基因工程與食品產(chǎn)業(yè)

1、第二章第二章 基因工程與食品產(chǎn)業(yè)基因工程與食品產(chǎn)業(yè) 第四節(jié) 基因工程的基本操作技術第四節(jié)第四節(jié) 基因工程的基本操作技術基因工程的基本操作技術一、 目的基因的獲得與序列分析（一）目的基因的獲得 基因工程主要是通過人工的方法，分離、基因工程主要是通過人工的方法，分離、改造、擴增并表達生物的特定基因，以獲得有改造、擴增并表達生物的特定基因，以獲得有價值的基因產(chǎn)物。價值的基因產(chǎn)物。目的基因的分離是基因工程目的基因的分離是基因工程操作的第一步。操作的第一步。 通常，我們把插入到載體內(nèi)的非自身的通常，我們把插入到載體內(nèi)的非自身的DNADNA片段稱為片段稱為“外源基因外源基因”(foreign gene)(

2、foreign gene)。 目的基因目的基因(objective gene)(objective gene)：又叫靶基：又叫靶基因因(target gene)(target gene)，是指根據(jù)基因工程的目是指根據(jù)基因工程的目的的, ,設計的所需要的某些設計的所需要的某些DNADNA分子片段，它含分子片段，它含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼有一種或幾種遺傳信息的全套密碼(code) (code) n 目前采用的分離、合成目的基因的常用方法有： 1. 1.鳥槍法（霰彈槍法）鳥槍法（霰彈槍法）具體做法是：首先利用物理方法（如剪切力、超聲波等）具體做法是：首先利用物理方法（如剪切力、超聲波等）或酶

3、化學方法（如限制性內(nèi)切核酸酶）將生物細胞染色體或酶化學方法（如限制性內(nèi)切核酸酶）將生物細胞染色體DNADNA切割成為基因水平的許多片段，而后將這些片段與適當切割成為基因水平的許多片段，而后將這些片段與適當?shù)妮d體結合，將重組的載體結合，將重組DNADNA轉入受體菌中擴增，獲得無性繁殖轉入受體菌中擴增，獲得無性繁殖的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選的基因文庫，再結合篩選方法，從眾多的轉化子菌株中選出含有某種基因的菌株，從中將重組的出含有某種基因的菌株，從中將重組的DNADNA分離、回收。分離、回收。 這種方法也就是應用基因工程技術分離目的基因。其這種方法也就是應用基因工程技術分離目

4、的基因。其特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組特點是繞過直接分離基因的難關，在基因組DNADNA文庫中篩選文庫中篩選出目的基因。出目的基因。 2. 2. 物理化學法物理化學法 利用核酸利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基雙螺旋之間存在著堿基G和和C配對、配對、A和和T配對的這一特性，從生物基因組分離目的基因的方法。配對的這一特性，從生物基因組分離目的基因的方法。 常用的分離基因的物理化學法主要方法有：常用的分離基因的物理化學法主要方法有：密度梯度密度梯度離心法；單鏈酶法；分子雜交法。離心法；單鏈酶法；分子雜交法。 （1）密度梯度離心法： 根據(jù)液體在離心時其密度隨轉軸距離而增加，堿根據(jù)液體在離心

5、時其密度隨轉軸距離而增加，堿基基GCGC配對的雙鏈配對的雙鏈DNADNA片段密度較大，利用精密的密度片段密度較大，利用精密的密度梯度超離心技術可使切割適當片段的不同梯度超離心技術可使切割適當片段的不同DNADNA按密度按密度大小分布開來，進而通過與某種放射性標記的大小分布開來，進而通過與某種放射性標記的mRNAmRNA雜雜交來檢驗，分離相應的基因。交來檢驗，分離相應的基因。 （2）單鏈酶法： 堿基堿基GCGC配對之間有三個氫鍵，比配對之間有三個氫鍵，比ATAT配對的配對的穩(wěn)定性高。當用加熱或其他變性試劑處理穩(wěn)定性高。當用加熱或其他變性試劑處理DNADNA時，雙鏈上時，雙鏈上ATAT配對較多的部

6、位先變成單配對較多的部位先變成單鏈，應用單鏈特異的鏈，應用單鏈特異的S1S1核酸酶切除單鏈，再核酸酶切除單鏈，再經(jīng)氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的經(jīng)氯化銫超速離心，獲得無單鏈切口的DNA DNA （3）分子雜交法： 單鏈單鏈DNADNA與其互補的序列總有與其互補的序列總有“配對成雙配對成雙”的傾向，如的傾向，如DNADNA：DNADNA配對或者配對或者DNADNA：RNARNA配對，配對，這就是分子雜交的原理。這就是分子雜交的原理。 利用分子雜交的基本原理既可以分離又可利用分子雜交的基本原理既可以分離又可以鑒別某一基因。以鑒別某一基因。 3.3.化學合成法 是以單核苷酸為原料，在體外用化學方法

7、是以單核苷酸為原料，在體外用化學方法按照已知基因的堿基順序合成按照已知基因的堿基順序合成DNADNA短片段，再短片段，再依次連接成完整的目的基因鏈。此法必須預先依次連接成完整的目的基因鏈。此法必須預先知道目的基因或其知道目的基因或其mRNAmRNA或蛋白質(zhì)的一級結構，或蛋白質(zhì)的一級結構，即核苷酸或氨基酸的順序。即核苷酸或氨基酸的順序。 為了保證定向合成，需要將一個分子的為了保證定向合成，需要將一個分子的5 5端與另一個分子的端與另一個分子的33端封閉保護。這種封閉端封閉保護。這種封閉可用磷酸化等方法，必要時可以酸或堿解除封可用磷酸化等方法，必要時可以酸或堿解除封閉。閉。 化學合成法的最大優(yōu)點是

