠體金制備原理膠體金是氯金酸(HAuCl4)在還原劑的作用下，聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電荷的疏水膠溶液。常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、維生素C、白磷、硼氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用

20、的強弱，可以制備0.8nm150nm不等的膠體金顆粒。膠體金制備方法常用的方法為檸檬酸三鈉還原法常用的方法為檸檬酸三鈉還原法以制備16nm的膠體金為例，取0.01%的氯金酸水溶液100ml，加熱至沸騰，磁力攪動下加入1%的檸檬酸三鈉水溶液2ml，淡黃色的氯金酸溶液很快變灰色，繼而黑色，隨后成酒紅色。金溶膠顆粒的直徑取決于制備時加入的枸櫞酸三鈉量，金溶膠顆粒的直徑取決于制備時加入的枸櫞酸三鈉量，保持其他條件不變，制備時加入不同劑量的檸檬酸三鈉可獲保持其他條件不變，制備時加入不同劑量的檸檬酸三鈉可獲得不同粒徑的膠體金顆粒得不同粒徑的膠體金顆粒。第二節(jié)第二節(jié) 常用交聯(lián)劑及特性常用交聯(lián)劑及特性重點提示

21、均一的雙功能交聯(lián)劑非均一的雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)劑方法交聯(lián)劑生物大分子之間的偶聯(lián)，本質(zhì)上是生物大分子中活生物大分子之間的偶聯(lián)，本質(zhì)上是生物大分子中活性基團之間的連接性基團之間的連接。其連接類型主要有其連接類型主要有：-NH2與-NH2 、-NH2與-CO2H 、-SH與-SH 、-NH2與-SH 、糖基(-OH)與-NH2 、-C=O與-NH2 等。免疫標記常用交聯(lián)劑免疫標記常用交聯(lián)劑分子兩端各有一個相同或者不同的活性基團，它們可與其它分子上的氨基、巰基、羥基等基團發(fā)生共價結(jié)合而產(chǎn)生交聯(lián)作用。交聯(lián)劑類型根據(jù)其兩個反應(yīng)基團是否相同分為均一的和非均一的交根據(jù)其兩個反應(yīng)基團是否相同分為均一的和非均一的交聯(lián)

22、試劑聯(lián)試劑。均一的雙功能交聯(lián)劑，其兩個反應(yīng)基團相同。非均一的雙功能交聯(lián)劑，兩個反應(yīng)基團不同，每個基團可能于不同的條件下反應(yīng)。大分子抗原、抗體的標記是利用雙功能交聯(lián)劑使標記物與被標記物結(jié)構(gòu)中的游離的氨基、羧基、硫氫基、咪唑基、酚基、羥基等基團形成不可逆連接。一、一、均一的雙功能交聯(lián)劑均一的雙功能交聯(lián)劑 常用的均一的雙功能交聯(lián)劑（homobifunctional cross-linking reagent）有戊二醛、碳二亞胺等。有-CHO 、-N=C=O 、-N=C=S 、-SO2CH =CH2 等活潑雙鍵, 可與生物大分子中的-NH2 、-OH 、-SH 等進行交聯(lián)反應(yīng)。原理簡單，反應(yīng)溫和，適用

23、范圍廣； 副反應(yīng)較多, 易發(fā)生多聚合和分子內(nèi)交聯(lián)，使交聯(lián)物的生物活性顯著下降。碳二亞胺縮合法碳二亞胺能激活蛋白質(zhì)分子上的羧基，反應(yīng)生成一個肽鍵（-CO-NH-），經(jīng)碳二亞胺縮合反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子中的游離羧基與標記物分子中的氨基形成較穩(wěn)定的酰胺鍵。戊二醛法戊二醛分子中兩個醛基可分別與兩個相同或不同分子上的伯氨形成Schiff 堿, 將兩個生物大分子以五碳鏈的橋連接起來。過碘酸鈉氧化法利用過碘酸鹽氧化糖蛋白中糖基的鄰二羥基成為醛基，再通過醛基與標記物分子中的伯氨基反應(yīng)形成schiff堿，后者經(jīng)NaBH4還原NC鍵成為穩(wěn)定的結(jié)合物。N-羥基琥珀酰亞胺活化法 蛋白質(zhì)分子羧基通過N-羥基琥珀亞酰胺活化，再

