sanger測序培訓(xùn)最終精講

1、sanger測序-基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司Shanghai Genechem Co., Ltd.曹尚志曹尚志sanger測序原理?雙脫氧末端終止法?引物設(shè)計(jì)?實(shí)驗(yàn)流程?上機(jī)測序Sanger測序的基本流程測序結(jié)果的分析?怎樣分析結(jié)果?問題峰圖分析一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法53ddNTP 被加到正在合成的鏈上，由于它的3-OH 已被氧化，下一個(gè)dNTP的5- 磷酸基團(tuán)不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止。在引物等延伸反應(yīng)過程中，ddNTP 在不同位置摻入，產(chǎn)生了一系列不同長度的新的DNA 片段。53一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法二、Sanger測序的實(shí)驗(yàn)基

2、本流程（以MTHFR(RS1801133) 檢測為例）1.根據(jù)rs號得到位點(diǎn)信息及目標(biāo)序列2.引物設(shè)計(jì)3.測序PCR模板的制備4. 測序樣品的制備5.上機(jī)測序1.根據(jù)rs號得到位點(diǎn)信息及目標(biāo)序列2.引物設(shè)計(jì)2.1 primer primer 5.0+2.引物設(shè)計(jì)2.2 引物特異性檢查2.3 設(shè)計(jì)引物還需注意引物純度（引物純度（PAGE純化方式）純化方式）不能使用兼并引物測序不能使用兼并引物測序測序引物位置距離位點(diǎn)最多測序引物位置距離位點(diǎn)最多600bp，至少，至少50bp避免熒光標(biāo)記避免熒光標(biāo)記測序引物長度測序引物長度16-25bp，TM值值50-65為宜為宜,55最佳測序引物位置避免測序引物位

3、置避免Poly（A.T）和高）和高GC結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)3.測序PCR模板的制備稀釋引物稀釋引物根據(jù)合成回來的引物濃度稀釋，一般工作液10umol/ul(4 保存)，母液100umol/ul（-20保存）3.1 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)方案1.PCR擴(kuò)增三步法：變性 -退火-延伸2.退火溫度： (Ftm+Rtm)/2-53.延伸時(shí)間： 1kb=1minpcr儀擴(kuò)增儀擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計(jì)好的參數(shù)，設(shè)置使用 PCR儀器擴(kuò)增.?3.2 PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物純化純化的意義純化的意義去除去除PCR反應(yīng)液的反應(yīng)液的殘留殘留1.殘留的引物：保證引物特異性，避免多重測序殘留的引物：保證引物特異性，避免多重測序2.殘留的殘留的d

4、NTP:以保持以保持dNTPs / ddNTPs的最佳的最佳比例比例3.鹽成分：避免抑制測序酶活性鹽成分：避免抑制測序酶活性4.非特異非特異PCR產(chǎn)物：避免擴(kuò)增出同源性區(qū)域產(chǎn)物：避免擴(kuò)增出同源性區(qū)域依賴于依賴于純化（試劑盒）純化（試劑盒）方式選擇方式選擇?PCR 反應(yīng)的優(yōu)化程反應(yīng)的優(yōu)化程?PCR 產(chǎn)物的質(zhì)量產(chǎn)物的質(zhì)量選擇最佳的純化方法選擇最佳的純化方法1.柱純化：用于特異柱純化：用于特異PCR產(chǎn)物純化或存在產(chǎn)物純化或存在100bp的非特異產(chǎn)物的純化的非特異產(chǎn)物的純化 (如：引物二聚體如：引物二聚體)2.切膠回收：可用于任何質(zhì)量的切膠回收：可用于任何質(zhì)量的PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物純化切下條帶，去除非特

5、異切下條帶，去除非特異PCR產(chǎn)物和引物二聚體產(chǎn)物和引物二聚體4.測序樣品制備測序測序PCR測序產(chǎn)物測序產(chǎn)物純化純化測序PCR（以回收PCR產(chǎn)物為模板）：96 1 min -(96 10 sec -50 5 sec - 60 4 min) x 25循環(huán)-4 保溫酒精/EDTA/NaAc法：?去除殘留的BigDye Terminator(染料峰)?測序產(chǎn)物脫鹽? 純化好的測序產(chǎn)物比較穩(wěn)定測序測序PCR與普通與普通PCR的區(qū)別的區(qū)別5. 上機(jī)測序5.1 測序樣品變性測序樣品變性pcr擴(kuò)增儀器中擴(kuò)增儀器中95變性變性4min4min。.5.2 上機(jī)操作上機(jī)操作三、 測序結(jié)果分析怎樣怎樣看測序結(jié)果看測序

6、結(jié)果怎樣得到位點(diǎn)基因型怎樣得到位點(diǎn)基因型常見峰圖介紹常見峰圖介紹保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性1.怎么看峰圖（分析軟件Sequence Analysis）峰圖判斷三要素：電泳圖(Electropherogram)、峰圖(Raw)、QV值電泳圖/QV值 峰圖Raw：峰圖Electropherogram：電泳圖QV值QV值越高，讀圖越準(zhǔn)確。QV值為藍(lán)色，表示可信。QV值為黃色，表示不準(zhǔn)確，需要人工判讀。QV值為紅色，表示不可信QV值2.怎樣得到位點(diǎn)基因型（分析軟件Chromas）根據(jù)得到位點(diǎn)信息，將位點(diǎn)3 保守序列（10個(gè)堿基左右），在軟件中Chromas查找，前面即為突變基因型。PS:

7、如果是反向引物測序需要將測序結(jié)果反向互補(bǔ)3.常見峰圖介紹及分析?正常及無信號、信號弱測序峰圖?樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖?測序儀器影響及測序峰圖?純化因素影響及測序峰圖?引物質(zhì)量影響及測序峰圖正常峰圖（有完整峰型、單一峰尖銳獨(dú)立、QV值基本上為藍(lán)色)Raw：Electropherogram：無信號（無完整峰型、無信號或信號值較低、峰圖雜亂無章、絕大部分不可信）Raw：Electropherogram：信號弱（有較完整峰型、信號值較低、峰圖部分可信）Raw：Electropherogram：3.常見峰圖介紹及分析?正常及無信號測序峰圖?樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖?測序儀器影響及測序峰圖?純化因素

8、影響及測序峰圖?引物質(zhì)量影響及測序峰圖poly（A、T）結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后雙峰Raw：Electropherogram：返回測序信號中斷（二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致）Raw：Electropherogram：返回序列結(jié)構(gòu)高GC導(dǎo)致信號衰減Raw：Electropherogram：返回3.常見峰圖介紹及分析?正常及無信號測序峰圖?樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖?測序儀器影響及測序峰圖?純化因素影響及測序峰圖?引物質(zhì)量影響及測序峰圖峰圖出現(xiàn)斷層（可先重跑看是否解決，需要換Buffer）Raw：Electropherogram（電泳圖、QV正常）毛細(xì)管堵塞導(dǎo)致拖尾（可先重跑看是否解決，或者清理毛細(xì)管）Raw：Electropherogram（展開圖正常）毛細(xì)管堵塞導(dǎo)致寬峰（可先重跑看是否解決，或者清理毛細(xì)管）Raw：Electropherogram：3.常見峰圖介紹及分析?正常及無信號測序峰圖?樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖?測序儀器影響及測序峰圖?純化因素影響及測序峰圖?引物質(zhì)量影響及測序峰圖染料峰（純化操作不規(guī)范或者ddntp過量）Raw：Electropherogram：返回3.常見峰圖介紹及分析?