8、能按照人們的意愿合化學合成法的最大優(yōu)點是能按照人們的意愿合成突變基因。但有局限性，要合成較長鏈的成突變基因。但有局限性，要合成較長鏈的 DNADNA分分子尚有困難子尚有困難。 隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，基因工程操作儀器隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，基因工程操作儀器設備也不斷更新。如日本設備也不斷更新。如日本ZeonZeon公司已成功制成并出公司已成功制成并出售售“全自動全自動DNADNA合成儀合成儀” ，精工電子工業(yè)公司的，精工電子工業(yè)公司的“ DNADNA序列儀序列儀”。 目前單鏈目前單鏈DNADNA短片段的合成已經(jīng)成為分子生物短片段的合成已經(jīng)成為分子生物學和生物技術實驗室的常規(guī)技術了。學和生物技術

9、實驗室的常規(guī)技術了。 4.4.酶促逆轉錄合成法 酶促逆轉錄合成法即利用逆轉錄酶以酶促逆轉錄合成法即利用逆轉錄酶以mRNAmRNA為模為模板合成相應的板合成相應的DNADNA方法。方法。 主要用于合成分子量較大而又不知其序列的基主要用于合成分子量較大而又不知其序列的基因。這種方法是以目的基因的因。這種方法是以目的基因的mRNAmRNA為模板，借助逆為模板，借助逆轉錄酶合成互補的轉錄酶合成互補的DNA(cDNA)DNA(cDNA)，再在，再在DNADNA聚合酶的催聚合酶的催化下合成雙鏈化下合成雙鏈cDNAcDNA片段，與適當?shù)妮d體結合后轉入片段，與適當?shù)妮d體結合后轉入受體菌，擴增為受體菌，擴增為c

10、DNAcDNA文庫。然后，采用適當?shù)姆椒ㄎ膸?。然后，采用適當?shù)姆椒◤膹腸DNAcDNA文庫中篩選出目的基因。文庫中篩選出目的基因。 如如 ：19721972年采用逆轉錄酶合成了家兔和人球年采用逆轉錄酶合成了家兔和人球蛋白的蛋白的cDNAcDNA。5.PCR5.PCR擴增法 當巳知目的基因的序列時，通常利用多聚酶鏈當巳知目的基因的序列時，通常利用多聚酶鏈式反應式反應(PCR)(PCR)技術來分離目的基因。技術來分離目的基因。它能快速、簡便地在體外擴增特定的它能快速、簡便地在體外擴增特定的DNADNA片段，片段，具有高度的專一性和靈敏度。具有高度的專一性和靈敏度。l PCR反應體系應具備的條件：

11、（1 1）要有與被分離的目的基因的）要有與被分離的目的基因的DNADNA雙鏈兩端雙鏈兩端序列相互補的序列相互補的DNADNA引物引物( (約約2020個堿基左右個堿基左右) )； （2 2）具有熱穩(wěn)定性的酶如）具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNATaqDNA聚合酶；聚合酶； （3 3）dNTPdNTP； （4 4）作為模板的目的）作為模板的目的DNADNA序列。一般序列。一般PCRPCR反應反應可擴增出可擴增出1001005000bp5000bp的目的基因。的目的基因。 l PCRPCR反應過程包括：1.DNA1.DNA變性（變性（90-9690-96）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板在熱作用下，模板

12、在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈氫鍵斷裂，形成單鏈DNADNA2.2.退火（退火（25-6525-65）：系統(tǒng)溫度降低，引物與）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNADNA模板模板結合，形成局部雙鏈。結合，形成局部雙鏈。3.3.延伸（延伸（70-7570-75）：在）：在Taq DNATaq DNA聚合酶（在聚合酶（在7272左右左右最佳的活性）的作用下，以最佳的活性）的作用下，以dNTPdNTP為原料，從引物的為原料，從引物的55端端33端延伸，合成與模板互補的端延伸，合成與模板互補的DNADNA鏈。鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNADNA含量既增加一倍。含量既增加

13、一倍。如此反復進行約如此反復進行約3030個循環(huán)左右，即可擴增得到目的個循環(huán)左右，即可擴增得到目的DNADNA序序列列（二）DNADNA序列測定 DNADNA序列分析序列分析(DNA sequencing)(DNA sequencing)：指對某一段指對某一段DNADNA分子或片段的核苷酸排列順序測定，也就是分子或片段的核苷酸排列順序測定，也就是測定組成測定組成DNADNA分子的分子的A A、T T、G G、C C的排列順序。的排列順序。 測序也常常用于對重組測序也常常用于對重組DNADNA的序列分析，其的序列分析，其結果是最直接、最客觀反映重組結果是最直接、最客觀反映重組DNADNA中有無目

14、的中有無目的基因的方法。基因的方法。 l 核苷酸序列測定的方法有：化學降解法酶促法（雙脫氧終止法）自動測序法PCR測序法 1.化學降解法 也叫也叫Maxam-GilbertMaxam-Gilbert法。法。原理：原理：用一些特殊的化學試劑，分別作用于用一些特殊的化學試劑，分別作用于DNADNA序序列中四種不同的堿基。這些堿基經(jīng)過處理后，在核列中四種不同的堿基。這些堿基經(jīng)過處理后，在核苷酸序列中形成的糖苷鍵連接變?nèi)酰虼撕苋菀讖能账嵝蛄兄行纬傻奶擒真I連接變?nèi)?，因此很容易從DNADNA鏈上脫落下來。丟失了堿基的核苷酸鏈再經(jīng)適鏈上脫落下來。丟失了堿基的核苷酸鏈再經(jīng)適當處理，就可在缺失堿基處斷裂。在進

15、行這些反應當處理，就可在缺失堿基處斷裂。在進行這些反應時，將反應條件控制在每條時，將反應條件控制在每條DNADNA鏈斷開一處，因此鏈斷開一處，因此經(jīng)過處理，產(chǎn)生一系列長短不等的經(jīng)過處理，產(chǎn)生一系列長短不等的DNADNA片段。根據(jù)片段。根據(jù)所用的試劑不同，其末端分別為所用的試劑不同，其末端分別為G G、A A、C C、T T，再對，再對一系列這樣的片段進行綜合分析，就可測得一系列這樣的片段進行綜合分析，就可測得DNADNA分分子中的核苷酸排列順序。子中的核苷酸排列順序。 2. 酶促法 又叫又叫SangerSanger法和鏈終止法。法和鏈終止法。原理：原理：先將先將DNADNA分子用限制性內(nèi)切酶切