24、與標記物分子中的氨基偶聯(lián)形成酰胺鍵。非均一的雙功能交聯(lián)劑N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸醋(SPDP)等屬于非均一雙功能交聯(lián)劑(heterobifunctional cross-linking reagent)。SPDP分子兩端分別含有對脂肪鏈上的巰基和伯氨基十分敏感，有專一作用的二硫吡啶基和琥珀酰亞胺酯基，可將含巰基和氨基的兩種蛋白質(zhì)很容易地交聯(lián)起來；如果兩種蛋白質(zhì)不含巰基，可用SPDP在其中一個蛋白質(zhì)分子中引入二硫吡啶基，然后再用二巰基蘇糖醇（DTT）還原成游離巰基，最后使二者交聯(lián)起來。SPDP分子結(jié)構(gòu)式SPDP交聯(lián)原理將蛋白質(zhì)（P1-NH2）通過酰胺化學反應(yīng)，引入二硫吡啶基

25、（DTP）。將DTP化的蛋白質(zhì)通過T-DE反應(yīng)，與含巰基的蛋白質(zhì)（P2-SH）進行交聯(lián)。如果第二種蛋白質(zhì)分子（P2）不含巰基，可按反應(yīng)（1）而得到P2-NH-DTP，再與二巰基蘇糖醇（DTT）起反應(yīng)，將DTP基還原成巰基，所得P2NHCOCH2CH2SH，再按反應(yīng)（2）方式交聯(lián)，制得結(jié)合物II（P1-NHCOCH2CH2SSCH2CH2CONHP2）。SPDP交聯(lián)法優(yōu)點對蛋白質(zhì)的伯胺基和脂肪族鏈上的游離巰基反應(yīng)敏感，專一性很強，反應(yīng)容易控制，可避免副反應(yīng)。交聯(lián)的程度容易測定，交聯(lián)后的大分子生物活性高于一般交聯(lián)劑方法。可通過還原裂解使其再生。第三節(jié)第三節(jié) 放射性核素與抗原抗體結(jié)合物的放射性核素與

26、抗原抗體結(jié)合物的制備制備重點提示標記物與抗原抗體結(jié)合物的制備基本方法標記物與抗原抗體結(jié)合物的純化標記物與抗原抗體結(jié)合物的鑒定標記物與抗原抗體結(jié)合物的保存放射性核素與抗原抗體的結(jié)合物制備放射性核素與抗原抗體的結(jié)合物制備一、一、基本方法基本方法氯胺T(ch-T)法是常用的標記方法，氯胺T是一種氧化劑，它能使125I+液中帶負電荷的碘離子氧化成帶正電荷的碘，然后取代抗原酪氨酸殘基芳香環(huán)上的氫ch-T是對甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物鈉鹽，在水中易分解成具氧化性的次氯酸：次氯酸可將125I氧化成帶正電荷的125I+，后者可取代抗原（或抗體）中酪氨酸殘基苯環(huán)上的氫原子，形成穩(wěn)定放射標記物；最后加入還原劑偏重

