基因引物設(shè)計

1、常用實驗技術(shù)簡介目 錄全長cDNA克隆引物設(shè)計染色體步移技術(shù)全長cDNA克隆 是許多后續(xù)更深入實驗的基礎(chǔ)； 真核生物mRNA的特征及轉(zhuǎn)錄過程的了解； 全長cDNA克隆方法：靈活掌握； 同源克隆技術(shù) RACE-PCR技術(shù)基因克隆前的準備工作 看有沒有被別人克隆出來； 查看文獻了解基因的功能及表達特征； 了解該基因可能涉及的工作（如激酶活性的測定及DNA-蛋白相互作用等），制定計劃； 了解相近物種該基因的信息，以利于擴增過程中預測PCR的延伸時間；同源片段的克隆 本實驗室的EST數(shù)據(jù)庫； NCBI數(shù)據(jù)庫； RT-PCR用兼并引物擴增同源片段；設(shè)計兼并引物是重點！注意事項： 高質(zhì)量的mRNA和高效率

2、的逆轉(zhuǎn)錄； 加大引物濃度； 選擇mRNA表達量高的組織做模板； 梯度PCR或者降落PCR； 巢氏PCR; 序列分析；3RACE: 原理：5RACE 原理：注意事項： RNA的完整性； 高效的逆轉(zhuǎn)錄酶； 多次5RACE相結(jié)合； 應用豐度高的組織做模板； 長片段擴增應用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用隨機引物或者OligoT引導逆轉(zhuǎn)錄；序列分析 引物設(shè)計：Primer 5.0； 一般的序列處理：DNAStar中的Editseq； 序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2； 序列在線比對：NCBI-BLAST ( / )； 序列多

3、重比對：Bioedit、ClustalW2 (http:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)； 尋找ORF: Editseq、ORF Finder ( /gorf/gorf.html )； 序列作圖：Bioedit、EMBOSS ( http:/emboss.bioinformatics.nl/ )； 構(gòu)建進化樹:MEGA 4.1； 蛋白結(jié)構(gòu)域分析：SMART( http:/smart.embl-heidelberg.de/ )； 蛋白理化性質(zhì)分析及二、三級結(jié)構(gòu)分析：EXPASY( http:/www.ex

4、pasy.ch/tools/ )、Psipred ( http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ )； 信號肽分析：SignalP( http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )； 磷酸化位點分析：NetPhos 2.0 Server ( http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )； 糖基化位點：NetNGlyc 1.0 Server ( http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )；引物設(shè)計 兼并引物 RACE引物 熒光定量引物 染色體步移引物 原核表達用

5、引物 PCR-SSCP引物總原則 引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性。 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。 引物長度一般在1530堿基之間。 G+C含量在40%60%之間。 堿基要隨機分布。 引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。 引物5端可以修飾。 引物3端不可修飾。 引物3端要避開密碼子的第3位。 兼并引物 兼并堿基： M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T 簡并度：兼并引物設(shè)計步驟 利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸

6、序列 對所找到的序列進行多序列比對 確定合適的保守區(qū)域 設(shè)計兼并引物（軟件或者人工） 選擇合適的序列進行多重比對； 選擇高度保守的序列作為引物； 人工設(shè)計時要注意引物序列是和原序列相同還是反向互補的； 簡并度不能太高，可用次黃嘌呤代替N； 引物的3端殘基盡可能使用確定殘基 ； 降落PCR; 巢氏PCR;RACE引物 各3條重疊的引物，引物之間最好距離100-200bp； 若同源片段長度太短，可先做3RACE，再做5RACE； 盡量靠近cDNA末端（3RACE-3末端； 5RACE-5末端）；熒光定量引物 純化方式：PAGE； 產(chǎn)物長度：80-150bp； TM值:58-62; 在編碼區(qū)內(nèi)靠近3

7、末端處設(shè)計； 高的特異性：測序及熔解曲線分析；染色體步移引物 以DNA為模板設(shè)計引物； 3條重疊引物； 高的退火溫度：高于60度；原核表達用引物 會讀表達載體圖譜； 去除信號肽序列； 根據(jù)目的表達序列直接取相應序列作為引物，注意要不要加終止密碼子； 在引物的5末端加酶切位點和相應的保護堿基，注意方向； 選酶切位點：選擇常用的內(nèi)切酶，并看這兩種酶是否可以在統(tǒng)一體系中進行雙酶切；PCR-SSCP引物 PCR產(chǎn)物長度：150-400bp； 高的特異性；染色體步移克隆啟動子Tail-PCR預測啟動子位置將啟動子序列克隆進一個無其他啟動子，且報告基因為熒光素酶的載體中轉(zhuǎn)染細胞系熒光素酶活性的測定確定啟動子活性的強弱 謝 謝！同源片段的克隆 本實驗室的EST數(shù)據(jù)庫； NCBI數(shù)據(jù)庫； RT-PCR用兼并引物擴增同源片段；設(shè)計兼并引物是重點！同源片段的克隆 本實驗室的EST數(shù)據(jù)庫； NCBI數(shù)據(jù)庫； RT-PCR用兼并引物擴增同源片段；設(shè)計兼并引物是重點！注意事項： RNA的完整性； 高效的逆轉(zhuǎn)錄酶； 多次5RACE相結(jié)合； 應用豐度高的組織做模板； 長片段擴增應用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用隨機引物或