16、割成片段，分子用限制性內(nèi)切酶切割成片段，然后用電泳依其長短不同分離，鈍化單股片段，然后用電泳依其長短不同分離，鈍化單股片段，以以3232P P標記其標記其5 5末端，并用以作為復制其互補片段末端，并用以作為復制其互補片段的模板，在復制過程中，利用從大腸桿菌提取的的模板，在復制過程中，利用從大腸桿菌提取的DNADNA聚合酶聚合酶經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理而得的大片經(jīng)過枯草桿菌蛋白酶處理而得的大片段，以復制互補單股段，以復制互補單股DNADNA，從而求得其序列。，從而求得其序列。 3.3.自動化測序法 ProberProber等等19871987年將鏈終止法加以改進，并與年將鏈終止法加以改進，并與電子

17、計算機程序的自動化技術相結合，加快了電子計算機程序的自動化技術相結合，加快了序列測定，并且不用放射性同位素標記脫氧核序列測定，并且不用放射性同位素標記脫氧核苷酸，避免了放射線對操作者的危害。苷酸，避免了放射線對操作者的危害。 實際做法：在每種脫氧核苷酸上分別都以共價實際做法：在每種脫氧核苷酸上分別都以共價鍵接上不同熒光染料，然后與四種三磷酸核苷在鍵接上不同熒光染料，然后與四種三磷酸核苷在同一器皿中，依照上述鏈終止法條件進行，即會同一器皿中，依照上述鏈終止法條件進行，即會復制出一系列不斷增加較長一點的多聚脫氧核苷復制出一系列不斷增加較長一點的多聚脫氧核苷酸鏈，其酸鏈，其3 3末端都各自帶有特色熒

18、光染料的雙脫末端都各自帶有特色熒光染料的雙脫氧核苷酸，為了測定序列，將反應混合物在一條氧核苷酸，為了測定序列，將反應混合物在一條道上進行凝膠電泳，結果這條道上出現(xiàn)一系列有道上進行凝膠電泳，結果這條道上出現(xiàn)一系列有熒光的帶。熒光的帶。 這些有熒光的帶中每一條都代表一個堿基在這些有熒光的帶中每一條都代表一個堿基在復制鏈中所在的位置。凝膠熒光測定體系由電復制鏈中所在的位置。凝膠熒光測定體系由電子計算機控制。這個體系是用激光激發(fā)不同顏子計算機控制。這個體系是用激光激發(fā)不同顏色的染料所發(fā)生的熒光，用短波長的藍光及長色的染料所發(fā)生的熒光，用短波長的藍光及長波長的紅光分別測量熒光強度之比值，測定在波長的紅光

19、分別測量熒光強度之比值，測定在復制鏈中各堿基的位置，從而得到復制鏈中各堿基的位置，從而得到DNADNA的序列。的序列。 熟練的操作者用這種方法一天可測熟練的操作者用這種方法一天可測10001000個個以上的堿基，而現(xiàn)在其他測序方法一般一人一以上的堿基，而現(xiàn)在其他測序方法一般一人一年只能測年只能測5000050000個堿基。這種方法因用電子計算個堿基。這種方法因用電子計算機控制，自動化操作，大大縮短測定時間，而機控制，自動化操作，大大縮短測定時間，而且結果準確可靠，是目前最優(yōu)越的測序方法。且結果準確可靠，是目前最優(yōu)越的測序方法。 二、目的基因與載體的連接二、目的基因與載體的連接 通過不同的途徑獲

20、取了目的基因，選擇通過不同的途徑獲取了目的基因，選擇或構建適當?shù)幕蜉d體之后，基因工程的或構建適當?shù)幕蜉d體之后，基因工程的下一步工作是如何將目的基因與載體連接下一步工作是如何將目的基因與載體連接在一起，即在一起，即DNADNA的體外重組。的體外重組?；蛑亟M是基基因重組是基因工程的核心。因工程的核心。 基因重組基因重組(gene recombination)(gene recombination)，就是將目的，就是將目的基因與載體基因與載體DNADNA兩者連接起來。這種連接主要兩者連接起來。這種連接主要靠靠T T4 4DNADNA連接酶連接酶。 通常連接的形式有：黏性末端連接黏性末端連接平端

21、連接平端連接人工接頭連接人工接頭連接同聚物加尾連接同聚物加尾連接 （一）黏性末端連接 黏性末端連接有兩種情況。黏性末端連接有兩種情況。 u同一限制性內(nèi)切酶酶切位點連接 由同一限制性內(nèi)切酶切割的不同由同一限制性內(nèi)切酶切割的不同DNADNA片段，片段，會產(chǎn)生具有完全相同的會產(chǎn)生具有完全相同的黏性末端黏性末端，在適合條件，在適合條件下。單鏈黏性末端間進行堿基配對形成雙鏈，下。單鏈黏性末端間進行堿基配對形成雙鏈，然后在然后在T T4 4DNADNA連接酶催化作用下使之共價連接，連接酶催化作用下使之共價連接，形成的重組形成的重組DNADNA分子。分子。 u不同限制酶切位點連接 由兩種不同的限制性內(nèi)切酶切

22、割的由兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割的DNADNA片段，片段，產(chǎn)生具有相同類型的黏性末端，彼此稱為互補產(chǎn)生具有相同類型的黏性末端，彼此稱為互補末端，也可以產(chǎn)生末端連接。末端，也可以產(chǎn)生末端連接。（二） 平端連接 一些內(nèi)切酶如一些內(nèi)切酶如HaeHae和和HpaHpaI I切割產(chǎn)生的切割產(chǎn)生的DNADNA片片段是平齊末端。段是平齊末端。具有平具有平齊齊末端的酶切載體只能末端的酶切載體只能與平與平齊齊末端的目的基因連接。末端的目的基因連接。 T T4 4DNADNA連接酶可催化相同和不同限制性內(nèi)連接酶可催化相同和不同限制性內(nèi)切酶切割的平端之間連接。切酶切割的平端之間連接。（三）人工接頭連接 人工接頭是人