27、亞硫酸鈉（Na2S2O5）可終止反應(yīng) 125I結(jié)合物制備直接標記法氯胺T法化學或酶促反應(yīng)，將放射性負電碘離子氧化成碘原子或正電碘離子，通過取代反應(yīng)置換被標記物分子中酪氨酸或酪胺殘基以及組胺殘基上的氫原子。 125I-Ch-T氧化125I或125I+取代反應(yīng)125I-標記物（混合物）氯胺T(ch-T)法使用無還原劑的高比放射性碘源ch-T用量要低控制總反應(yīng)體積200l反應(yīng)時間1分鐘2分鐘弱堿性反應(yīng)條件 二、放射性核素標記結(jié)合物的純化標記反應(yīng)后形成的結(jié)合物不能直接使用，需去除游離125I和其他雜質(zhì)。游離125I和125I標記抗體（抗原）分子大小相差懸殊，采用凝膠層析即可分離，如葡聚糖凝膠（Seph

28、adex G-50）柱層析。125I結(jié)合物純化凝膠過濾法離子交換層析法 聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜法 去除游離125I去除過度標記的標記物三、放射性核素標記結(jié)合物的鑒定放射性核素結(jié)合物的鑒定包括放射化學純度、比放射活性放射性核素結(jié)合物的鑒定包括放射化學純度、比放射活性和免疫活性三個參數(shù)和免疫活性三個參數(shù)：放射化學純度指在標記物中結(jié)合在抗原（或抗體）上的放射活性占該標記物總放射活性的百分比。比放射活性是指單位質(zhì)量標記物中所含的放射性強度，也可理解為每分子抗原（或抗體）平均所結(jié)合放射性原子數(shù)目，常用Ci/g或Ci/mmol表示。免疫活性指標記物與抗原或抗體反應(yīng)的能力。免疫活性測定方法，用少量

29、標記物與過量抗體反應(yīng)，測定與抗體結(jié)合部分（B）的放射活性，并計算與加入的標記物總放射活性（T）的百分比（B/T）。125I結(jié)合物鑒定 標記物質(zhì)量高純度高比放射活性完整免疫活性 放射化學純度單位標記物中結(jié)合于抗原或抗體上的放射活性占該標記物總放射性的百分比應(yīng)大于95% 免疫活性（immunoreactivity）標記物與抗原或抗體結(jié)合的能力標記物與過量抗體反應(yīng)百分比該值越大, 標記物免疫活性好 四、放射性核素標記結(jié)合物的保存四、放射性核素標記結(jié)合物的保存 放射性核素標記結(jié)合物在放射性核素標記結(jié)合物在2828避光保存。避光保存。注意放射防護，廢棄物須按放射防護條例規(guī)定注意放射防護，廢棄物須按放射防

30、護條例規(guī)定處理。標記物長期貯存后可因脫碘和自身輻射處理。標記物長期貯存后可因脫碘和自身輻射造成蛋白質(zhì)破壞而形成碎片，同樣可以采用上造成蛋白質(zhì)破壞而形成碎片，同樣可以采用上述方法對標記物重新進行純化。述方法對標記物重新進行純化。第四節(jié)第四節(jié) 熒光素與抗原抗體結(jié)合物的制備熒光素與抗原抗體結(jié)合物的制備一、基本方法熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合的化學反應(yīng)基團主要有三種類型熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合的化學反應(yīng)基團主要有三種類型：酰基氯，由磺酸制備。異硫氰酸和重氮鹽類，這兩種通常由相應(yīng)的胺制備，通過化學鍵作用于相應(yīng)的抗原、抗體反應(yīng)結(jié)合。目前標記方法主要是透析法和攪拌法兩種目前標記方法主要是透析法和攪拌法兩種：以FITC標記抗

31、體（IgG）為例：FITC含有異硫氰基，在堿性條件下能與IgG的自由氨基結(jié)合，形成熒光抗體結(jié)合物。FITC標記結(jié)合物制備熒光素標記抗體的方法熒光素標記抗體的方法原理:利用抗體蛋白的自由氨基自由氨基與FITC的異硫氰基異硫氰基在堿性溶液中形成硫碳酰胺鍵硫碳酰胺鍵，使抗體與FITC結(jié)合成熒光抗體。標記方法:攪拌法：適于標記體積較大、蛋白含量較高的抗體。標記時間短，熒光素用量少，但有非特異性染色。 透析法：適于標記樣品量少，蛋白含量低的抗體。標記比較勻，非特異染色較低。透析法二、熒光素標記結(jié)合物純化抗體標記完成后，還應(yīng)對標記抗體進行純化，以除去未結(jié)合的游離熒光素，純化方法可采用透析法和凝膠過濾法。透

