藍(lán)白斑篩選原理及問(wèn)題總結(jié)

1、資源共享藍(lán)白斑篩選原理及問(wèn)題總結(jié)1問(wèn)題：做轉(zhuǎn)化時(shí)，用藍(lán)白斑篩選，以獲得陽(yáng)性克隆。那它和直接利用AMP抗性，而不用藍(lán)白斑篩選，有什么區(qū)別嗎？藍(lán)白斑篩選有什么作用嗎？對(duì)于這一問(wèn)題，我想，抗性篩選是防止雜菌生長(zhǎng)。理論上說(shuō)，當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時(shí)，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因載體的細(xì)胞才能生存繁殖。藍(lán)白篩選是驗(yàn)證是否有插入片斷。兩者結(jié)合起來(lái)，更有利于篩選到我們的目的菌。2問(wèn)題：如果加了 AMP、IPTG和 X-Gal,長(zhǎng)出來(lái)的白斑一定都是含有插入片段的嗎？有沒(méi)有可能是載體自連的？答：可以說(shuō)，世界上沒(méi)有絕對(duì)的事情，即使加了AMP、IPTG和 X-Gal ,長(zhǎng)出來(lái)的白斑也不一定都是含有插入片段的陽(yáng)性克隆，具體原

2、因可能有：1有可能是載體自連的假陽(yáng)性；2作時(shí) AMP、IPTG 和 X-Gal 其中一種或幾種沒(méi)涂均勻。3有時(shí)即使插入片段也會(huì)出現(xiàn)籃斑。只要編碼框沒(méi)被破壞。3問(wèn)題：如何篩選重組菌落？答：可使用藍(lán)/白斑篩選法，在涂布有 IPTG和 X-Gal 的篩選平板上，重組菌株為白色，未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株為藍(lán)色。4問(wèn)題：藍(lán)白斑篩選如何篩選適宜的宿主菌株 ？答：如進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選，宿主菌 &半乳糖昔酶的 a-肽編碼區(qū)應(yīng)在染色體或附加體上缺失掉lacZ A M15。TOP10和 DH 成 都能用于藍(lán)/白斑篩選。5問(wèn)題：在藍(lán)白斑篩選的過(guò)程中沒(méi)有藍(lán)斑是什么原因?qū)е碌?？因?yàn)橥ㄟ^(guò)PCR 檢測(cè)插入片段的大小說(shuō)明所

3、挑的白斑克隆并沒(méi)有插入片段。答：原因很多,1可能是你用的培養(yǎng)基含有乳糖或葡萄糖，因?yàn)榘肴樘歉拭笗?huì)分解乳糖,導(dǎo)致不能與X-Gal 反響，葡萄糖不會(huì)誘導(dǎo)融合基因的表達(dá)。2作時(shí) AMP、IPTG和 X-Gal 其中一種或幾種沒(méi)涂均勻。3很多因素會(huì)造成 PCR 失敗。6問(wèn)題：我最近轉(zhuǎn)化大腸桿菌時(shí)，通防白斑篩選，挑出白色菌落做PCR,可是在電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)在有目的帶的同時(shí)還有比目的帶小的雜帶，不知為什么？我反復(fù)篩了幾次，都是這樣，可不可以搖菌提質(zhì)粒？我應(yīng)該下一步怎么做？答：針對(duì)這樣的情況，我覺(jué)得，你首先做酶切鑒定，看看你的目的片段是否真正插入。其次，你應(yīng)該檢測(cè)PCR 過(guò)程有沒(méi)有問(wèn)題。7問(wèn)題：我用 Amp-IP

4、TG-X-gal LB 平板進(jìn)行藍(lán)白斑篩選重組子，為何篩出的全是白斑，沒(méi)一個(gè)藍(lán)斑，挑幾個(gè)白斑搖菌擴(kuò)增后 PCR 檢測(cè)也全是陽(yáng)性克隆，不會(huì)全都重組成功了吧？什么原因呢？答：這樣的情況是完全有可能的，只要載體處理的好，應(yīng)該說(shuō)是有這種可能。藍(lán)白斑篩選 是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如體互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的藍(lán)白斑篩選原理：DNA 的短區(qū)段，其中有 林半乳糖昔酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和前 146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到$半乳糖昔酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼林半乳

5、糖昔酶 C端局部序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為佐互補(bǔ)。由仿互補(bǔ)而產(chǎn)生的 LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑 IPTG 的作用下，在生色底物 X-Gal 存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源 DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可防止地導(dǎo)致無(wú)佐互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色 菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選那么經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37C溫箱倒置培養(yǎng) 12-16hr后，有重組質(zhì)

6、粒的細(xì)菌形成白色菌落。IPTG 與 X-Gal 介紹IPTG即 Isopropyl 6-D-1-thiogalactopyranoside，也稱 Isopropyl 6-D-thiogalactoside，中文名為異丙基-D-硫代半乳糖昔。分子 式為 C9H18O5S，分子量為 238.30, CAS Number 367-93-1 , Ultra Pure, dioxane free,常用于藍(lán)白斑篩選，如果在平板培養(yǎng)基 中參加 X - Gal 和 IPTG，由于 6 -半乳糖昔酶的 a -互補(bǔ)性，可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑選出基因重組體。此外，它還可以作為具有 lac或

7、tac等啟動(dòng)子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物使用。IPTG 與 X-Gal 配置X-Gal :中文名為 5膜-4-氯-3-呵噪-&D-半乳糖昔。 X-Gal 是祥乳糖昔酶(-galactosidase勺顯色底物， 在 B半乳糖昔酶的催化下 會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。常用于&半乳糖昔酶的原位染色檢測(cè)以及藍(lán)白斑篩選。IPTG配制成 24 mg/ml (100 mM)的水溶液，并進(jìn)行過(guò)濾除菌后保存。X-gal 為 5-漠-4-氯-3-呵噪-6 -D 半乳糖昔。用二基甲酰胺 DMF溶解 X-gal 配制成的 20mg/ml 的貯存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有 X-gal 溶液的試管須用鋁箔封裹以防因受光照而被破壞，并應(yīng)貯存于-20Co X-gal 溶液無(wú)須過(guò)濾除菌。使用方法：在 100 ml 的瓊脂培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)基溫度為 55C 左右時(shí)，參加 100心 的 24 mg/ml(100 mM ) IPTG、200 g l 的 X-Gal(20 mg/ml)和 100 l 的 Amp (100 mg/ml),