23、工合成的具有特定限制性內(nèi)切人工接頭是人工合成的具有特定限制性內(nèi)切酶識別和切割序列的雙股平端酶識別和切割序列的雙股平端DNADNA短序列。將短序列。將其接在目的基因片段和載體其接在目的基因片段和載體DNADNA上，使它們具上，使它們具有新的內(nèi)切酶位點，應用相應的內(nèi)切酶切割，有新的內(nèi)切酶位點，應用相應的內(nèi)切酶切割，就可以分別得到互補的黏性末端。就可以分別得到互補的黏性末端。 （四）同聚物加尾連接 利用末端轉移酶利用末端轉移酶( (也稱也稱DNADNA轉移酶轉移酶) )在在DNADNA片段上片段上制造一個粘性末端的方法。制造一個粘性末端的方法。如在目的基因片段的如在目的基因片段的3 3末端添加一小段

24、同聚物末端添加一小段同聚物 ( (如如dAdA堿基堿基) )，在載體，在載體3 3末端添加一小段同聚物末端添加一小段同聚物 dTdT，形成堿基配對，而后，形成堿基配對，而后在T4DNA連接酶催化作用下使之共價連接，形成的重組DNA分子。 三、重組三、重組DNADNA向受體的轉化向受體的轉化 在目的基因與載體連接成重組在目的基因與載體連接成重組DNADNA分子以分子以后，下面的重要工作主要是將其導入受體細后，下面的重要工作主要是將其導入受體細胞進行擴增和篩選，獲得大量的重組胞進行擴增和篩選，獲得大量的重組DNADNA分子，分子，這就是外源基因的無性繁殖，即克隆這就是外源基因的無性繁殖，即克隆(c

25、loning)(cloning)。 由于外源基因與載體構成的重組由于外源基因與載體構成的重組DNADNA分子性分子性質(zhì)不同、宿主細胞不同，將重組質(zhì)不同、宿主細胞不同，將重組DNADNA導入宿主導入宿主細胞的具體方法也不相同。細胞的具體方法也不相同。 常用的受體細胞以細菌為主，其中主要有常用的受體細胞以細菌為主，其中主要有大腸大腸桿菌桿菌、枯草桿菌、枯草桿菌 l重組DNADNA導入受體細胞的方法有：（1 1）轉化：）轉化：是將重組質(zhì)粒是將重組質(zhì)粒DNADNA導入受體細胞，使受體導入受體細胞，使受體遺傳性狀發(fā)生改變的方法；遺傳性狀發(fā)生改變的方法；n轉化是使重組體轉化是使重組體DNADNA分子在熱休

26、克的短暫時間內(nèi)被導入分子在熱休克的短暫時間內(nèi)被導入受體。熱休克后將受體菌在不含抗生素的培養(yǎng)液中生長受體。熱休克后將受體菌在不含抗生素的培養(yǎng)液中生長至少至少3030分鐘以上，使其蛋白得到足夠表達，以便能在含分鐘以上，使其蛋白得到足夠表達，以便能在含抗生素的瓊脂培養(yǎng)平板上生長。由于抗生素的瓊脂培養(yǎng)平板上生長。由于E.coliE.coliX1776X1776菌株菌株用用CaClCaCl2 2處理后制備的感受態(tài)細胞長期冷藏仍能保持其攝處理后制備的感受態(tài)細胞長期冷藏仍能保持其攝取外源取外源DNADNA的能力，故常用作受體菌。的能力，故常用作受體菌。 （2 2）轉染：）轉染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體

27、構是指噬菌體、病毒、或以其為載體構建的重組建的重組DNADNA導入細胞的過程。導入細胞的過程。 ( (其中又分磷酸其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法鈣沉淀法與體外包裝法) )u磷酸鈣沉淀法 利用磷酸鈣利用磷酸鈣-DNA-DNA共沉淀，把外源基因與共沉淀，把外源基因與噬菌體噬菌體DNADNA的重的重組分子導入大腸桿菌和哺乳動物細胞，簡稱磷酸鈣沉淀法。組分子導入大腸桿菌和哺乳動物細胞，簡稱磷酸鈣沉淀法。細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈細胞具有攝取磷酸鈣沉淀的雙鏈DNADNA的能力，幾乎所有的的能力，幾乎所有的雙鏈雙鏈DNADNA都可以通過這種方法導入細胞，而且可在電子顯都可以通過這種方法導入細胞，而且可

28、在電子顯微鏡下清楚地看到細胞吞噬微鏡下清楚地看到細胞吞噬DNA-DNA-磷酸鈣復合顆粒。此法的磷酸鈣復合顆粒。此法的轉染效率遠遠不如體外包裝法。轉染效率遠遠不如體外包裝法。u體外包裝轉染法 體外包裝：指在體外將重組體外包裝：指在體外將重組DNADNA放置到噬菌體的蛋白放置到噬菌體的蛋白質(zhì)外殼里，然后通過正常的噬菌體感染過程，將它們質(zhì)外殼里，然后通過正常的噬菌體感染過程，將它們導入宿主細胞。將重組導入宿主細胞。將重組DNADNA噬菌體包裝成噬菌體顆粒，噬菌體包裝成噬菌體顆粒，使其能夠感染細菌，并在宿主菌體內(nèi)擴增和表達外源使其能夠感染細菌，并在宿主菌體內(nèi)擴增和表達外源基因?；颉?（2 2）轉染：