32、析法透析法將標記的抗體放入透析袋中，不斷更換透析液透析1周左右，直至透析液在紫外燈照射下不發(fā)出熒光為止，本法適用于蛋白含量低的標記物。 凝膠過濾法凝膠過濾法將標記的抗體通過SephadexG25或G50凝膠柱，洗脫第一峰為熒光素標記抗體峰，第二峰為游離熒光素峰，收集第一峰即可。本法簡便快捷，可在數(shù)小時內(nèi)完成。三、熒光素標記結(jié)合物純化熒光抗體的純化熒光抗體的純化去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：去除游離熒光素及其降解產(chǎn)物：透析或凝膠過濾去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：去除熒光素未結(jié)合和結(jié)合過度的抗體：陰離子交換層析法去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：去除交叉反應(yīng)或非期望抗體：動物肝粉吸收或固相抗原吸收熒光素

33、標記結(jié)合物鑒定熒光抗體的鑒定熒光素與蛋白結(jié)合率 F/P=抗體效價：雙向免疫擴散試驗抗體特異性：吸收試驗、抑制試驗保存：-20：保存1年2年 真空干燥：長期保存nmnmAAA495280495nm35. 087. 2第五節(jié)第五節(jié) 酶與抗原抗體的結(jié)合物制備酶與抗原抗體的結(jié)合物制備一般是通過交聯(lián)劑將酶與抗體或抗原相結(jié)合。交聯(lián)方法主要有：戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亞胺法、混合酸酐法等。一般都是利用小分子上的活性部位與蛋白質(zhì)上的氨基、羧基、酚基、巰基或羥基進行化學反應(yīng)。一、基本方法制備方法過碘酸鈉法（直接法）過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標記抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個

34、相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質(zhì)量較均一。過量戊二醛+酶 酶-戊二醛-抗體（抗原）洗滌Ab/Ag戊二醛交聯(lián)法戊二醛為同源雙功能交聯(lián)劑，它有兩個相同的醛基，可分別與酶分子和抗體(抗原)分子上的氨基結(jié)合。戊二醛法又根據(jù)試劑加入的方法分為一步法和二步法。一步法是將抗體(抗原)、酶和戊二醛同時發(fā)生反應(yīng)。此法操作簡便，可用于HRP、ALP標記抗體(抗原)。但酶標記物的產(chǎn)率低，酶標記物易聚合，而且酶與酶、抗體與抗體之間也會發(fā)生交聯(lián)，影響標記物的質(zhì)量。戊二醛交聯(lián)法二步法則是將相對過量的戊二醛與酶反應(yīng)，讓酶分子上的氨基僅與戊二醛上的

35、醛基結(jié)合，不發(fā)生酶與酶之間的結(jié)合，除去未與酶結(jié)合的多余戊二醛后，再加入抗體(抗原)，形成酶-戊二醛-抗體(抗原)結(jié)合物。其特點是酶標記物均一，標記效率也較一步法提高。改良過碘酸鈉法此法是目前用于HRP標記抗體或抗原的最常用方法。過碘酸鈉可將與酶活性無關(guān)的多糖羥基氧化為醛基，后者與抗體蛋白中的游離氨基結(jié)合形成Schiff堿，再加入硼氫化鈉還原后，即生成穩(wěn)定的酶標記物。為防止酶蛋白分子中氨基與醛基發(fā)生自身偶聯(lián)反應(yīng)，標記前需用2,4-二硝基氟苯封閉酶蛋白分子中殘存的-氨基和-氨基。二、酶標記結(jié)合物純化標記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異