29、）轉染：是指噬菌體、病毒、或以其為載體構是指噬菌體、病毒、或以其為載體構建的重組建的重組DNADNA導入細胞的過程。導入細胞的過程。 ( (其中又分磷酸其中又分磷酸鈣沉淀法與體外包裝法鈣沉淀法與體外包裝法) )又又稱之為直接顯微注射。一般是用微吸管吸取供體稱之為直接顯微注射。一般是用微吸管吸取供體DNADNA溶液，在顯微鏡下準確地插入受體細胞核中，并將溶液，在顯微鏡下準確地插入受體細胞核中，并將DNADNA注射進去。此法常用于轉基因動物的基因轉移。注射進去。此法常用于轉基因動物的基因轉移。 （3 3）微注射技術：）微注射技術：是將外源基因直接注射到真核是將外源基因直接注射到真核細胞內(nèi)的方法；細

30、胞內(nèi)的方法； （4 4）電轉化法）電轉化法也有人稱做高壓電穿孔法（簡稱電穿孔法），即在受體細也有人稱做高壓電穿孔法（簡稱電穿孔法），即在受體細胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，使質(zhì)膜形成納米大小的微胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，使質(zhì)膜形成納米大小的微孔，孔，DNADNA能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時所伴隨能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布而進入細胞質(zhì)中。發(fā)生的膜組分重新分布而進入細胞質(zhì)中。該法可用于真核細胞該法可用于真核細胞( (如動物細胞和植物細胞如動物細胞和植物細胞) )和原核細胞和原核細胞( (轉化大腸桿菌和其他細菌等轉化大腸桿菌和其他細菌等) )的外源

31、的外源DNADNA的直接導入。的直接導入。 電穿孔法具有簡便、快速、效率高等優(yōu)點電穿孔法具有簡便、快速、效率高等優(yōu)點又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法、又稱高速微型子彈射擊法、微彈射擊法、高速粒子轟高速粒子轟擊法擊法基本原理基本原理：將：將DNADNA吸附在微型子彈吸附在微型子彈(1(1m)m)的表面通過放的表面通過放電或機械加速，使子彈射入完整的細胞或組織內(nèi)。電或機械加速，使子彈射入完整的細胞或組織內(nèi)。 基本做法：基本做法：先將外源先將外源DNADNA溶液與鎢、金等金屬微粒溶液與鎢、金等金屬微粒( (直直徑徑0.5-50.5-5m )m )共同保溫，使共同保溫，使DNADNA吸附于金屬顆粒表

32、面，吸附于金屬顆粒表面，然后放電加速金屬顆粒，使之以然后放電加速金屬顆粒，使之以400m/s400m/s的速度直接噴的速度直接噴射受體細胞，外源遺傳物質(zhì)隨金屬顆粒進入細胞內(nèi)部。射受體細胞，外源遺傳物質(zhì)隨金屬顆粒進入細胞內(nèi)部。（5 5）基因槍技術）基因槍技術（6 6）脂質(zhì)體介導法）脂質(zhì)體介導法（7 7）其他方法：）其他方法：很多高效的新穎的導入方法，如加速冷凍法、碳很多高效的新穎的導入方法，如加速冷凍法、碳化硅纖維介導法等正在研究并逐漸達到實用水平。化硅纖維介導法等正在研究并逐漸達到實用水平。 脂質(zhì)體脂質(zhì)體( (又叫做人工膜泡又叫做人工膜泡) )作為體內(nèi)或體外輸送作為體內(nèi)或體外輸送載體的方法，一

33、般都需要將載體的方法，一般都需要將DNADNA或或RNARNA包囊于脂質(zhì)體包囊于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜的融合，通過融合導內(nèi)，然后進行脂質(zhì)體與細胞膜的融合，通過融合導入細胞。入細胞。 受體細胞：受體細胞：也叫宿主細胞，是指在轉化、轉也叫宿主細胞，是指在轉化、轉導、雜交中接受外源基因的細胞。導、雜交中接受外源基因的細胞。分為分為原核受體細胞原核受體細胞( (最主要是大腸桿菌最主要是大腸桿菌) )、真真核受體細胞核受體細胞 ( (最主要是酵母菌最主要是酵母菌) )、動物細胞和動物細胞和昆蟲細胞昆蟲細胞( (其實也是真核受體細胞其實也是真核受體細胞) )。 具具有接受外源有接受外源DNADN

34、A的能力；為限制性內(nèi)切酶的能力；為限制性內(nèi)切酶缺陷型菌珠或為缺陷型菌珠或為DNADNA重組型菌珠重組型菌珠 ；在標記上和；在標記上和載體對應；有利于表達；不適宜在人體或非培載體對應；有利于表達；不適宜在人體或非培養(yǎng)條件下生存，有利于安全。養(yǎng)條件下生存，有利于安全。 大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體大腸桿菌是目前基因工程中最常用的受體細胞。通常采用的是細胞。通常采用的是大腸桿菌的感受態(tài)細胞大腸桿菌的感受態(tài)細胞，即在冰浴中用一定濃度的即在冰浴中用一定濃度的CaClCaCl2 2處理對數(shù)生長處理對數(shù)生長期的大腸桿菌，以獲得高效轉化的感受態(tài)細胞。期的大腸桿菌，以獲得高效轉化的感受態(tài)細胞。也有采用也

35、有采用Rb+Rb+、Mn2+Mn2+、K+K+、二甲亞礬、二硫蘇、二甲亞礬、二硫蘇糖醇糖醇(DTT)(DTT)或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細或用氯化己胺鈷處理制備感受態(tài)細胞。胞。 感受態(tài)是指受體細胞能吸收外源感受態(tài)是指受體細胞能吸收外源DNADNA分子分子而有效地作為轉化受體的某些生理狀態(tài)。而有效地作為轉化受體的某些生理狀態(tài)。一一般受體細胞在對數(shù)生長期轉化能力最強。般受體細胞在對數(shù)生長期轉化能力最強。四、重組體的篩選與外源基因的鑒定四、重組體的篩選與外源基因的鑒定（一）重組體的篩選 基因克隆的下一道工序是：從轉化細菌菌落基因克隆的下一道工序是：從轉化細菌菌落中篩選含有陽性重組中篩選含有陽性重組

36、DNADNA分子的菌落，并鑒定分子的菌落，并鑒定重組重組DNADNA分子的正確性。分子的正確性。1、針對遺傳表型篩選按載體的性狀變化進行篩選按載體的性狀變化進行篩選根據(jù)插入基因的遺傳性狀進行篩選。根據(jù)插入基因的遺傳性狀進行篩選。2 2、根據(jù)重組子的結構特征篩選快速裂解菌落，鑒定分子大小快速裂解菌落，鑒定分子大小內(nèi)切酶圖譜鑒定內(nèi)切酶圖譜鑒定PCRPCR篩選重組子篩選重組子核酸分子雜交核酸分子雜交（二） 重組體的鑒定 經(jīng)過轉化的重組體，如轉基因微生物、轉經(jīng)過轉化的重組體，如轉基因微生物、轉基因動物和轉基因植物細胞，經(jīng)過培養(yǎng)在其形基因動物和轉基因植物細胞，經(jīng)過培養(yǎng)在其形成了一定的菌株、品系之后，就需

37、要對它們進成了一定的菌株、品系之后，就需要對它們進行鑒定，檢驗它們在生長發(fā)育、傳種接代過程行鑒定，檢驗它們在生長發(fā)育、傳種接代過程中是否保留了已獲得的外源基因。中是否保留了已獲得的外源基因。 1 1、 報告基因的檢測法 是一種快速而簡易地區(qū)分轉基因生物和非轉是一種快速而簡易地區(qū)分轉基因生物和非轉基因生物的方法。基因生物的方法。報告基因檢測法：指在構建目的基因時將一報告基因檢測法：指在構建目的基因時將一種報告基因種報告基因( (如如GUSGUS基因基因) )構建在一起，當目的構建在一起，當目的基因轉入受體細胞時，報告基因一同被轉入?；蜣D入受體細胞時，報告基因一同被轉入。 報告基因：是一種編碼可

38、被檢測的蛋白質(zhì)或報告基因：是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。容易被鑒定的基因。2 2、分子雜交技術 為了從分子水平鑒定目的基因是否已經(jīng)整合到受體為了從分子水平鑒定目的基因是否已經(jīng)整合到受體細胞中，是否轉錄，是否表達，經(jīng)常用到基因探針雜細胞中，是否轉錄，是否表達，經(jīng)常用到基因探針雜交技術。交技術。即用已知基因片段即用已知基因片段( (往往是目的基因片段往往是目的基因片段) )制作的探制作的探針，與待測樣品的基因片段進行核酸分子雜交，從而針，與待測樣品的基因片段進行核酸分子雜交，從而判斷二者的同源程度。判斷

39、二者的同源程度。目前已廣泛應用于食品生物技術的研究中。目前已廣泛應用于食品生物技術的研究中。這種技術通常包括原位雜交、點雜交、這種技術通常包括原位雜交、點雜交、SouthernSouthern吸吸印雜交、印雜交、NorthernNorthern吸印雜交、吸印雜交、WesternWestern吸印雜交等。吸印雜交等。后三者需要瓊脂糖凝膠電泳與分子雜交相結合的分析后三者需要瓊脂糖凝膠電泳與分子雜交相結合的分析手段。手段。 （1 1）點雜交：）點雜交：將待測將待測DNADNA或或RNARNA或細胞裂解物變性或細胞裂解物變性后直接點在硝酸纖維素膜上，不需限制性酶進行酶后直接點在硝酸纖維素膜上，不需限制

40、性酶進行酶切，即可與探針進行雜交反應。該技術對于基因拷切，即可與探針進行雜交反應。該技術對于基因拷貝數(shù)多的樣品很適合，具有間接快速的特點，一般貝數(shù)多的樣品很適合，具有間接快速的特點，一般可作大批量樣品的篩選?？勺鞔笈繕悠返暮Y選。 （2 2）SouthernSouthern吸印雜交：吸印雜交：是是19751975年由年由SouthernSouthern首首創(chuàng)的，以后又由多人改造，目前被認為是最經(jīng)典和創(chuàng)的，以后又由多人改造，目前被認為是最經(jīng)典和應用最廣泛的雜交力方法。根據(jù)基因探針與待測應用最廣泛的雜交力方法。根據(jù)基因探針與待測DNADNA限制酶的酶解片段雜交帶譜，可以直接確定是限制酶的酶解片段雜

41、交帶譜，可以直接確定是否已經(jīng)轉入受體細胞并接合到受體細胞的基因組中。否已經(jīng)轉入受體細胞并接合到受體細胞的基因組中。 基本原理和操作過程是：提取重組體基本原理和操作過程是：提取重組體DNADNA，限，限制性酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，在堿溶液中制性酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，在堿溶液中使使DNADNA變性即雙鏈變?yōu)閱捂?，再?jīng)毛細管虹吸作變性即雙鏈變?yōu)閱捂湥俳?jīng)毛細管虹吸作用被原位轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將用被原位轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將膜上的膜上的DNADNA烤干，固定后加入雜交液和標記探針烤干，固定后加入雜交液和標記探針進行雜交，洗去多余探針，在進行雜交，洗去多余探針，在X X光底片

42、上放射自光底片上放射自顯影。顯影。 （3 3） NorthernNorthern吸印吸印雜交雜交基本原理與基本原理與SouthernSouthern大致相同，只是檢測的對象不是大致相同，只是檢測的對象不是DNADNA，而是而是RNARNA。具體做法是：提取重組體總具體做法是：提取重組體總RNARNA或或mRNAmRNA，在強變性劑如甲基，在強變性劑如甲基汞或甲醛存在的情況下汞或甲醛存在的情況下( (防止防止RNARNA形成二級結構環(huán)形成二級結構環(huán)) )，進行瓊脂，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后，將電泳分離開的糖凝膠電泳，電泳后，將電泳分離開的RNARNA原位吸印到經(jīng)化學原位吸印到經(jīng)化學處理過的紙或