36、顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度。常用的純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純?nèi)?、酶標記結(jié)合物鑒定每批制備的酶標記物都要進行質(zhì)量和標記率的鑒定，每批制備的酶標記物都要進行質(zhì)量和標記率的鑒定，質(zhì)量鑒定包括酶活性和抗體（抗原）的免疫活性的鑒定質(zhì)量鑒定包括酶活性和抗體（抗原）的免疫活性的鑒定。常用的鑒定方法常用的鑒定方法： 免疫電泳或雙相擴散法常用免疫電泳或雙向擴散法，出現(xiàn)沉淀線表示酶標記物中的抗體（抗原）具有免疫活性。沉淀線經(jīng)生理鹽水反復(fù)漂洗后，滴加的底物溶液，若能在沉淀線上顯色，則表示酶標記物中的酶仍具有活性。也可直接用ELSIA方法

37、測定酶標記率測定常用分光光度計法分別測定酶標記物中酶和抗體（抗原）蛋白的含量，再用公式計算其標記率。四、酶標記結(jié)合物的保存 酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保酶標抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冷存不當，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn)定，冷凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復(fù)融。結(jié)合程中引起活力的減低，而且使用時需經(jīng)復(fù)融。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普通冰箱的冰格中較長時間保存。箱的冰格中較長時間保

38、存。第六節(jié)第六節(jié) 化學發(fā)光劑與抗原抗體的化學發(fā)光劑與抗原抗體的結(jié)合物制備結(jié)合物制備一、基本方法化學發(fā)光劑化學發(fā)光劑標記反應(yīng)分為直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)兩種方標記反應(yīng)分為直接偶聯(lián)和間接偶聯(lián)兩種方式式：直接偶聯(lián)是通過偶聯(lián)反應(yīng)，使標記物分子中的發(fā)光集團直接連接到被標記物分子的反應(yīng)基團上。間接偶聯(lián)是通過交聯(lián)劑在標記物和被標記物之間插入一條鏈或一個基團，通過“橋”可以在原有結(jié)構(gòu)中引進新的活性基團，增加反應(yīng)活性，減弱偶聯(lián)雙方分子結(jié)構(gòu)中存在的空間阻礙效應(yīng)。二、化學發(fā)光劑標記結(jié)合物的純化多數(shù)經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)制備的結(jié)合物，使用前需采用透析法、凝膠過濾法或鹽析沉淀法等進行純化，目的是除去反應(yīng)系統(tǒng)中存在的未結(jié)合的發(fā)光劑和交聯(lián)劑

39、。三、化學發(fā)光劑標記結(jié)合物的鑒定由于標記過程的不規(guī)范或存放過程中可能出現(xiàn)的脫落現(xiàn)象，對新制備已純化或經(jīng)長時間保存的結(jié)合物，在使用前均需測定蛋白質(zhì)的含量、免疫學活性和發(fā)光效率等三項指標，以保證實驗結(jié)果準確、可靠。四、化學發(fā)光劑標記結(jié)合物的保存 結(jié)合物一般可分裝保存在-704條件下，最好冷凍干燥保存，這樣可保存數(shù)年之久不喪失活性。第七節(jié) 稀土離子與抗原抗體的結(jié)合物制備一、基本方法鑭系元素離子不能直接與抗原或抗體分子結(jié)合，需利用具有雙功能基團的螯合劑。常用的雙功能螯合劑有1-（對-苯偶氮）-EDTA、異硫氰酸苯基-EDTA、異硫氰酸苯甲基-EDTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等。螯合劑可先螯合EU3+，再連接蛋白質(zhì)（一步法），或先連接蛋白質(zhì)，再螯合EU3+(二步法)。針對小分子半抗原，則需先將半抗原與大分子載體蛋白（牛血清白蛋白、多聚賴氨酸等）連接，再標記