43、硝酸纖維素膜上，用同位素標記的探針進行雜處理過的紙或硝酸纖維素膜上，用同位素標記的探針進行雜交，然后放射自顯影，根據(jù)交，然后放射自顯影，根據(jù)X X光片上的條帶，可以了解與探針光片上的條帶，可以了解與探針互補的互補的RNARNA的大小及數(shù)量。的大小及數(shù)量。由于由于RNARNA比比DNADNA更易受到各種因素的降解，整個操作過程必更易受到各種因素的降解，整個操作過程必須十分小心，按規(guī)程操作。須十分小心，按規(guī)程操作。對轉基因生物對轉基因生物NorthernNorthern雜交顯示陽性，說明外源基因已經(jīng)雜交顯示陽性，說明外源基因已經(jīng)轉入受體基因組中，并且順利地進行轉錄，形成轉入受體基因組中，并且順利地

44、進行轉錄，形成mRNAmRNA。 （4 4） WesternWestern吸印雜交：吸印雜交：主要用于檢測外源基因在轉化細胞中的表達主要用于檢測外源基因在轉化細胞中的表達情況，即是否進行了翻譯，產(chǎn)生了外源基因所情況，即是否進行了翻譯，產(chǎn)生了外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。編碼的蛋白質(zhì)。具體做法是：提取重組體蛋白質(zhì)，用具體做法是：提取重組體蛋白質(zhì)，用SDS-SDS-聚聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠上原位轉移到硝酸纖維素膜從聚丙烯酰胺凝膠上原位轉移到硝酸纖維素膜上，最后進行抗體與抗原結合反應。上，最后進行抗體與抗原結合反應。 （5 5）原

45、位）原位( (菌落菌落) )雜交技術雜交技術： 是利用核酸雜交原理檢測含有待測是利用核酸雜交原理檢測含有待測DNADNA序列的重序列的重組分子。組分子。在許多情況下，含有理想重組體的細菌往往混在許多情況下，含有理想重組體的細菌往往混雜在含有其他重組分子的細菌之中，當理想重組雜在含有其他重組分子的細菌之中，當理想重組體的存在無法用遺傳方法檢測時，必須考慮其他體的存在無法用遺傳方法檢測時，必須考慮其他篩選方法，原位篩選方法，原位( (菌落菌落) )雜交法是最常用的方法之雜交法是最常用的方法之一。一。 大致過程：先通過一定方法，讓菌落轉移到一大致過程：先通過一定方法，讓菌落轉移到一種支撐膜上，如硝酸

46、纖維素濾膜，然后裂解膜上種支撐膜上，如硝酸纖維素濾膜，然后裂解膜上的細菌，使的細菌，使DNADNA變性并原位結合在濾膜上，將帶變性并原位結合在濾膜上，將帶有有DNADNA印跡的濾膜與放射性標記的印跡的濾膜與放射性標記的RNARNA或或DNADNA探針探針雜交。在雜交后，先洗未雜交的探針，再進行放雜交。在雜交后，先洗未雜交的探針，再進行放射性自顯影，與探針有同源性的射性自顯影，與探針有同源性的DNADNA印跡將會顯印跡將會顯露在露在X X光片上。顯然，提供這種光片上。顯然，提供這種DNADNA的菌落包含著的菌落包含著理想的理想的DNADNA序列，可從主盤中找到那個相應的菌序列，可從主盤中找到那個

47、相應的菌落。落。 第六節(jié) 反義基因技術 一、反義基因技術的基本概念和原理 反義反義RNA(antisenseRNA)RNA(antisenseRNA)：有義：有義DNADNA鏈轉錄成的、鏈轉錄成的、與特異的靶與特異的靶RNARNA互補結合并能抑制靶互補結合并能抑制靶RNARNA表達的一表達的一段序列。段序列。反反義是一類能與特異互補的小分義是一類能與特異互補的小分子量、可擴散的轉錄物，它子量、可擴散的轉錄物，它能夠從翻譯水能夠從翻譯水平、轉錄水平和核酸復制水平上高度特異地抑制平、轉錄水平和核酸復制水平上高度特異地抑制靶基因表達。靶基因表達。轉錄產(chǎn)生反義轉錄產(chǎn)生反義RNARNA的基因稱之為反義基

48、因。的基因稱之為反義基因。反義反義RNARNA技術：指把一段技術：指把一段DNADNA序列以反義方向插序列以反義方向插入到合適的啟動子和終止子之間，然后把此基入到合適的啟動子和終止子之間，然后把此基因構建體轉化到受體細胞中去因構建體轉化到受體細胞中去( (通常用農(nóng)桿菌轉通常用農(nóng)桿菌轉化的方法化的方法) )，通過選擇培養(yǎng)獲得轉化生物體的技，通過選擇培養(yǎng)獲得轉化生物體的技術。術。 。 反義基因的表達載體構建方法：第一步，分離得到的第一步，分離得到的mRNAmRNA為模板，合成反義為模板，合成反義DNADNA；第二步，以此反義鏈為模板合成有義第二步，以此反義鏈為模板合成有義DNADNA鏈；鏈；第三步

49、，以細菌質(zhì)粒第三步，以細菌質(zhì)粒(DNA)(DNA)為載體，用限制性內(nèi)為載體，用限制性內(nèi)切酶在靠近啟動子處切割一缺口；切酶在靠近啟動子處切割一缺口；第四步，將有義第四步，將有義DNADNA插入表達載體的缺口中，即插入表達載體的缺口中，即得到一表達質(zhì)粒，如果啟動子開始轉錄，表達載得到一表達質(zhì)粒，如果啟動子開始轉錄，表達載體即轉錄原來的體即轉錄原來的mRNAmRNA；如果將插入的表達載體用；如果將插入的表達載體用限制性內(nèi)切酶切割后，以相反的方向插入載體限制性內(nèi)切酶切割后，以相反的方向插入載體DNADNA環(huán)中，即表達載體轉錄形成反義環(huán)中，即表達載體轉錄形成反義RNARNA。 二、 反義基因技術的特點

50、1 1、反義、反義RNARNA可以高度專一地調(diào)節(jié)某一特定基因可以高度專一地調(diào)節(jié)某一特定基因的表達，不影響其他基因的表達。的表達，不影響其他基因的表達。 2 2、轉化到植物中的反義、轉化到植物中的反義RNARNA的作用類似于遺傳的作用類似于遺傳上的缺陷型，表現(xiàn)為顯性。所以被轉化的植物上的缺陷型，表現(xiàn)為顯性。所以被轉化的植物材料不必為純合體就可表現(xiàn)相應的性狀，從而材料不必為純合體就可表現(xiàn)相應的性狀，從而避免了二倍體內(nèi)等位基因的顯隱性干擾。避免了二倍體內(nèi)等位基因的顯隱性干擾。 3 3、反義基因整合到植物的基因組中可獨立表、反義基因整合到植物的基因組中可獨立表達和穩(wěn)定遺傳，后代符合孟德爾遺傳規(guī)律。達和

51、穩(wěn)定遺傳，后代符合孟德爾遺傳規(guī)律。 4 4、反義基因不必了解其目的基因所編碼的蛋、反義基因不必了解其目的基因所編碼的蛋白質(zhì)結構，可省去對基因產(chǎn)物的研究工作。白質(zhì)結構，可省去對基因產(chǎn)物的研究工作。 5 5、反義基因不改變目的基因的結構，在應用、反義基因不改變目的基因的結構，在應用上更加安全。上更加安全。 三、 反義基因技術的應用 世界上第一個基因工程商業(yè)化園藝產(chǎn)品，世界上第一個基因工程商業(yè)化園藝產(chǎn)品，就是利用反義基因技術將反義就是利用反義基因技術將反義PGPG基因轉入番基因轉入番茄得到的耐貯運的番茄。茄得到的耐貯運的番茄。 以反義PG番茄為例，介紹其培育過程： 首先，通過一定的方法如反轉錄方法、

52、化學首先，通過一定的方法如反轉錄方法、化學合成方法或者篩選基因文庫等方法得到目的合成方法或者篩選基因文庫等方法得到目的基因基因PGPG。 第二步，構建反義第二步，構建反義PGPG基因重組子，即基因重組子，即PGPG基因反基因反向構建到適宜的載體上，如農(nóng)桿菌向構建到適宜的載體上，如農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒。或質(zhì)粒。或者需要通過一個中間載體如大腸桿菌質(zhì)粒再轉者需要通過一個中間載體如大腸桿菌質(zhì)粒再轉移到農(nóng)桿菌移到農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒上。利用載體本身所帶的抗質(zhì)粒上。利用載體本身所帶的抗生素基因對構建后的重組子進行篩選，然后進生素基因對構建后的重組子進行篩選，然后進一步鑒定。一步鑒定。 第三步，利用攜帶反義第三

53、步，利用攜帶反義PGPG基因的農(nóng)桿菌基因的農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)質(zhì)粒，通過葉盤法進行轉化番茄子葉或者下胚粒，通過葉盤法進行轉化番茄子葉或者下胚軸。軸。 第四步，被轉化的番茄子葉或者下胚軸在含第四步，被轉化的番茄子葉或者下胚軸在含有一定濃度的抗生素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)歷愈傷有一定濃度的抗生素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)歷愈傷組織形成、發(fā)芽、生根等過程，逐漸形成一顆組織形成、發(fā)芽、生根等過程，逐漸形成一顆完整植株。完整植株。 第五步，對再生植株進行鑒定，如點雜交、第五步，對再生植株進行鑒定，如點雜交、SouthernSouthern雜交、雜交、NorthernNorthern雜交和性狀觀察等，雜交和性狀觀察等，檢測外源

54、基因是否已經(jīng)轉錄、翻譯和表達等。檢測外源基因是否已經(jīng)轉錄、翻譯和表達等。 第六步，對正確表達目的基因的植株進行選第六步，對正確表達目的基因的植株進行選育，獲得純合體后代，通過安全評價程序，育，獲得純合體后代，通過安全評價程序，進行田間釋放、中試和商業(yè)化生產(chǎn)。進行田間釋放、中試和商業(yè)化生產(chǎn)。 通常，我們把插入到載體內(nèi)的非自身的通常，我們把插入到載體內(nèi)的非自身的DNADNA片段稱為片段稱為“外源基因外源基因”(foreign gene)(foreign gene)。 目的基因目的基因(objective gene)(objective gene)：又叫靶基：又叫靶基因因(target gene)(

55、target gene)，是指根據(jù)基因工程的目是指根據(jù)基因工程的目的的, ,設計的所需要的某些設計的所需要的某些DNADNA分子片段，它含分子片段，它含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼有一種或幾種遺傳信息的全套密碼(code) (code) 化學合成法的最大優(yōu)點是能按照人們的意愿合化學合成法的最大優(yōu)點是能按照人們的意愿合成突變基因。但有局限性，要合成較長鏈的成突變基因。但有局限性，要合成較長鏈的 DNADNA分分子尚有困難子尚有困難。 隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，基因工程操作儀器隨著現(xiàn)代科學技術的發(fā)展，基因工程操作儀器設備也不斷更新。如日本設備也不斷更新。如日本ZeonZeon公司已成功制成并出公司已成功制成并出售售“全自動全自動DNADNA合成儀合成儀” ，精工電子工業(yè)公司的，精工電子工業(yè)公司的“ DNADNA序列儀序列儀”。 目前單鏈目前單鏈DNADNA短片段的合成已經(jīng)成為分子生物短片段的合成已經(jīng)成為分子生物學和生物技術實驗室的常規(guī)技術了。學和生物技術實驗室的常規(guī)技術了。 3.3.自動化測序法 ProberProber等等19871